一种适合于中国被毛孢Hirsutellasinensis等真菌遗传转化克隆的载体及其构建方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种适合于中国被毛孢hirsutellasinensis等真菌遗传转化克隆的载体及其构建方法。

背景技术：

冬虫夏草是一种独特的中草药，自15世纪藏医籍《千万舍利》记载以来，后续《本草纲目》等诸多文献均记载它具有奇特的功效，其市场需求量大，而且由于特定的生长环境以及近几年的疯狂采集，其产量大幅减少，已濒临灭绝的危险，已成为一种珍稀资源。因此，人工培育冬虫夏草非常重要。但是，由于冬虫夏草形成的过程及其机制都非常复杂，虽然近年来许多科研单位、高等院校、企业以及个人投入了大量的人力、物力进行相关的研究，取得了一定的成绩，但尚未得到实质性的突破。

中国被毛孢(hirsutellasinensis)是公认的冬虫夏草无性型。真实了解这种虫生真菌在寄主—蝙蝠蛾幼虫体内生长与繁殖、发育与分化的过程是冬虫夏草研究或人工培育冬虫夏草产业化的关键。然而，由于工具所限，目前中国被毛孢hirsutellasinensis的研究大多仅限于外部形态的观察，进展非常缓慢。

egfp是一种增强型绿色荧光蛋白，这种蛋白分子量小、在生物体内可以表达稳定、而且无毒、通常不影响生物自身的生长与繁殖、发育与分化，它可以作为生物标记，用于研究目标生物体的生长发育状况。

但是，目前未见egfp基因成功导入中国被毛孢hirsutellasinensis并稳定表达的报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组质粒及其制备方法和应用。

本发明重组质粒prf-aeth，它是将质粒prfhue-egfp中的启动子pgpda、trpc分别替换为虫生真菌启动子pat和ptrpc的质粒。

其中，所述虫生真菌启动子pat的序列如seqidno：1所示。

其中，所述虫生真菌启动子trpc的序列如seqidno：2所示。

本发明还提供了制备前述重组质粒的方法，步骤如下：

(1)载体prfhue-egfp线性化处理，采用限制性内切酶apai及smai对已有双元载体进行双酶切；

(2)以虫生真菌启动子pat替换载体上的启动子pgpda；

(3)在载体的trpc3’位置引入酶切位点hpai；

(4)对载体再次进行线性化处理；

(5)以虫生真菌ptrpc启动子替换载体上的trpc启动子，即可。

本发明还提供了前述重组质粒在制备稳定表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢hirsutellasinensis中的应用。

本发明还提供了一种工程菌，它是包含前述重组质粒的转化菌株或者工程菌。

其中，所述工程菌是重组根癌农杆菌。

其中，所述重组根癌农杆菌是根癌农杆菌agl-1/pre-aeth。

其中，所述重组根癌农杆菌是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为cctccno：m2016223的根癌农杆菌agl-1/prf-aethagrobacteriumtumefaciensagl-1/prf-aeth。本发明工程菌根癌农杆菌agl-1/prf-aethagrobacteriumtumefaciensagl-1/prf-aeth，于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为：cctccm2016223。

本发明还提供了制备前述工程菌的方法，步骤如下：取根癌农杆菌，制备其感受态细胞，取前述重组质粒，共培养，即可。

本发明还提供了前述工程菌在制备稳定表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢hirsutellasinensis中的应用。

质粒prfhue-egfp是一个含有增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因的载体，egfp及hph的启动子均来源于构巢曲霉(aspergillusnidulans)；其中egfp启动子为3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pgpda)，hph的启动子为色氨酸合酶启动子(trpc)。发明人用该质粒，在根癌农杆菌的介导下成功地转化了青霉菌等真菌,并获得绿色荧光强、遗传稳定的阳性转化子。但是，采用该质粒转化中国被毛孢hirsutellasinensis却未能获得成功。

基于此，发明人根据多年的实践经验，对质粒prfhue-egfp进行了改进，得到了本发明特定的重组质粒prf-aeth，并进一步获得了包含该质粒的根癌农杆菌，包含该质粒的根癌农杆菌可以有效转化中国被毛孢hirsutellasinensis，获得了绿色荧光强、遗传稳定的阳性转化子。

本发明重组质粒prf-aeth以及工程菌根癌农杆菌agl-1/prf-aeth，可以转化中国被毛孢hirsutellasinensis，获得稳定表达egfp基因的中国被毛孢hirsutellasinensis，可以用于中国被毛孢hirsutellasinensis生长与繁殖、发育与分化过程的研究，为冬虫夏草的人工栽培提供技术支持，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1pat和ptrpcpcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图maker:2000dnamaker；pat和ptrpc分别为虫生真菌at蛋白强启动子pat和ptrpc的pcr产物；

图2原有质粒prfhue-egfp(-)经apai和smai双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，maker-1和maker-2分别为15000和2000dnamaker；rfhue-egfp(-)为质粒双酶切后质粒名称；

图3克隆载体改造对比图谱。a,已有质粒prfhue-egfp；b,改造的克隆载体prf-aeth；an,来源于构巢曲霉(aspergillusnidulans)；ef,来源于虫生真菌(entomogenousfungi)；

图4表达载体prf-aeth转化根癌农杆菌agl-1感受态细胞后菌液。pcr鉴定阳性克隆的电泳结果；

图5中国被毛孢hirsutellasinensis转化菌株h.sinensisaeth-t55在可见光和蓝光激发下的形态。

具体实施方式

premixtaqtm购于宝生物工程(大连)有限公司；

重组反应试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司；

所用试剂购于奥克生物技术有限公司；

质粒prfhue-egfp，来自西班牙dr.l.gonzález-candelas按照文章a.crespo-sempereetal.,“developmentofagreenfluorescenttaggedstrainofaspergilluscarbonariustomonitorfungalcolonizationingrapes”,internationaljournaloffoodmicrobiology148(2011)135–140的方法制备；

根癌农杆菌agl-1，购买于北京华越洋生物科技有限公司；

中国被毛孢hirsutellasinensis，来自成都图径生物科技有限公司。

实施例1本发明重组质粒的构建

一、启动子pat和ptrpc全长的克隆

按以下步骤进行：

(1)根据虫生真菌基因组信息，首先找到pat和ptrpc基因序列信息，然后在at蛋白和trpc基因的前端找到其启动子序列信息；

(2)根据在虫生真菌基因组中找到的启动子序列信息，设计相应的扩增启动子特异性引物：

pat-f：gttgagtttgttgattgcaat

pat-r：aaccgtatacgattctagct

ptrpc-f：acgtcaacgatacgtgctaac

ptrpc-r：caagctttctagtgcacctacg

采用ctab法提取虫生真菌总dna，使用premixtaq^tm进行pcr扩增启动子pat、ptrpc片段。pcr反应体积20μl，其中mix10μl，正向引物1μl，反向引物1μl，dna模板1μl，ddh2o7μl。pcr反应程序如下：

表1启动子pat、ptrpcpcr扩增程序

pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，电泳图如图1所示。将回收得到的产物进行测序，再将测定的序列与基因组中的序列进行比对分析，确认测定的序列与目的基因序列完全一致；再以此pcr产物进行下一步的研究；

根据启动子pat和ptrpc的全序列、启动子重组到载体上的相应位置及其方向设计含有载体部分序列的接头引物(下列加粗标记并下标横线的序列)；

pat-1f:ccattaagtcctcagcaaccgtatacgattctagct

pat-1r:cctgatcatcgatcccggggttgagtttgttgattgcaat

ptrpc-2f:gtatcgtctcgcacccacgtcaacgatacgtgctaac

ptrpc-2r:caggctttttcatgttcaagctttctagtgcacctacg

以步骤(2)中测序正确的pat和ptrpc片段作为模板，以含有载体接头序列的启动子特异性引物扩增含有载体接头序列的pat、ptrpc片段，pcr反应程序如下：

表2含有载体接头序列的启动子pat和ptrpcpcr扩增程序

二、载体启动子改造与替换

按以下步骤进行：

(1)原始质粒prfhue-egfp线性化。将原有质粒通过限制性内切酶apai和smai进行双酶切后形成粘性末端，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，电泳图如图2所示，并用胶回收试剂盒收集酶切产物；回收的产物保存于-20℃冰箱，待用；

(2)质粒第一轮改造。将来源于构巢曲霉egfp的启动子pgpda更换为来源于虫生真菌at蛋白启动子pat,将插入片段与线性化的已有质粒dna以一定的配比进行同源重组。

prfhue-egfp线性化克隆载体最适使用量：0.02×9429(9,429bp)≈188.58ng

插入片段pcr产物(启动子pat)最适使用量：0.04×949(949bp)≈37.96ng

表3反应体系配制及重组反应

*阴性对照以用确认线性化克隆载体和插入片段扩增产物有无残留的环状质粒。

使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分；将反应管置37℃反应30min；反应完成后立即将反应管冰浴5min。

重组反应产物的转化与培养及阳性转化子筛选。

(3)设计引物，扩增经第一轮改造后的质粒(含hpai酶切位点,此质粒命名为：prf-at-egfp；

(4)扩增的第一轮改造质粒再次线性化。将质粒prf-at-egfp经限制性内切酶hpai、smai进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收试剂盒收集酶切产物；收集的产物保存于‐20℃冰箱，待用；

(5)质粒的第二轮改造。将第一轮改造的质粒中来源于构巢曲霉hph基因启动子trpc更换为来源于虫生真菌的启动子trpc,将插入片段与线性化质粒以一定的配比进行同源重组反应。

线性化质粒prf-at-egfp最适使用量：0.02×8078(8078bp)≈161.56ng；

插入片段pcr产物(启动子ptrpc)最适使用量：0.04×1062(1062bp)≈42.48ng

表4反应体系配制及重组反应

*阴性对照反应用以确认线性化克隆载体和插入片段扩增产物有无残留的环状质粒。

使用移液器上下吹打数次，轻轻地混匀后置37℃反应30min。反应完成后将反应管取出迅速转入冰水中，静置5min。

将重组反应产物进行转化、涂布平板，置37℃培养。

克隆鉴定。采用菌落pcr的方法。采用一条通用测序引物进行菌落pcr，这样可以避免pcr假阳性的产生。

(6)经两轮改造成功的质粒命名为prf-aeth(egfp启动子为pat，hph启动子为ptrpc)。

改造后的质粒prf-aeth(b)与原质粒(a)的对比图如图3所示，二者仅两个启动子不同，具体是用pat(ef)替代了pgpda(an)，用ptrpc(ef)替代了trpc(an)，其中，pat(ef)与ptrpc(ef)的核苷酸序列分别如seqidno：1和2所示。

实施例2本发明工程菌的构建

(1)根癌农杆菌感受态细胞的制备及载体转化

挑取根癌农杆菌agl-1单菌落，接种于5mllb(含rif20μg/ml)液体培养基中，28℃，200r/min震荡培养15h。

将2ml过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的lb培养基中，28℃，200r/min振荡3.5h，至od600≈0.6～0.7；吸取菌液于50ml预冷的离心管中，冰浴10min；4℃，5000r/min离心10min，弃上清液；缓慢加入10ml预冷的100mmcacl2溶液，使农杆菌细胞轻轻悬浮，冰浴30min；4℃，5000r/min离心10min，弃上清液，置于冰上加入2ml预冷的含15％甘油的100mmcacl2溶液，充分悬浮细胞；按每管200μl分装于无菌离心管中，于-80℃保存。

取1μg实施例1制备的载体prf-aeth(重组质粒prf-aeth)，加入感受态细胞中，冰浴30min；放入液氮中速冻5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min，冰上静置5min；加入800μllb液体培养基，28℃，180r/min振荡培养4h；5000r/min离心1min，去部分上清，留100μl菌液涂布于含有50μg/mlkan和20μg/mlrif的lb平板上，28℃培养箱中倒置培养，2天左右转化菌落可见。

