一种PHA合酶和编码基因及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种pha合酶的基因序列及其制备方法。本发明提供了该pha合酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在合成聚羟基脂肪酸酯(pha)方面的应用。本发明提供的pha合酶可广泛应用于农业、食品、医药及环保等领域。

背景技术：

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，缩写为phas)是微生物合成的一类聚酯(phb是pha的一种)，由于其具有优良性质，如生物可降解性、生物相容性和光学性能等，有很广泛的用途。生物可降解性和热加工性使得其可制作塑料袋，农用地膜及农用除草剂、杀虫剂、肥料的载体，提高它们的利用效率而不会产生环境污染。生物相容性使得其可用作医用植入材料，药物载体，可调节药物的释放速率。手性药物：其手性单体(r型)可以作为手性药物或者手性药物合成的中间体。良好的气体相隔性使得其可用作食品等的包装材料。此外pha还可用于生产生物能源，具有可燃性，经甲酯化处理以后，可直接作为生物燃料，只比柴油的燃烧热低15％左右。由于其具有这些优良特性，所以现已吸引了科技界和工业界的广泛兴趣。

pha合酶(phac)是pha合成代谢途径中的一个关键酶，在ralstoniaeutropha中的这个酶研究较为详细，测定了酶活以及动力学特性，确定了活性中心以及做过定点突变等工作，将该酶与其它两个酶一起在大肠杆菌或者毕赤酵母中构建了pha代谢途径，产量也比较高，还通过添加不同底物的方式改变pha的组成特性以生产具有某些特殊性能的pha，在ralstoniaeutropha中，基本上相关的方面都已经研究过了，但是在methylobacterium菌属中只是确认了在该菌属中存在着这种酶，没有异源表达，也没有详细的测过酶活以及动力学特性。由于有机试剂对很多酶有较强的抑制作用，容易使酶的高级结构发生变化而变性失活，而methylobacterium可以在甲醇培养液中生长，所以来源于methylobacterium中的该酶应该对对机试剂具有一定的耐受性，这也是其它来源的这个酶可能不具有的特性。我们研究了在methylobacteriumsp.中该酶的活力大小以及动力学特性，更好地认识和利用了该酶。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种新型的pha合酶phac及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型pha合酶phac的方 法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的pha合酶phac基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型pha合酶phac在合成pha中的应用。

本发明所提供的pha合酶phac，来源于土壤中甲基杆菌属(methylobacteriumsp.在中国北纳菌种保藏中心的资源编号为：bncc195932)，从中扩增出的pha合酶phac编码基因(命名为phac)，具有下述核苷酸序列特征之一：

1)序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；

2)编码序列表中seqidno.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；

3)与seqidno.1限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码pha合酶活性蛋白质的脱氧核糖核酸(dna)序列。

4)对序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有pha合酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了pha合酶phac的氨基酸序列，具有如下特征之一：

1)序列表中的seqidno.2从氨基端开始的第1-607为具有活性phac的氨基酸序列，607-613为his-tag的氨基酸序列。

2)将序列表中的seqidno.2从氨基端开始的第1-607位氨基酸残基进行一个或多个氨基酸取代、缺失或添加而形成具有pha合酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的pha合酶phac的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的phac的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶phac的方法，是将编码基因phac克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的pha合酶。

所述的重组表达pha合酶phac的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达pha合酶phac的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如escherichiacolibl21、escherichiacolijm109、escherichiacolidh5α等)、酵母菌宿主细胞(如saccharomycescerevisiae、pichiapastoris、kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主 细胞(如bacillussubtilisr25、bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如lacticacidbacteriacocc101等)、放线菌宿主细胞(如streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如trichodermaviride，trichodermareesei，aspergillusniger、aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如bombyxmori，antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞cho，幼小仓鼠肾脏细胞bhk、中国仓鼠肺细胞chl等)。

本发明的pha合酶phac的基因序列是通过pcr技术从甲基杆菌属(methylobacteriumsp.)中克隆得到。该基因编码区长1824bp，属于phac-n超家族。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的pha合酶phac，以r-3-羟基丁酰辅酶a为底物时，在28℃、ph8.1的条件下测得比活为0.5-1000u/mg。

本发明的pha合酶phac可广泛应用农业、食品包装材料、医药及环保等领域。

附图说明

图1：基因phac琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：phac纯化的sds-page图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-预染蛋白分子量标准；泳道5-phac纯化蛋白。

图3：气相检测phb。

具体实施方式

实施例1pha合酶全长基因克隆

参照基因组dna纯化试剂盒(thermo公司)操作步骤提取methylobacteriumsp.(methylobacteriumsp.在中国北纳菌种保藏中心的资源编号为：bncc195932)的基因组dna。对thenationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)数据库中硫解基因序列进行多序列比对分析后，设计引物phac-f:5’atatatccatggccacggagcggacgggcccggca-3’；phac-r:5’-cgctgactcgagcgccttcatgcgcacataggtgcccg-3’，以提取的sp.的基因组dna为模板，扩增编码pha合酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。pcr反应条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃3min，1个循环。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的片段进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pet28a上后测序。

实施例2pha合酶基因序列分析

测序的结果采用genbank数据库中的basiclocalalignmentsearchtool(blast)分析，vectorntisuite8.0软件进行多序列比对，分析序列信息。

获得的pha合酶基因(命名为phac)编码区长1824bp，其核苷酸序列如seqidno1所示。phac基因编码607个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如seqidno2所示，蛋白质理论分子量为67278.6，等电点为5.98，带负电荷的氨基酸残基(asp+glu)有71个，带正电荷的氨基酸残基(arg+lys)有64个，酸性氨基酸有71个，占11.7％，碱性氨基酸有64个，占10.54％，极性氨基酸有134个，占22.08％，疏水性氨基酸有226个，占37.23％，分子式为c3019h4686n824o882s20，在体外的半衰期为30个小时，不稳定性指数为40.39，属于不稳定蛋白。

序列表

(1)seqidno.1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：1842碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cdna

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：methylobacteriumsp.菌株。

seqidno.1

atggccacggagcggacgggcccggcagcaccggatttcgagaccatcgcgcgcaacgcgaatcaactggcggaggcgttccggcaatcggcggcggcctcgctcaagccgttcgacccggcggggcaggggaccggtctgccgaccgccaagctccagggctccgacgagatcgacgagatgacccgcacgctgacgcgggtcgccgagacatggttgaaggatcccgagaaggcgctccaggcccagaccaagctcacacactccttcgccgcgctgtgggcctcgaccctgacccggatgcacggcgctcccgccacgccgatcgtcgagcccgaggccaaggacaagcgcttcgcccacgccgattggagcgccaacccggtcttcgacctgatcaagcagagctacctcatcctcggccgctgggcggaggagatggtcgagacggccgacggcatcgacgagcacacccgccacaaggccgagttctatctgcgccagctcctctcggcctactcgccctcgaacttcgtgatgacgaaccccgagctcctgcgccagacgctggaggagggcggcgccaacctgatgcgcggcatgaagatgctgcaggaggatttggaggccggcggcggacagctccgcgtccgccagaccgacctgaacgccttcaccttcggccaggacgtggcggtgacccccggcgaggtcatcttccgcaacgacctgatggagctgatccagtatgcgcccacgaccgagacggtgc tgaagcgtccgttgctgatcgtgccgccctggatcaacaagtactacattctcgacctcaacccgacgaagagcctcatcggctggatggtctctcaaggcatcacggtgttcgtgatttcctgggtcaatccggacgagcgccaccgggacaaggacttcgagtcctacatgcgcgagggcatcgagacggcgatcgacatgatcggcgtcgccaccggcgagaccgacgtggcggcggcgggctactgcgtcggcggcaccctgctcgccgtgacgctggcctaccaggcggccaccggcaatcggcggatcaagagcgcgacgttcctcaccacgcaggtcgacttcacccatgcgggcgacctcaaagtcttcgccgacgagagtcagatcaaggcgatcgaggagcggatggccgagcgcggctacttggagggcgcgcgcatggccaacgccttcaacatgctcaggcccaacgacctgatttggtcctacgtcgtcaacaactatgtgcgcggcaagccgccggcggccttcgacctgctctactggaacgccgacgccacccggatgccggcggccaaccactcgttctacctgcgcaactgctacctcaacaacacgctctccaaggggcagatggtgctcggcaacgtgcgcctcgacctgaagaaggtgaaggtgcccgtgttcaacctcgccacccgcgaggatcacatcgcgcctgcgctctccgtgttcgaggggtcggcgaagttcggtggcaaggtcgattacgtgctggcgggctcgggccacatcgcgggcgtcgtcgctccccccggccccaaggcgaagtacggcttccgcaccggggggccggccaggggccggttcgaggactggatcgagaaatcgaccgagcatcccggctcgtggtggccctactggtttcaatggctggaggagcaggcgcccgagcgcgtgccggcgcgtattcccggaacgggagcgctgccctcgctcgcaccggcaccgggcacctatgtgcgcatgaaggcgctcgagcaccaccaccaccaccactga

seqidno.2的信息

(a)序列特征

*长度：613氨基酸残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白

seqidno.2

matertgpaapdfetiarnanqlaeafrqsaaaslkpfdpagqgtglptaklqgsdeidemtrtltrvaetwlkdpekalqaqtklthsfaalwastltrmhgapatpivepeakdkrfahadwsanpvfdlikqsylilgrwaeemvetadgidehtrhkaefylrqllsayspsnfvmtnpellrqtleegganlmrgmkmlqedleagggqlrvrqtdlnaftfgqdvavtpgevifrndlmeliqyapttetvlkrpllivppwinkyyildlnptksligwmvsqgitvfviswvnpderhrdkdfesymregietaidmigvatgetdvaaagycvggtllavtlayqaatgnrriksatflttqvdfthagdlkvfadesqikaieermaergylegarmanafnmlrpndliwsyvvnnyvrgkppaafdlly wnadatrmpaanhsfylrncylnntlskgqmvlgnvrldlkkvkvpvfnlatredhiapalsvfegsakfggkvdyvlagsghiagvvappgpkakygfrtggpargrfedwiekstehpgswwpywfqwleeqapervparipgtgalpslapapgtyvrmkalehhhhhh

实施例3phac基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的实施例1的上下游引物中分别引入ncoi和xhoi酶切位点。pcr扩增产物和表达载体pet28a分别用ncoi和xhoi进行双酶切，酶切产物经电泳分离和凝胶回收后，将经过双酶切的pcr产物与同样经过双酶切的pet28a载体用t4dna连接酶连接。将连接产物转化e.colitop10感受态细胞，涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的固体luria-bertani培养基上，37℃培养12-16h。将单克隆接入含有50μg/ml氨苄青霉素的液体luria-bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶ncoi和xhoi对提取的质粒进行双酶切，在电泳检测，片段大小正确的重组质粒送华大基因测序，结果表明，在pet28a的ncoi和xhoi酶切位点之间插入了seqidno1所示的phac基因，且插入方向正确，证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pet28a-phac。

将pet28a-phac转化e.colibl21(de3)，在液体lb培养液中培养，当od值达到0.4-0.6时加入0.01mm的iptg诱导表达三个小时，将菌液离心，超声破碎细胞，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pha合酶phac的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的pha合酶phac在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4pha合酶phac的酶活测定

(1)测定蛋白的浓度(bca试剂盒法)

a.根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀。bca工作液室温24小时内稳定。

b.完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9％nacl或pbs稀释标准品。

c.将标准品按(可根据实际蛋白的含量确定减少前面或者后面两个点)0,1,2,4,8,12,16,20μl(分别代表的蛋白含量为：0、0.5、1、2、4、6、8、10ug蛋白)加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl。

d.取5、10、15μl样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl。

e.各孔加入200μlbca工作液，37℃放置30分钟。

f.测定a562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

(2)pha合酶phac活力的测定

a、配制20mmtris-hcl、0.5mmmgcl2的缓冲液：秤取tris0.2422g，mgcl2·6h2o0.0102g溶于100ml水中，调ph值到7.5，灭菌。

b、配制100mmtris-hcl、0.5mmmgcl2的缓冲液：秤取tris1.211g，mgcl2·6h2o0.0102g溶于100ml水中，调ph值到7.5，灭菌。

c、配制10mm的dtnb母液：准确称取0.1982gdtnb，用上述灭过菌100mmtris-hcl缓冲液)配制成50ml溶液暗处-20℃避光保存。

d、配制3mm的β-hydroxybutyryl-coenzymea(coa)(3-hbcoa)和5mg/ml的bsa母液：秤取3-hbcoa2.561mg，bsa蛋白5mg溶于1ml20mmtris-hcl缓冲液中。

e、配制5％(wt/vol)trichloroaceticacid(三氯乙酸)：取50mg溶于1ml20mmtris-hcl。

f、配制1mm的coa母液：秤取coa1.5351mgcoa溶于2ml100mmtris-hcl缓冲液中。

g、测定酶活：取4ul3mm的3-hbcoa，16ul20mmtris-hcl、0.5mmmgcl2的缓冲液混合，在30℃的水浴中水浴2min，加入5ul的酶液，在28度培养箱放置5min(看酶活情况，可适当的改变水浴时间)，再加入25ul的三氯乙酸溶液，混合液在4℃12000g离心10min。取上清33.33ul，1mm的dtnb(用100mmtris-hcl将10mm的dtnb母液稀释10倍)166.67ul，28度培养箱放置5min，在412nm处测定吸收值。

h、制作标准曲线：取各个溶液体积如下(ul)

在室温放置5min，在412nm处测定吸收值。

i、根据标准曲线，计算出酶活。按该方法测得phac酶的比活为0.5-1000u/mg。

实施例5该酶phac与phab、phaa一起在大肠杆菌中构建pha代谢途径

(1)、在该酶的基因序列和phab、phaa的基因序列上链接上ncoi和xhoi酶切位。

(2)、用这两个内切酶将三个基因片段切掉以后，再用t4dna连接酶将三个基因序列连接到表达载体pet28a上面，转入大肠杆菌中。

(3)、用lb培养液培养该大肠杆菌3天以产pha。

(4)、将菌体离心冻干。

(5)、气相色谱检测pha的含量，检测到的pha含量为菌体干重的10％-90％，如图：3。