检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的RT-PCR及其应用的制作方法

本发明涉及pcr检测技术领域，特别是涉及用于检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的靶序列、rt-pcr引物，本发明还涉及利用该靶序列进行水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术：

玉米粗缩病(maizeroughdwarfdisease,mrdd)是危害玉米生产的世界性病毒病害之一，在我国玉米产区发生严重。2008年到2013年，玉米粗缩病导致产量严重损失，普遍达到30％至50％，严重地区可达80％以上，甚至绝收。

玉米粗缩病病源主要有四种，均属于呼肠孤病毒科(reoviridae)斐济病毒属(fijivirus)。在欧洲，病源是玉米粗缩病毒(maizeroughdwarfvirus,mrdv)；南美洲病源是马德里约柯托病毒(malderíocuartovirus,mrcv)；在亚洲导致玉米粗缩病的病源是水稻黑条矮缩病毒(riceblack-streakeddwarfvirus,rbsdv)或南方水稻黑条矮缩病毒(southernriceblack-streakeddwarfvirus,srbsdv),我国黄淮海地区主要病源是rbsdv，广东、海南以及越南和日本等地区的病源主要是srbsdv。以上病毒同时也是水稻黑条矮缩病(riceblack-streakeddwarfdisease,rbsdd)和小麦绿矮病(wheatgreendwarfdisease,wgdd)等病害的主要病源。

玉米粗缩病病源rbsdv、mrdv和mrcv均是以灰飞虱(laodelphaxstriatellus,sbph)为传播介体以持久性传播；而近期发现的srbsdv是以白背飞虱(sogatellafurcifera,wbph)为介体持久性传播。四种病毒在寄主范围、血清学关系、病毒粒子结构、 介体传毒方式及植物寄主发病方式等方面均较为相似，但通过基因序列比对确定其为两种不同病毒。

rbsdv完整病毒粒子为等轴的20面球体，直径约为70-80nm，其基因组由10条线性双链rna(dsrna)组成，10条双链dsrna按在page电泳中迁移率由慢到快分别命名为s1-s10，大小从4.5kb到1.8kb。目前研究表明，基因组共有13个开放阅读框(openreadingframe,orf)，s5、s7和s9区段分别含有两个orf，其中s5区段的两个orf部分重叠，其余7条基因组区段均只有一个orf。

目前，常用的检测植物病毒的方法主要包含：分子方法检测，电镜观察，血清学检测以及生物学接种试验等。但以上检测方法很难准确鉴定病原，且操作方法相对复杂。

为了提高水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒检测的准确性和便捷性，有必要建立灵敏度更好、特异性更好的检测方法来鉴定rbsdv和srbsdv。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供用于检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的特异、灵敏、快速、简便的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明通过对多年多点水稻黑条矮缩病毒基因核苷酸区段进行测序和比对，确定了保守区s5区段序列，其核苷酸序列如seqidno.5所示，该靶序列是检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性区段也可以作为检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。同时，在此区段内筛选到水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒一致性最低的序列。本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测并区分水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒遗传标志物的特异性引物对。

在本发明的一个实施方式中，优选的rbsdv特异性引物对的序 列为：

rs5-f：acgatcttctcgaccaaacc(seqidno.1)(rbsdvs5中位置：2436-2455)

rs5-r：agcaagagttgaaacacaaccg(seqidno.2)(rbsdvs5中位置：2834-2855)

优选的srbsdv特异性引物对的序列为：

ss5-f：acgatcttctcgaccaaacc(seqidno.3)(srbsdvs5中位置：2439-2458)

ss5-r：agcttatcatcgcgctgtagt(seqidno.4)(srbsdvs5中位置：2821-2841)

进一步地，本发明提供了用于检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的特异性引物组合，用于检测水稻黑条矮缩病毒的引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物的核苷酸序列如seqidno.3-4所示。

本发明提供了上述检测两种病毒的特异性引物组合在检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒中的应用。

本发明提供了上述两种病毒的特异性引物组合在制备检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒试剂盒中的应用。