挑选单克隆菌液pcr验证，验证结果见附图4，经验证含有目标载体的农杆菌加25％甘油保存于-80℃。所述lb固体培养基配方(1l)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g、加水补充至1l，ph7.0；所述lb液体培养基不加琼脂即可。

取含有目标载体的根癌农杆菌，命名为根癌农杆菌agl-1/prf-aeth，并于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccm2016223。

以下用实验例的方式来验证本发明的有益效果：

实验例1采用质粒prf-aeth转化中国被毛孢hirsutellasinensis

一、根癌农杆菌介导遗传转化中国被毛孢hirsutellasinensis的方法

(1)根癌农杆菌的预诱导

根癌农杆菌agl-1/prf-aeth划线接种，28℃培养2d，用无菌的枪头挑取单克隆接种至10ml液体lb培养基中于28℃，200r/min培养15h。

过夜培养的农杆菌分别离心、弃上清，等体积的im培养基重悬两次，然后调节农杆菌浓度至od600≈0.15～0.20，加入as(乙酰丁香酮)至终浓度为200μm。28℃，200r/min继续培养6h后至od600≈0.6～0.7可用于根癌农杆菌和中国被毛孢hirsutellasinensis的共培养转化。im培养基配方：10mmglucose、0.6mmcacl2、9μmfeso4、50％甘油(v/v)、40mmmes(2-吗啉乙磺酸)(ph5.3)、4mm(nh4)2so4、2mmmgso4、2.5mmnacl、10mmk2hpo4和10mmkh2po4(ph4.8)。

(2)含质粒prf-aeth的根癌农杆菌和中国被毛孢hirsutellasinensis共培养转化

将中国被毛孢hirsutellasinensis的菌丝用分散头打散后接入产孢液体培养基，18℃，130r/min培养14d后用一层尼龙膜(150目)过滤菌丝收集得到芽生孢子，im培养基重悬三次后血球计数板计数，浓度调整在10⁵个/ml左右备用。实验采用固相共培养的方式，即将100μl根癌农杆菌与100μl准备好的中国被毛孢hirsutellasinensis芽生孢子混合后涂布到铺有微孔滤膜的im平板上，18℃正置避光共培养4d；

然后固相共培养至指定时间后将微孔滤膜分别倒置贴附于筛选平板上，18℃培养30d左右可以观察到单个疑似转化子出现。im平板配方：5mmglucose、0.6mmcacl2、9μmfeso4、0.5％甘油(w/v)、40mmmes(2-吗啉乙磺酸)(ph5.3)、4mm(nh4)2so4、2mmmgso4、2.5mmnacl、10mmk2hpo4和10mmkh2po4(ph4.8)、200μm乙酰丁香酮和15g/l琼脂；筛选固体培养基配方(1l)：马铃薯200g、葡糖糖50g、蛋白胨10g、酵母粉1g、kh2po41g、mgso40.5g、琼脂10g、潮霉素b200mg和头孢霉素200mg，加水补充至1l，ph7.0。

二、鉴定

(1)转化子镜检观察和分离纯化

将此单个疑似转化子挑取置于无菌水中，用枪头打散后取部分菌丝镜检观察发现其中100余株有绿色荧光，其中得到了绿色荧光强烈，而且荧光特性稳定的菌株。此绿色荧光转化子在可见光和蓝光(488nm)激发下的镜检结果见图5。

实验结果证明，采用本发明重组质粒prf-aeth以及工程菌根癌农杆菌agl-1/prf-aeth可以转化中国被毛孢hirsutellasinensis，获得稳定表达egfp基因的中国被毛孢hirsutellasinensis。

综上，本发明重组质粒prf-aeth以及工程菌根癌农杆菌agl-1/prf-aeth，在农杆菌介导下可以转化中国被毛孢hirsutellasinensis，获得稳定表达egfp基因的中国被毛孢hirsutellasinensis，可以用于中国被毛孢hirsutellasinensis生长与繁殖、发育与分化过程的研究，为冬虫夏草的人工栽培提供支持，具有很好的应用前景。