本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及甜瓜杂交种“花蕾”纯度鉴定方法，是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂交种种子纯度鉴定方法。
背景技术：
“花蕾”是天津科润蔬菜研究所最新培育的薄皮甜瓜杂交一代品种。以抗性好、产量高、外观新颖、品质优良著称。植株长势旺盛，综合抗性好，子蔓、孙蔓均能结果，单株可留瓜4～5个，平均单瓜重500克。果实成熟期30天，成熟时果皮黄色，覆暗绿色斑块。果肉绿色，含糖量15%以上，肉质脆，口感好，香味浓郁。货架期长，耐贮运。春季保护地、露地均可种植。
甜瓜种子纯度的高低是直接衡量种子质量优劣的主要指标。种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。
EST-SSR标记因其具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。近年来，随着测序技术的不断提高和分子生物学的深入研究，大量瓜类作物的EST被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计划研究小组共收录西瓜ESTs7856条，甜瓜126940条，黄瓜359105条。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开了一种基于EST-SSR分子标记技术的甜瓜杂交种“花蕾”种子纯度鉴定方法，本方法通过对供试甜瓜杂交种“花蕾”进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析，确认了杂交种及其双亲稳定的共显性互补带型，从而对甜瓜杂交种“花蕾”种子进行纯度鉴定。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
用于鉴定甜瓜杂交种“花蕾”种子纯度的1对EST-SSR特异性引物，其特征在于，包括：
上游引物序列：5’-AACAGGTAGAGGAAAGCATG-3’，
下游引物序列：5’-TGACCCACTAGTACATCTCTC-3’。
本发明进一步公开了基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种“花蕾”种子纯度鉴定的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）采用EST-SSR特异性引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq?MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板50ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环，94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec；72℃延伸7min，4℃保存；
（2）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40%PAG6mL，TMED30μL，10%过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳30min，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
（3）通过分析EST-SSR结果，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。
本发明更进一步公开了基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种“花蕾”种子纯度鉴定的方法在快速鉴定种子纯度方面的应用，实验结果显示：与现有的方法相比，本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。
本发明一个典型的方法如下：
本发明公开的快速鉴定甜瓜杂交种种子纯度的方法，该方法以温室甜瓜品种”花蕾”供试种子的基因组DNA为模板，对已知品种“花蕾”亲本DNA差异性片段进行分析。
供试甜瓜杂交种取样及DNA提取方法为：对温室甜瓜随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg，液氮冷冻研磨（RetschMM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20g/LCTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMNa2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，NanodropND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
供试甜瓜杂交种PCR方法为：
(1)SSR上游引物序列：5’-AACAGGTAGAGGAAAGCATG-3’，
SSR下游引物序列：5’-TGACCCACTAGTACATCTCTC-3’。
(2)采用上述SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq?MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板（50ng/μL）1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环（94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存；
(3)供试甜瓜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40%PAG6mL，TMED30μL，10%过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(4)供试甜瓜杂交种EST-SSR结果分析，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明：
1、原理
本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是：EST-SSR是以1～6个碱基为重复单元，是存在于EST中的SSR。EST(Expressedsequencetag，表达序列标签)是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150～500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心（NCBI）的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，从而计算杂交种的纯度。
2、引物设计
通过GeneBank数据库上公布的214条甜瓜EST序列，利用Primer3.0在线引物设计，引物由上海生工合成，经筛选获得了2对EST-SSR引物可用于甜瓜杂交种种子纯度鉴定。引物由上海生物工程公司合成。
引物序列表如下：
3、取样及DNA提取
对温室甜瓜进行随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg，液氮冷冻研磨（RetschMM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20g/LCTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMNa2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，NanodropND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
、PCR反应
采用SSR上游引物序列：5’-AACAGGTAGAGGAAAGCATG-3’，
SSR下游引物序列：5’-TGACCCACTAGTACATCTCTC-3’。
SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增（仪器为ABVeritiPCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq?MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板（50ng/μL）1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环（94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存。
、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
供试甜瓜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳（仪器为BIO-RAD电泳仪），非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40%PAG6mL，TMED30μL，10%过流酰胺300μL；上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；
染色过程（仪器为ORBITAL脱色摇床）：于600mL超纯水中加入6mL10%的硝酸银溶液，银染8～10min；于600mL超纯水中迅速水洗；于600mL超纯水中加入9g氢氧化钠粉末，溶解后加入3mL甲醛，显色数分钟，直至条带清晰即可；600mL超纯水中再次水洗。
、EST-SSR谱带分析
通过分析EST-SSR结果，比较供试样品的杂交种及其双亲的特征谱带，对供试杂交种进行纯度鉴定。用筛选获得的SSR引物，母本表现为1条特征谱带，父本表现为相异于母本的1条特征谱带，纯合的杂交种即表现为这2条特征谱带的集合，也就是共显性的互补带型；非纯合的不能表现为共显性的互补带型，可能表现为母本特征谱带带型，即出现了母本自交。
7、纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度:
种子纯度=杂交种数量/供试样品数量*100%。