本发明提供了上述两种病毒的特异性引物对在防治作物病虫害中的应用。在本发明的实施例中，所述作物为玉米。

进一步地，本发明提供了含有上述两种病毒的特异性引物对的试剂盒。

具体地，该试剂盒基于rt-pcr方法，对待测样本提取基因组rna后以其为模板，利用seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3、seqidno.4所示的特异性引物对进行rt-pcr，检测待测样本中的水稻黑条矮缩病毒或南方水稻黑条矮缩病毒。

更进一步地，本发明提供了上述试剂盒在防治作物病虫害中的应 用。在本发明的实施例中，所述作物为玉米。

所述rt-pcr的反应体系为：

反应条件为:

所述待测样本为玉米、水稻或小麦。

本发明提供的上述检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法在防治作物病虫害中的应用也属于本发明的保护范围。

基于本发明的上述检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法，根据扩增目的条带判定结果，并根据目的条带位置判断所携带病毒。在有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中有效扩增时，样本结果判断标准如下：

seqidno.1和seqidno.2引物对有效扩增，扩增产物420bp左右，而seqidno.3和seqidno.4引物对无效扩增(420bp处无扩增)时，样本携带的是水稻黑条矮缩病毒；seqidno.3和seqidno.4引物对有效扩增(扩增产物403bp左右)，而seqidno.1和seqid no.2引物对无效扩增时(403bp处无扩增)，样本携带的是南方水稻黑条矮缩病毒；seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3、seqidno.4引物对均有效扩增时，样本同时携带水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒。

对于自然条件下，同时携带水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的作物样本，目前发明人还没有发现。应当理解，上述方法的判断标准完全适用于检测任何感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的实际情况。

本发明根据水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒基因组保守区序列设计引物，可以通过rt-pcr进行病原检测，检测灵敏度、特异性均优于现有技术，并能够实现同时检测作物同时感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的情况。本发明通过水稻黑条矮缩病毒基因组和南方水稻黑条矮缩病毒s5区段设计引物，可以进行病原基因组检测，检测结果精确。本发明方法极大的方便了检测成本提高了检测效率，便于病原的确定，可用于作物此类病虫害的防治，具有良好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为基于127份水稻黑条矮缩病毒分离物s5区段核苷酸序列多样性分析。a图为rbsdvs5区段序列结构；b图为rbsdvs5区段核苷酸多样性及保守区域分析。

图2为本发明rbsdv和srbsdv最优引物的筛选。a图为rbsdvs5区段最优引物筛选，泳道m为markerdl2000；泳道1为rs5-f-1/rs5-r-1引物对扩增结果；泳道2为rs5-f-2/rs5-r-2引物对扩增结果；泳道3为rs5-f/rs5-r引物对扩增结果。b图为srbsdvs5区段最优引物筛选，泳道m为markerdl2000；泳道1为ss5-f/ss5-r引物对扩增结果；泳道2为ss5-f-1/ss5-r-1引物对扩增结果；泳道3为ss5-f-2/ss5-r-2引物对扩增结果。

图3为rbsdv和srbsdv优选引物特异性分析。a图为rs5-f-2/rs5-r-2引物对特异性分析，泳道m为markerdl2000；泳道1为玉米矮花叶病发病明显的植株；泳道2为玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国黄淮海地区)；泳道3为玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国海南省)。b图为ss5-f/ss5-r引物对特异性分析，泳道m为markerdl2000；泳道1为玉米矮花叶病发病明显的植株；泳道2为玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国黄淮海地区)；泳道3为玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国海南省)。

图4为rbsdv和srbsdv优选引物检测样本电泳图。图a为rbsdv优选引物检测样本电泳图，其中泳道m为markerdl2000；泳道r1、r2和r3代表3个玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国黄淮海地区)；泳道s1、s2和s3代表3个玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国海南省)。图b为srbsdv优选引物检测样本电泳图，其中泳道m为markerdl2000；泳道s1、s2和s3代表3个玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国海南省)；泳道r1、r2和r3代表3个玉米粗缩病发病明显的植株(采集于我国黄淮海地区)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1水稻黑条矮缩病毒保守序列的选择与特异性引物的设计

通过多年多点的水稻黑条矮缩病毒基因核苷酸序列测序和比对，确定保守区s5区段序列，其核苷酸序列如seqidno.5所示，该靶序列是检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。

本发明于2012-2014年在北京(i)、河北唐山(ii)和保定(iii)、 山东济南(iv)和济宁(v)、河南郑州(vi)和信阳(ix)、江苏盐城(vii)和南京(viii)采集表现典型症状的玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病样品共计127份，采用3对rbsdv基因组s5特异性引物扩增。结果显示，rbsdv-s5的2398-2832bp最为保守，且为两个orf重叠区域。比对所有样品的s5此区段，确定与其它样品s5区段相似性较高的13iiim-1样品s5序列2398-2832bp区域为保守区(seqidno.5)，见图1。

根据s5保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对。

本发明的引物设计遵循以下原则：避免引物自身或之间形成4个以上连续配对，无环状发卡结构；18-24bp长；tm值55-65℃，gc含量在40％-60％之间，两个引物tm值相差不超过2℃；3’端不出现a，且不出现三个或三个以上连续相同碱基；引物后5个核苷酸不能有超过2个g和c；扩增片段长度在400-500bp最佳。

本发明通过筛选获得的用于扩增水稻黑条矮缩病毒各血清型特异性的保守靶序列的特异性引物对的序列为：

rs5-f：acgatcttctcgaccaaacc(rbsdvs5中位置：2436-2455)

rs5-r：agcaagagttgaaacacaaccg(rbsdvs5中位置：2834-2855)

本发明通过筛选获得的用于扩增南方水稻黑条矮缩病毒各血清型特异性的保守靶序列的特异性引物对的序列为：

ss5-f：acgatcttctcgaccaaacc(srbsdvs5中位置：2439-2458)

ss5-r：agcttatcatcgcgctgtagt(srbsdvs5中位置：2821-2841)

针对目标基因，本实施例还设计了另外2对引物(见下方)，

针对目的基因保守序列另外设计的引物：

rs5-f-1：acgatcttctcgaccaaacca(第2436-第2456)

rs5-r-1：acacaaccggtcatcacgtt(第2823-第2842)

rs5-f-2：gatcttctcgaccaaaccacg(第2438-第2458)

rs5-r-2：aaacacaaccggtcatcacg(第2825-第2844)

ss5-f-1：tacgatcttctcgaccaaacc(第2438-第2458)

ss5-r-1：gcttatcatcgcgctgtagt(第2821-第2840)

ss5-f-2：atttacgatcttctcgaccaaacc(第2435-第2458)

ss5-r-2：cagttaaaatgaagcttatcatcgc(第2829-第2853)

但上述设计的引物对，其扩增效果均不如rs5-f、rs5-r和ss5-f、ss5-r的检测效果，见图2。因此本实施例选用上述优选的引物为pcr检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的最佳引物对。

实施例2水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的rt-pcr检测方法的特异性评价

田间取玉米矮花叶病和玉米粗缩病病症明显的植株，提取叶片rna，反转录后采用实施例1中的优选引物rs5-f、rs5-r和ss5-f、ss5-r进行检测，结果显示玉米矮花叶病病株均呈阴性，而玉米粗缩病病株均呈阳性，如图3所示。说明本发明实施例1筛选的水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的优选引物对特异性良好，能够特异性检测玉米粗缩病病株的病原。

实施例3本发明的水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒rt-pcr检测玉米粗缩病病原

采用实施例1中筛选的水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的优选检测引物rs5-f、rs5-r和ss5-f、ss5-r鉴定玉米粗缩病病原。

分别选择在我国黄淮海地区(r1、r2、r3)和海南省(s1、s2、 s3)采集的玉米粗缩病症状典型的植株，采集病叶保存于-80℃冰箱。transzoltmup(transgenbiotech)法提取单株玉米叶片总rna，采用fastquantrtkit(withgdnase)(tiangen)试剂盒反转录，利用优选引物rs5-f/rs5-r和ss5-f/ss5-r分别进行扩增。结果显示，样品r1、r2和r3采用rs5-f/rs5-r引物对扩增时可以检测到约420bp大小的目的条带，而采用ss5-f/ss5-r引物对扩增时无目的条带(图4的a图)。样品s1、s2和s3采用ss5-f/ss5-r引物对扩增时可以检测到约403bp大小的目的条带，而采用rs5-f/rs5-r引物对扩增时无目的条带(图4的b图)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。