本发明公开的基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种花蕾种子纯度鉴定的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时90min，EST-SSR分析60-90min，所以本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。鉴定结果稳定，具有极高的可重复性。
附图说明:
图1为筛选获得的1对SSR引物用于甜瓜杂交种“花蕾”及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为1～6母本带型、7～12杂交种带型、13～18父本带型。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用试剂均由市售。
实施例1
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaq?MasterMix溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
（2）EST-SSR引物序列表如下：
（3）取样及DNA提取
供试品种幼苗90株，液氮冷冻研磨（RetschMM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20g/LCTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMNa2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，NanodropND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
（4）PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试幼苗DNA模板及其亲本DNA进行PCR扩增（仪器为ABVeritiPCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq?MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试品种母本基因组DNA模板（50ng/μL）1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环（94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存。
（5）凝胶电泳及银染
供试品种母本PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
（6）EST-SSR结果分析：90株供试幼苗中有2株的电泳带型与母本带型一致，为非杂交种。
（7）纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度。
种子纯度=88/90*100%=97.7%。
实施例2
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaq?MasterMix溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
（2）EST-SSR引物序列表如下：
（3）取样及DNA模板提取
供试品种幼苗144株，液氮冷冻研磨（RetschMM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20g/LCTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMNa2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，NanodropND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
（4）PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试幼苗DNA模板及其亲本DNA进行PCR扩增（仪器为ABVeritiPCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq?MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试品种父本基因组DNA模板（50ng/μL）1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环（94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存。
（5）凝胶电泳及银染
供试品种父本PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
（6）EST-SSR结果分析：144株供试幼苗中有1株的电泳带型与母本带型一致，为非杂交种。
（7）纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度。
种子纯度=143/144*100%=99.3%。
实施例3
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaq?MasterMix溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
（2）EST-SSR引物序列表如下：
（3）取样及DNA提取
供试品种取杂交种单株94，液氮冷冻研磨（RetschMM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20g/LCTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMNa2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，NanodropND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
（4）PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试品种杂交种单株模板DNA进行PCR扩增（仪器为ABVeritiPCR），其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq?MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试品种杂交种基因组DNA模板（50ng/μL）1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环（94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存。
（5）凝胶电泳及银染
供试品种杂交种PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
（6）EST-SSR结果分析：供试品种杂交种带型为母本1条与父本相异于母本的1条，这2条特征谱带的集合，也就是共显性的互补带型。
（7）纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度。
种子纯度=
实施例4比较试验（与常规鉴定方法相比）：
常规鉴定方法：田间种植纯度鉴定
鉴定步骤：
1.浸种催芽
（1）时间：2015年7月22日
（2）方法：随机选取“花蕾”种子120粒进行浸种催芽，温度50～55℃，搅拌至室温浸泡4h，沥干水分用湿毛巾包裹置于35℃的恒温箱中进行催芽，24h后50%以上种子露白后即可播种。
2.播种
（1）时间：2015年7月23日
（2）方法：将发芽种植平放于穴盘中，覆土，浇透水，盖塑料薄膜保温，一般2d左右即可出苗。
3.定植
（1）时间：2015年8月1日
（2）方法：将幼苗从穴盘中取出定植到温室中，定植时勿散坨，确保与土壤密切接触，定植后浇大水，不放风，以较高温度管理，促进缓苗。
4．整枝打杈
(1)时间：2015年8月10日
(2)方法:保护地吊蔓栽培采用双蔓整枝，幼苗4-5片叶时摘心，每节间长出侧枝后选留两条健壮、长势相当的子蔓，子蔓发出的第一、第二孙蔓摘除，子蔓三节以上发出的孙蔓留瓜，每条子蔓可连续留瓜2~3个，留瓜孙蔓留2片叶摘心。
鉴定结果：
1时间：2015年9月25日
2方法：待果实转色后完全表现出该品种的特性时，进行统计，与该品种果实性状表现不一致者视为杂株。纯度%=（总株数-杂株数）/总株数×100%
3结果：经田间观测调查，110株甜瓜中，有两株所结果实高梨形，与该品种果实特点（梨形）不一致，视为杂株，因此，“花蕾”纯度计算如下：
纯度%=（110-2）/110×100%=98.3%。
与常规甜瓜种子纯度鉴定方法比较如下表：
4结论
（1）本发明的方法以甜瓜品种“花蕾”杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过GeneBank数据库上公布的214条甜瓜EST序列，利用Primer3.0在线引物设计，经过筛选获得2对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。
（2）本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时90min，EST-SSR分析60-90min，所以本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。
（3）本发明在引物的筛选上注重父本、母本和F1代的带型互补，电泳条带易观察和分析。
SEQUENCELISTING
<110>天津科润农业科技股份有限公司
天津市农业质量标准与检测技术研究所
<120>基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种花蕾种子纯度鉴定的方法
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aacaggtagaggaaagcatg20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgacccactagtacatctctc21