本申请是中国专利申请201280026737.X(发明名称：结合Dll4和Ang2的双特异性结合分子；申请日：2012年3月30日)的分案申请。发明领域本发明涉及人的治疗，特别是癌症治疗的领域以及适用于该治疗中的药物及组合物。发明背景当肿瘤达到约1mm3的临界大小时，它们变得依赖于血管生成以保持氧气和营养的血液供应以便进一步生长。抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗已集中于通过中和VEGF(安维汀)或其受体(索坦(Sutent)和索拉非尼(Sorafinib))阻断VEGF通路(Ferrara等人,NatRevDrugDiscov.2004年5月；3(5):391-400)。近来在小鼠中的研究已显示，促血管生成素2(Ang2)，Tie2受体的一种配体，通过使其他的血管生成因子(如VEGF)发挥功能来控制血管重构。Ang2主要由内皮细胞表达，由缺氧和其他血管生成因子强烈诱导，并已证明其调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答VEGF和FGF2(Augustin等人,NatRevMolCellBiol.2009年3月；10(3):165-77.)。与该作用相一致，Ang2的缺失或抑制导致血管生成减少(Falcón等人,AmJPathol.2009年11月；175(5):2159-70.)。已经报道结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑色素瘤患者具有升高的Ang2血清浓度(Goede等人,BrJCancer.2010年10月26日；103(9):1407-14)，(Park等人,Chest.2007年7月；132(1):200-6.)，(Helfrich等人,ClinCancerRes.2009年2月15日；15(4):1384-92.)。在CRC癌症中，Ang2血清水平与抗VEGF治疗的治疗应答相关。Ang-Tie系统由2个受体(Tie1和Tie2)和3个配体(Ang1、Ang2和Ang4)组成(Augustin等人，NatRevMolCellBiol.2009年3月；10(3):165-77.)。Tie2、Ang1和Ang2是这个家族中研究最好的成员，Tie1是一个孤儿受体而Ang4对血管重构的功能仍然需要加以界定。Ang2和Ang1对于Tie2的结合和活化介导相反的功能。Ang2介导的Tie2活化导致内皮细胞活化、周细胞解离、血管渗漏和诱导血管萌芽。与Ang2相反，Ang1信号转导通过募集周细胞维持血管完整性，从而保持血管内皮细胞静止。血管生成素2(Ang2)是一种分泌的、66kDa的Tie2受体酪氨酸激酶的配体(Augustin等人,NatRevMolCellBiol.2009年3月；10(3):165-77.)。Ang2由N-末端卷曲螺旋域和C-末端的纤维蛋白原样域组成，后者是与Tie2相互作用需要的。Ang2主要由内皮细胞表达并由缺氧和其他血管生成因子(包括VEGF)强烈诱导。Tie2在内皮细胞、造血干细胞和肿瘤细胞上发现。已经证明Ang2-Tie2调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答VEGF和FGF2。在体外已经表明Ang2在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中充当温和的有丝分裂原、趋化因子和管形成的诱导物。Ang2诱导成纤维细胞中异位表达的Tie2的酪氨酸磷酸化，并促进下游信号事件，例如HUVEC中ERK-MAPK、AKT和FAK的磷酸化。已经描述了Ang2在Ang1诱导的内皮细胞应答中的拮抗作用。已经表明Ang2缺乏导致了小鼠中严重的淋巴模式(lymphaticpatterning)缺陷。虽然Ang2丧失不是胚胎血管发育所必需的，但是Ang2缺陷小鼠在视网膜和肾脏中具有持久性血管缺陷。结合在血管生成部位(例如卵巢)的Ang2表达的动态模式，这些结果表明Ang2通过使其他的血管生成因子(如VEGF)发挥功能而控制血管重构。Ang2-Tie2系统在血管生成开关和肿瘤血管生成后期阶段中发挥至关重要的作用。在肿瘤相关的内皮中Ang2的表达强烈上调。当肿瘤植入Ang2缺陷小鼠，特别是在肿瘤生长的早期阶段植入时，已经观察到肿瘤生长降低。使用Ang2单克隆抗体的治疗性阻断Ang2已经在各种肿瘤异种移植模型中显示出广泛的疗效。如US2008/0014196中所概述，血管生成牵涉于包括实体瘤及转移瘤的多种疾病的发病机制中。在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为瘤形成及对于为肿瘤生长及转移提供营养似乎是至关重要的(Folkman等人,Nature339-58(1989))，这使得肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗已集中于阻断VEGF通路(Ferrara等人,NatRevDrugDiscov.2004年5月；3(5):391-400)。Notch信号转导通路对细胞与细胞间的通信是重要的，该通路涉及控制胚胎发育期间及成人有机体中多种细胞分化过程的基因调控机制。Notch信号转导在许多癌症中失调，例如在T细胞急性淋巴母细胞白血病及实体肿瘤中(Sharma等人2007,CellCycle6(8):927-30；Shih等人,CancerRes.2007年3月1日；67(5):1879-82)。Dll4(或Delta样4或Delta样配体4)为Notch配体的Delta家族成员。Dll4的细胞外域由N-末端域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL)域，和一串八个表皮生长因子(EGF)样重复构成。一般而言，认为EGF域包含氨基酸残基218-251(EGF-1；域1)、252-282(EGF-2；域2)、284-322(EGF-3；域3)、324-360(EGF-4；域4)和362-400(EGF-5；域5)，同时DSL域在hDll4的约氨基酸残基173-217处，并且N-末端域在约氨基酸残基27-172处(WO2008/076379)。已报导Dll4由血管内皮高度选择性表达，特别是在动脉内皮中高度选择性表达(Shutter等人(2000)GenesDevelop.14:1313-1318)。近来在小鼠中的研究已显示，Dll4由VEGF诱导且为限制血管萌芽及分枝的负反馈调节剂。与此作用一致，缺失或抑制Dll4会导致血管生成过度(Scehnet等人,Blood.2007年6月1日；109(11):4753-60)。这种不受限制的血管生成由于非生产性(non-productive)血管形成而反常地减缓肿瘤生长，即使在对抗VEGF治疗具有抗性的肿瘤中也是如此(Thurston等人,NatRevCancer.2007年5月；7(5):327-31；WO2007/070671；Noguera-Troise等人,Nature.2006年12月21日；444(7122))。此外，已证明在多种肿瘤类型的异种移植模型中，相比于单独的抗VEGF，VEGF与Dll4的组合抑制会提供优越的抗肿瘤活性(Noguera-Troise等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1032-7；Ridgway等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7)。由于这些结果，Dll4被视为一种用于癌症治疗的有希望的靶点，且已描述处于临床(前)研发中的若干靶向于Dll4的生物化合物：REGN-421(＝SAR153192；Regeneron，Sanofi-Aventis；WO2008076379)及OPM-21M18(OncoMed)(Hoey等人,CellStemCell.2009年8月7日；5(2):168-77)，两者均为完全人Dll4抗体；YW152F(Genentech)，一种人源化Dll4抗体(Ridgway等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7)；Dll4-Fc(Regeneron，Sanofi-Aventis)，一种由Dll4细胞外区域及人IgG1的Fc区域构成的重组融合蛋白(Noguera-Troise等人,Nature.2006年12月21日；444(7122))。然而，现有技术的单克隆抗体(MAb)及融合蛋白鉴于其治疗应用具有若干缺点：为了防止其降解，其必须储存在接近冰点的温度。此外，因为其在消化道中快速消化，所以其不适于口服给药。MAb用于癌症治疗的另一主要限制为转运不良，这导致浓度较低以及不能靶向于肿瘤中的所有细胞。本发明的一个目标在于提供用于人治疗的新的抗血管生成的结合分子。本发明的另一个目标在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或病状的方法，其涉及使用和/或给予这些结合分子及含有这些结合分子的组合物。特别地，本发明的一个目标在于提供这种药理学活性的结合分子、组合物和/或方法，其相比于当前使用的和/或本领域中已知的药物、组合物和/或方法可提供优势。这些优势包括改良的治疗性质和/或药理学性质和/或其他例如对于制造目的而言为有利的性质，尤其是与如上所述的常规抗体或其片段相比。
技术实现要素：
根据第一方面，本发明提供了双特异性结合分子，优选双特异性免疫球蛋白，优选免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体，其在单一分子中包含至少一个DLL4结合组分和至少一个Ang2结合组分。这些双特异性结合分子可优选包含其他结合组分，优选结合血清白蛋白的结合组分。更具体地，本发明的双特异性结合分子基本上包含(i)至少一个Dll4结合组分，其特异性结合Dll4的至少一个表位，及(ii)至少一个Ang2结合组分，其特异性结合Ang2的至少一个表位，其中所述组分彼此连接的方式使得它们同时结合Dll4和Ang2，或者它们每次结合Dll4或Ang2两者之一。根据本发明优选的方面，两种组分包含一个或多个免疫球蛋白单一可变域，所述可变域可彼此独立地为VHH或域抗体，和/或任何其它种类的免疫球蛋白单一可变域，如本文所定义的VL域，前提是这些免疫球蛋白单一可变域中的每一个分别结合抗原，即Dll4或Ang2。根据一项优选实施方案，免疫球蛋白单一可变域是相同类型的，特别地，所有免疫球蛋白单一可变域是VHH或域抗体。根据一个特别优选的实施方案，所有免疫球蛋白单一可变域是VHH，优选人源化的(或如本文所定义的“序列最优化的”)VHH。因此，本发明涉及双特异性结合分子，其包含一个(任选地人源化的或序列最优化的)抗Dll4VHH和(任选地人源化的或序列最优化的)抗Ang2VHH。然而，本领域技术人员将清楚本文的教导可以类似地应用于包含其他抗Dll4或抗Ang2的免疫球蛋白单一可变域(如域抗体)的双特异性结合分子。在另一方面中，本发明涉及编码本发明的双特异性结合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主细胞。本发明还涉及一种产品或组合物，其含有或包含至少一种本发明的双特异性结合分子，且这些组分任选包含或含有一种或多种其它组分。本发明还涉及制备或产生本文所述的双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的方法。本发明还涉及本文所述的双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的应用及用途，以及预防和/或治疗可以通过抑制Dll4调节的疾病及病症的方法。已经发现，与对Ang1或Ang4的效价相比，根据本发明的双特异性结合分子的Ang2结合组分以至少高5,000倍，优选高10,000倍的效价结合Ang2。这将在很大程度上避免阻断Ang1介导的信号转导的活化，所述阻断Ang1介导的信号转导的活化会抵消预期的抗血管生成作用。已进一步发现，与对Dll1、Jagged1以及优选地对Jagged2的亲和力相比，根据本发明的双特异性结合分子的DLL4结合组分以至少高1,000倍的亲和力结合DLL4。由于这种选择性，不需要的副反应是可以避免的。在一项优选实施方案中，本发明的双特异性结合分子以连接的VHH域提供。这样的分子显著地小于常规抗体，因此与常规抗体相比，具有更深地穿透肿瘤的能力。通过本文公开的特异性序列在去除糖基化位点后，进一步突出了该益处。另外，由于双特异性的特性(Dll4和Ang2结合组分存在于一个分子中)，两种功能性(functionality)的肿瘤穿透必然相等，这将确保在穿透肿瘤的整个深度内提供Dll4和Ang2联合拮抗的有益效果。对于针对这些靶点的单独拮抗剂的联合，这是一个优势，因为单独拮抗剂的穿透深度总在一定程度上变化。本发明优选的双特异性结合分子的另一优势是由于血清白蛋白结合组分(如本文所述的血清白蛋白结合分子)而增加的血清半衰期等。本发明的这些及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得明确。定义除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(第2版),第1-3卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；Lewin,“GenesIV”，OxfordUniversityPress,NewYork,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),GowerMedicalPublishing,London,NewYork(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。还参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。术语“双特异性结合分子”是指包含至少一个Ang2结合分子(或“Ang2结合组分”)和至少一个Dll4结合分子(或“Dll4结合组分”)的分子。双特异性结合分子可含有多于一个Ang2结合分子和/或多于一个Dll4结合分子，即在双特异性结合分子的情况下，在结合Ang2或Dll4的分子的部分，即分别在“Ang2结合组分”(或抗Ang2组分)或“Dll4结合组分”(或抗Dll4组分)中，含有一个双互补位(定义见下文)Ang2结合分子和/或一个双互补位Dll4结合分子。然而在本文中术语“双特异性”并不解释为从双特异性结合分子中排除对Dll4和Ang2以外的分子具有结合特异性的其他结合组分。这样的其他结合组分的非限制性实例是结合血清白蛋白的结合组分。除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解释。如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7条反平行β链的2层夹层(sandwich)组成。免疫球蛋白域包含可变域，即一个或多个免疫球蛋白可变域。如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区被本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。在本发明的内容中，优选免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体。如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的来自骆驼科的“VHH域”(或简称为“VHH”)。鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)、或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域与抗原的各别表位发生结合，而是通过共同结合各别抗原表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VH-VL对发生结合。“VHH域”，也称为VHH、VHH域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC,AtarhouchT,MuyldermansS,RobinsonG,HamersC,SongaEB,BendahmanN,HamersR.:“Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflightchains”；Nature363,446-448(1993))。已选择术语“VHH域”将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“VL域”或“VL域”)进行区分。VHH域可特异性结合表位而无其他抗原结合域(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VHH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及及域”(“Nanobody”为比利时根特AblynxN.V.公司的商标)可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构且特异性结合表位无需存在第二免疫球蛋白可变域)，且其由例如WO2009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmarkresidue)”与VH域区分。如例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods231,25-38(1999)的图2中所示，适用于骆驼科的VHH域，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法(“Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”,USPublicHealthServices,NIHBethesda,MD,公开案第91号)来编号免疫球蛋白单一可变域(如VHH)的氨基酸残基。根据该编号法，-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。然而应注意，如本领域中对于VH域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号法所指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号法的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。对VH域的氨基酸残基进行编号且还可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110-120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。免疫球蛋白单一可变域，例如根据本发明优选实施方案的VHH及域抗体具有大量使其高度有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地，且不对其进行限制，VHH域(其已本质上经“设计”为在不与轻链可变域配对情况下功能性地结合抗原)可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。由于其独特性质，如本文定义的免疫球蛋白单一可变域，例如VHH或VH(或VL)，无论是单独存在还是作为较大多肽(例如双互补位分子)的一部分，均提供许多显著优点：·仅需要单一域以高亲和力及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个各别的域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在(即通过使用特别设计的连接子，如scFv的连接子)；·免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰(如糖基化)；·免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步论述)；·免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和力，具有低遗传毒性，可通过输注或注射以外的替代途径给予；·免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备情况下制备、储存或运输；·免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均较为容易且相对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域可使用微生物发酵(例如下文进一步描述的)产生，不需要像常规抗体那样使用哺乳动物表达系统；·相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相对较小的(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示(更)高的组织(包括但不限于实体瘤及其他致密组织)穿透性，且可以以高于这些常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；·VHH具有特定的所谓“空腔结合性质”(cavity-bindingproperties)(尤其是由于相比于4链抗体的VH域，其CDR3环更为延伸)，因此其也能够进入常规4链抗体及其抗原结合片段不能进入的靶点及表位；·VHH具有高度可溶性和极其稳定且具有不趋于聚集的特别优势(如同由Ward等人,Nature341:544-546(1989)所述的小鼠源抗原结合域)。本发明的免疫球蛋白单一可变域，其获得的具体生物来源或具体制备方法不受限制。例如，获得VHH可包括以下步骤：(1)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从中分离VHH；(2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；(3)任选在亲和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH“人源化”(如本文所述的)，或表达编码这类人源化VHH的核酸；(4)使动物物种(特别是哺乳动物物种，例如人)天然存在抗体的免疫球蛋白单一可变重域“骆驼化”(如下所述)，或表达编码这类骆驼化域的核酸分子；(5)使VH“骆驼化”，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；(6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；(7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；(8)使重链抗体或VHH经受亲和力成熟、诱变(例如随机诱变或定点诱变)和/或任何其他技术以增加VHH的亲和力和/或特异性；和/或(9)组合或选择上述步骤。适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所了解。举例而言，获得结合特异性抗原或表位的VHH域的方法已经在WO2006/040153和WO2006/122786中描述。根据具体实施方案，本发明的或存在于本发明的多肽中的免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已经“人源化”或“序列最优化”(任选在亲和力成熟之后)，即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式使用。人源化的VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一个进一步更具体的实施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或与其高度同源，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。因此，人源化方案可包含单独或组合使用生殖系VH基因(例如DP47、DP29及DP51)的相应框架1、2和3(FR1、FR2和FR3)残基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的框架区(FR)可选自那些例如WO2006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓“KERE”及“GLEW”类型。实例为在约位置44-47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人源化对应物。人源化VHH域可包含一个或多个完全的人框架区序列。例如，属于103P,R,S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VHH的人源化置换是将108Q置换成108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的结合免疫球蛋白单一可变域，可通过如下本领域中已知的技术而从各别的结合分子获得：亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合，也称为如本文所述的术语“序列最优化”。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。适当时，可通过使另一结合分子亲和力成熟来获得亲和力增加的结合分子，就亲和力成熟分子而言所述另一结合分子表示“亲本”结合分子。获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已描述于例如WO2006/040153及WO2006/122786中。如其中所详述的，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基经“人源化”(本文中也称为“序列最优化”，除人源化外，“序列最优化”可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一进一步更具体实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。域抗体，也称为“Dab”及“dAb”(术语“域抗体(DomainAntibodies)”及“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已描述于例如以下文献中：Ward,E.S.,等人:“BindingactivitiesofarepertoireofsingleimmunoglobulinvariabledomainssecretedfromEscherichiacoli”；Nature341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domainantibodies:proteinsfortherapy”；TRENDSinBiotechnology21(11):484-490(2003)；及WO2003/002609。域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。域抗体如VHH的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。用于这种CDR移植的适合支架及技术在本领域中是已知的。可互换使用的术语“表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和力”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单一可变域、或一般而言抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为对于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。在上下文中，Dll4结合组分也可称为“Dll4中和组分”。一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。抗原结合分子的特异性可基于其亲和力和/或亲抗原性(avidity)来测定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以本身已知方式测定亲和力。亲抗原性为抗原结合分子(如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有免疫球蛋白单一可变域的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者均有关：表位与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。抗原结合分子识别表位的部分称为互补位。除非另有说明，否则术语“Dll4结合分子”或“Ang2结合分子”包括如本文定义的抗Dll4或抗Ang2抗体、抗Dll4抗体或抗Ang2抗体片段、“抗Dll4抗体样分子”或“抗Ang2抗体样分子”、及与上述任一者的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单克隆抗体。术语“抗体”涵盖通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白(如单克隆抗体)、以及抗体片段或“抗体样分子”，包括单链抗体及线型抗体，例如描述于WO02/056910中的所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)；抗体样分子包括如本文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。“Ang2结合分子”或“Dll4结合分子”分别是指以下两者：单价靶结合分子(即与各自靶点的一个表位结合的分子)，以及二价或多价结合分子(即结合一个以上表位的结合分子，例如如下文定义的“双互补位”分子)。含有一个以上Ang2(或Dll4)结合免疫球蛋白单一可变域的Ang2(或Dll4)结合分子亦称为“形式化(formatted)”结合分子，其在靶结合组分内除免疫球蛋白单一可变域外也可包含连接子和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或连接聚合物(如PEG)。如本文所用的术语“双互补位Ang2(或Dll4)结合分子”或“双互补位免疫球蛋白单一可变域”是指包含如本文定义的第一免疫球蛋白单一可变域及第二免疫球蛋白单一可变域的结合分子，其中所述两个分子结合各自抗原的两个非重叠表位。双互补位结合分子由对于表位具有不同特异性的免疫球蛋白单一可变域构成。抗原结合分子(例如抗体或本发明的免疫球蛋白单一可变域)识别表位的部分称为互补位。即使是次优选的形式化结合分子，也包含识别相同或重叠表位或其各自抗原的两个相同的免疫球蛋白单一可变域或两个不同的免疫球蛋白单一可变域。在此情况下，就VEGF而言，所述两个免疫球蛋白单一可变域可与形成VEGF二聚体的两个单体中每一单体的相同或重叠表位结合。通常，本发明的结合分子将以如例如于Biacore或Kinexa分析中测量的10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且进一步更优选10E-11至10E-13的解离常数(KD)结合，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，如至少10E11ME-1的缔合常数(KA)结合。任何大于10E-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD分别结合所要结合的抗原(即VEGF或Dll4)。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchardanalysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwichcompetitionassay))及本领域中本身已知的其不同变化形式。氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或单字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在该参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或置换。在置换的情况下，所述置换将优选为保守氨基酸置换，所述保守氨基酸置换是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物学性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸置换在本领域中是公知的，例如根据WO98/49185，其中保守氨基酸置换优选是以下群组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所置换：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸置换如下：Ala被Gly或Ser置换；Arg被Lys置换；Asn被Gln或His置换；Asp被Glu置换；Cys被Ser置换；Gln被Asn置换；Glu被Asp置换；Gly被Ala或Pro置换；His被Asn或Gln置换；Ile被Leu或Val置换；Leu被Ile或Val置换；Lys被Arg、Gln或Glu置换；Met被Leu、Tyr或Ile置换；Phe被Met、Leu或Tyr置换；Ser被Thr置换；Thr被Ser置换；Trp被Tyr置换；Tyr被Trp或Phe置换；Val被Ile或Leu置换。例如相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当多肽或核酸分子已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分分离时，其被视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合的色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的多肽或核酸分子优选基本上为同质的。两个Dll4结合分子序列之间或两个Ang2结合分子序列之间的“序列一致度”指示序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO2008/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同或表示保守氨基酸置换的氨基酸的百分比。对VH域的氨基酸残基进行编号并且也可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。“亲和力成熟”的Dll4结合分子或Ang2结合分子，特别是VHH或域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对Dll4或Ang2的亲和力相比于其各自的亲本Dll4结合分子或Ang2结合分子有所增加。本发明亲和力成熟的Dll4结合分子或Ang2结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人,1992,Biotechnology10:779-783或Barbas等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813.；Shier等人,1995,Gene169:147-155；Yelton等人,1995,Immunol.155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人,1992,J.MoI.Biol.226(3):889896；KSJohnson及REHawkins,“Affinitymaturationofantibodiesusingphagedisplay”，OxfordUniversityPress1996。对于本发明，除非另有说明，则“SEQIDNO:x的氨基酸序列”包括与各自SEQIDNO:x中所显示的序列100％一致的氨基酸序列；a)与各自SEQIDNO:x中所示序列具有至少80％氨基酸一致度的氨基酸序列；b)与各自SEQIDNO:x中所示序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理症状。可用本发明的双特异性结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。如US2008/0014196中表明用Dll4拮抗剂治疗的这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌(livercancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非肿瘤性症状及肿瘤性症状两者。肿瘤性病症包括但不限于上述病症。非肿瘤性病症包括但不限于如US2008/0014196中所述用Dll4拮抗剂治疗的不欲或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增生性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生(retrolentalfibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocularneovasculardisease))、血管再狭窄(vascularrestenosis)、动静脉畸形(arteriovenousmalformations，AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病(Grave'sdisease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primarypulmonaryhypertension)、恶性肺积液(malignantpulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closedheadinjury)/外伤相关)、滑液炎症、RA中的血管翳形成(pannusformation)、骨化性肌炎(myositisossificans)、肥大性骨形成(hypertropicboneformation)、骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycysticovariandisease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第3间隔体液疾病(3rdspacingoffluiddisease)(胰腺炎、间隔综合征(compartmentsyndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn'sdisease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、发炎性肠病、肾病综合征、不欲或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilicjoint)、肥厚性瘢痕(hypertrophicscar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Webersyndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生(pyogenicgranulomaretrolentalfibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascularadhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardialeffusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleuraleffusion)。发明详述在第一方面中，本发明涉及包含至少一个Dll4结合组分和至少一个Ang2结合组分的双特异性结合分子。在一项优选实施方案中，本发明涉及包含至少一个Dll4结合组分和至少一个Ang2结合组分的双特异性结合分子，其还包含至少一种其他结合组分，优选血清白蛋白结合组分(血清白蛋白结合分子)。在一项优选实施方案中，本发明的结合分子的血清白蛋白结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自如SEQIDNO:522、525、528、531、534、537、或540所示氨基酸序列的氨基酸序列。更优选地，所述血清白蛋白结合组分的一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含：a.CDR3，其具有选自SEQIDNO:522、525、528、531、534、537、或540所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b.CDR1，其具有选自SEQIDNO:520、523、526、529、532、535、或538所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列；c.CDR2，其具有选自SEQIDNO:521、524、527、530、533、536、或539所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列。在更优选实施方案中，所述血清白蛋白结合组分的一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH，优选具有选自如SEQIDNO:98或519所示的氨基酸序列。根据优选实施方案，所述Dll4结合组分和所述Ang2结合组分分别包含至少一个Dll4结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个Ang2结合免疫球蛋白单一可变域。在优选方面中，所述Dll4结合组分和所述Ang2结合组分各分别包含至少一个Ang2结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个Dll4结合免疫球蛋白单一可变域，其中每一个所述免疫球蛋白单一可变域具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区。因此，包含于本发明的双特异性结合分子的抗Dll4和/或抗Ang2组分可包含两个(或多个)抗Dll4(或分别为抗Ang2)免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域针对Dll4(或Ang2)靶点内的不同表位。因此，双特异性结合分子中的两个免疫球蛋白单一可变域具有不同的抗原特异性，且因此具有不同CDR序列。因为两个免疫球蛋白单一可变域包含两个不同互补位，也分别将这样的二价结合分子命名为“双互补位单域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由单域抗体组成)，或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。在本发明的双特异性结合分子中，一种或两种结合分子可以为二价；例如Ang2结合组分可为双互补位而Dll4结合组分可为一个免疫球蛋白单一可变域，或者Ang2结合组分可为一个免疫球蛋白单一可变域而Dll4结合组分可为双互补位。在本发明的双特异性结合分子中，优选包含二价Ang2结合免疫球蛋白单一可变域的Ang2结合组分，例如双互补位VHH。Dll4结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域，其中所述CDR3具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列：a)SEQIDNO:1至166和458，b)SEQIDNO:333至353，或c)SEQIDNO:375至395。氨基酸序列a)，选自SEQIDNO:1至166和458的第一组，作为部分序列包含于选自表5和SEQIDNO:167至332和459所示的第二组序列的相应氨基酸序列中。氨基酸序列b)，选自SEQIDNO:333至353的第一组，作为部分序列包含于选自表16-A和SEQIDNO:354至374所示的第二组序列的相应序列中。氨基酸序列c)，选自SEQIDNO:375至395的第一组，作为部分序列包含于选自表16-B和SEQIDNO:396至416所示的第二组序列的相应序列中。在第二方面中，所述Dll4结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列：a)SEQIDNO:1至166和458，b)SEQIDNO:333至353，或c)SEQIDNO:375至395。在另一方面中，该Dll4结合组分的免疫球蛋白单一可变域包含：a)CDR3，其具有选自SEQIDNO:1至166和458所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b)CDR1及CDR2，其具有如表5所示的作为部分序列包含于选自SEQIDNO:167至332和459所示的第二组氨基酸序列的序列；其中所述对于SEQIDNO:1至166的第一组的SEQIDNO:x对应于所述第二组的SEQIDNO:y，其中y＝x+166。在另一方面中，所述免疫球蛋白单一可变域包含：a)CDR3，其具有选自SEQIDNO:333至353所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b)CDR1及CDR2，其具有如表16-A所示的作为部分序列包含于选自SEQIDNO:354至374所示的第二组序列的序列中的氨基酸序列；其中所述第一组的SEQIDNO:x对应于所述第二组的SEQIDNO:y，其中y＝x+21。在另一方面中，所述免疫球蛋白单一可变域包含：a)CDR3，其具有选自SEQIDNO:375至395所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b)CDR1及CDR2，其具有如表16-B所示的作为部分序列包含于选自SEQIDNO:396至416所示的第二组序列的序列中的氨基酸序列；其中所述第一组的SEQIDNO:x对应于所述第二组的SEQIDNO:y，其中y＝x+21。在一项优选实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域为VHH。在另一方面中，VHH具有选自如表5和SEQIDNO:167至332和459所示氨基酸序列的氨基酸序列。Ang2结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域，其中所述CDR3具有选自如SEQIDNO:491、494、497、500、503、506、509、512、515、或518所示氨基酸序列的氨基酸序列。在第二方面中，该Ang2结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自如SEQIDNO:491、494、497、500、503、506、509、512、515、或518所示氨基酸序列的氨基酸序列。在另一方面中，该Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域包含：a.CDR3，其具有选自SEQIDNO:491、494、497、500、503、506、509、512、515、或518(也见表36)所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b.CDR1，其具有如表22-A或28所示的作为部分序列包含于选自SEQIDNO:489、492、495、498、501、504、507、510、513、或516(也见表36)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列；c.CDR2，其具有如表22-A或28所示的作为部分序列包含于选自SEQIDNO:490、493、496、499、502、505、508、511、514、或517(也见表36)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列。优选地，Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域为VHH，优选具有选自如SEQIDNO:479、480、481、482、483、484、485、486、487、或488所示氨基酸序列的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域是通过使本文所述的免疫球蛋白单一可变域的亲和力成熟或人源化而获得。类似地，本发明也涉及Ang2结合VHH，其通过使本文所述的Ang2结合组分的VHH的亲和力成熟或人源化而获得。因此本发明也涉及具有选自SEQIDNO:479、480、481、482、483、484、485、486、487、或488所示氨基酸序列的氨基酸序列的Ang2结合VHH。在治疗应用方面具有改良性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的Dll4结合组分和/或Ang2结合组分，可通过如下技术而从本发明的各别Dll4结合组分或Ang2结合组分获得：亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装，及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。优选地，具有增强的亲和力的本发明的Dll4结合组分是通过另一Dll4结合组分的亲和力成熟来获得的，就亲和力成熟分子而言另一Dll4结合组分表示“亲本”Dll4结合组分。Ang2结合组分也同样如此。因此，在另一项优选实施方案中，本发明的Dll4结合分子或Ang2结合分子是通过使上述亲本免疫球蛋白单一可变域的亲和力成熟获得的免疫球蛋白单一可变域。在另一项优选实施方案中，本发明涉及通过使VHH的亲和力成熟获得的免疫球蛋白单一可变域。举例而言，适合亲和力成熟的亲本Dll4结合组分为上述具有SEQIDNO:167至332和459所示氨基酸序列的VHH。举例而言，适合亲和力成熟的亲本Ang2结合组分为上述具有SEQIDNO:479、480、481、482、483或484所示氨基酸序列的VHH。因此，本发明也涉及Ang2结合分子，其通过上述定义的VHH的亲和力成熟和/或序列最优化而获得，例如涉及通过使具有SEQIDNO:482、483、484、485、486、487、488所示氨基酸序列的VHH序列最优化获得的VHH。用于产生前者VHH的“源”氨基酸序列示于SEQIDNO:479、480或481。此外，这些氨基酸序列为可应用于本发明的结合分子的适合的Ang2结合组分。如本文所述，本发明的结合分子优选包含至少一种血清白蛋白结合组分。因此，特别优选的结合分子具有至少一种Dll4的结合组分，至少一个Ang2结合组分和至少一种血清白蛋白结合组分。该三种结合组分的顺序可以是任何可能的顺序，例如图16或23所示的顺序，例如，Dll4结合组分、Ang2结合组分或血清白蛋白结合组分可以是N-末端或C-末端。值得注意的是，图16的图例中提及的“00042”、“00045”或“00050”代表Ang2结合组分，而“00018”代表Dll4结合组分和“ALB11”代表血清白蛋白结合组分。没有将其中任何一个解释为特定的序列，而是代表通常用于本发明的结合分子的可能构成的Ang2结合组分、Dll4结合组分和血清白蛋白结合组分。然而，优选血清白蛋白结合组分在Dll4结合组分和Ang2结合组分之间(或反之)，而且特别优选至少一个Ang2结合组分是N-末端，后接至少一种血清白蛋白结合组分，再接至少一个Dll4结合组分在C-末端。已显示这种安排是特别有效的。因此，在一个优选的方面，本发明涉及结合分子，其包含至少一个Dll4结合组分、至少一个Ang2结合组分和至少一种具有选自SEQIDNO:460至478所示的氨基酸序列的氨基酸序列的血清白蛋白结合组分。在本文中使用时，“至少一种”结合组分(Ang2、Dll4或血清白蛋白)包括本发明的结合分子可包含一种、两种、三种、四种或五种Ang2结合组分、Dll4结合组分和/或血清白蛋白结合组分(即实体/单元)，其优选由如本文所述的免疫球蛋白单一可变域代表。在另一项优选实施方案中，本发明涉及已通过使氨基酸序列显示于SEQIDNO:197中的VHH亲和力成熟而获得的Dll4免疫球蛋白单一可变域。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域源自具有SEQIDNO:197所示氨基酸序列的VHH，且选自具有SEQIDNO:354至374所示氨基酸序列的免疫球蛋白单一可变域。在一项优选实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域为具有SEQIDNO:358所示氨基酸序列的VHH。在一项进一步更优选的实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域通过使具有SEQIDNO:358所示氨基酸序列的VHH人源化而获得。在另一项优选实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域为具有SEQIDNO:356所示氨基酸序列的VHH。在一项进一步更优选的实施方案中，本发明涉及已通过使具有SEQIDNO:356所示氨基酸序列的VHH人源化而获得的免疫球蛋白单一可变域。在另一项优选实施方案中，本发明涉及已通过使具有SEQIDNO:224所示氨基酸序列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域源自具有SEQIDNO:224所示氨基酸序列的VHH，且选自具有SEQIDNO:396至416所示氨基酸序列的免疫球蛋白单一可变域。在另一项优选实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域为具有SEQIDNO:402所示氨基酸序列的VHH。在一项进一步更优选的实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域通过使具有SEQIDNO:402所示氨基酸序列的VHH人源化而获得。在另一项优选实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域为具有SEQIDNO:416所示氨基酸序列的VHH。在一项进一步更优选的实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域通过使具有SEQIDNO:416所示氨基酸序列的免疫球蛋白单一可变域人源化而获得。在另一项优选实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域为具有SEQIDNO:407所示氨基酸序列的VHH。在一项进一步更优选的实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变域通过使具有SEQIDNO:413所示氨基酸序列的免疫球蛋白单一可变域人源化而获得。根据另一实施方案，免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的VH域。在另一实施方案中，本发明或存在于本发明多肽中的代表性种类的Dll4和/或Ang2结合免疫球蛋白单一可变域具有对应于已经“骆驼化”的天然存在VH域的氨基酸序列的氨基酸序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在的可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考WO1994/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓的骆驼科印记残基处(也参见例如WO1994/04678)。这些“人源化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO2006/040153的第46页及第98页及WO2006/122786的第107页。本发明的Dll4结合组分或Ang2结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域和/或含有其的多肽)分别对Dll4或Ang2具有特异性，因为其包含与Dll4分子或Ang2分子内的一个或多个表位分别特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。Dll4结合组分和/或Ang2结合组分分别对其抗原Dll4或Ang2的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。关于抗原Dll4，本发明的Dll4结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域)在物种方面不受限制。因此，若欲用于人的治疗目的，则本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽优选结合至人Dll4。然而，结合至另一哺乳动物物种的Dll4的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种的Dll4结合的本发明的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的Dll4发生交叉反应。例如，结合人Dll4的本发明的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的Dll4和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(例如本文提及的物种及动物模型)的Dll4的交叉反应性。表现所述交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物开发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。对于Ang2同样如此。此外，本发明的Dll4结合组分不限于其所针对的Dll4的特定域或Dll4的抗原决定簇或不由其所针对的Dll4的特定域或Dll4的抗原决定簇限定。优选地，对于与除人以外的物种(欲在治疗性Dll4拮抗剂的开发期间将该物种用作动物模型)的一种或多种Dll4分子的交叉反应性，Dll4结合组分识别与人Dll4具有高一致度的感兴趣的Dll4区域中的表位。举例而言，对于使用小鼠模型，本发明的免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于EGF-2域内的表位，该EGF-2域在人与小鼠之间显示较高的一致度。对于Ang2同样如此。因此，根据一项优选实施方案，本发明涉及Dll4结合组分，具体涉及免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域选自与完全或部分地包含于EGF-2域内的表位结合的免疫球蛋白单一可变域，该EGF-2域对应于SEQIDNO:417的氨基酸残基252-282。若本发明的多肽为如本文所定义的包含多于一个本发明的免疫球蛋白单一可变域的双互补位分子，则所述免疫球蛋白单一可变域组分中的至少一种与上文所定义的EGF-2域内的表位结合。优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM(如实施例5.7中所述的通过表面等离子共振分析所测定)的亲和力结合Dll4和/或Ang2。优选地，如竞争ELISA分析(如实施例5.1.中所述)中所测得，本发明的免疫球蛋白单一可变域具有的IC50值在10-6至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内，更优选在10-8至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内、且进一步更优选在10-9至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内。根据本发明的一非限制性但优选的实施方案，本发明的Dll4结合免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽以10-5至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且优选10-7至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且更优选10-8至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下的解离常数(KD)，和/或以至少107M-1、优选至少108M-1、更优选至少109M-1，例如至少1012M-1的缔合常数(KA)；且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD分别结合Dll4或VEGF。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对Dll4的KD及KA值。对于Ang2同样如此。在另一实施方案中，本发明涉及包含两个或两个以上在不同非重叠表位处分别结合抗原Dll4或Ang2的免疫球蛋白单一可变域的Dll4结合组分。更具体地，本发明的该多肽基本上由以下组成或包含以下：(i)分别特异性结合Dll4或Ang2的第一表位的第一免疫球蛋白单一可变域及(ii)分别特异性结合Dll4或Ang2的第二表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中Dll4/Ang2的该第一表位及Dll4/Ang2的该第二表位不为同一表位。换言之，本发明的该多肽包含以下或基本上由以下组成：两个或两个以上针对至少两个存在于Dll4/Ang2中的不同表位的免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域以能够同时结合Dll4/Ang2的方式彼此连接。在此意义中，本发明的多肽也可视为“二价”或“多价”免疫球蛋白构建体(construct)，且尤其视为“多价免疫球蛋白单一可变域构建体”，因为该多肽含有至少两个Dll4/Ang2结合位点。本发明的该Dll4结合组分包括(至少)两个抗Dll4免疫球蛋白单一可变域，其中(该)两个免疫球蛋白单一可变域是针对Dll4分子内的不同表位。因此，这两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原特异性且因此具有不同CDR序列。为此，由于所述两个免疫球蛋白单一可变域包括两个不同互补位，本发明的这些多肽在本文中也分别称为“双互补位多肽”、或“双互补位单域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由单域抗体组成)或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。对于Ang2同样如此，除必要的变通之外。根据本发明的一具体实施方案，若本发明的多肽包括多于两个(即三个、四个或甚至四个以上)抗Dll4免疫球蛋白单一可变域，则至少两个所述抗Dll4免疫球蛋白单一可变域是针对Dll4分子内的不同表位，其中任何另一免疫球蛋白单一可变域可结合存在于Dll4分子中的这两个不同表位的任一个和/或其他表位。对于Ang2同样如此，除必要的变通之外。根据本发明，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可彼此独立地为VH或VHH，和/或如本文定义的任何其它种类的免疫球蛋白单一可变域，例如VL域，条件是这些免疫球蛋白单一可变域将分别结合抗原(即Dll4或Ang2)。本发明主要对于Dll4结合组分提供结合组分的详细描述。然而，本文对于Dll4结合组分所概述的全部特征和选项同样适用于Ang2结合组分，除必要的变通之外。根据优选实施方案，存在于双特异性结合分子中的结合分子(Ang2结合组分中的Ang2结合分子或Dll4结合组分中的Dll4结合分子或两个相邻的Ang2结合组分和Dll4结合组分)可彼此直接连接(即不使用连接子)或通过连接子连接。连接子优选为连接肽且将经选择以允许两个不同的结合分子与靶点的每个非重叠表位结合，无论位于一个相同靶点分子中，或位于两个不同分子中。对于双互补位结合分子，Ang2结合组分或Dll4结合组分内连接子的选择将尤其取决于表位，且具体地取决于免疫球蛋白单一可变域所结合靶点上的表位之间的距离，且本领域技术人员基于本文公开的内容，任选在某些有限程度的常规实验之后将了解此选择。两个结合分子(两个VHH或两个域抗体，或一个VHH和一个域抗体)或两种结合组分可分别通过另一VHH或域抗体而彼此连接(在这些结合分子中，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可直接或通过适合连接子连接至所述另一免疫球蛋白单一可变域)。所述另一VHH或域抗体可例如为提供增加的半衰期的VHH或域抗体。例如，后者的VHH或域抗体可为能够结合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白)或(人)转铁蛋白(transferrin)的VHH或域抗体。或者，结合各自靶点的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可(直接或通过适合连接子)串联连接，且所述另一VHH或域抗体(其可提供增加的半衰期)可直接或通过连接子连接至上述两个或两个以上免疫球蛋白序列之一。本文中也描述了与本发明的具体多肽相关、并且例如但不限于包含一定氨基酸序列的合适的连接子，所述氨基酸序列长度优选为9个或9个以上氨基酸、更优选为至少17个氨基酸，例如约20-40个氨基酸。然而，上限并不关键，该上限是由于与例如这些多肽的生物医药生产的便利性的相关的原因而选择的。连接序列可为天然存在序列或非天然存在序列。若用于治疗目的，则在给予受试者的本发明的双特异性结合分子中所述连接子优选为非免疫原性的。一组适用连接序列为如WO1996/34103及WO1994/04678中所述源自重链抗体铰链区的连接子。其他实例为聚丙氨酸连接序列，例如Ala-Ala-Ala。连接序列的其他优选实例为不同长度的Gly/Ser连接子，例如(glyxsery)z连接子，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3和(gly3ser2)3。连接子的一些非限制性实例显示于图40及48中，例如以下连接子：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS；SEQIDNO:90)；GGGGSGGGS(9GS；SEQIDNO:91)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS；SEQIDNO:92).若双特异性结合分子通过聚合物例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分的连接进行修饰，则连接序列优选包括允许连接区域中的此修饰(例如聚乙二醇化)的氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸。适用于聚乙二醇化的连接子的实例为：GGGGCGGGS(“GS9,C5”,SEQIDNO:93)；GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS25,C5”,SEQIDNO:94)GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG(“GS27,C14”,SEQIDNO:95),GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35,C15”,SEQIDNO:96)，和GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35,C5”,SEQIDNO:97)。此外，连接子也可为例如于WO2004/081026中所示的聚(乙二醇)部分。在另一实施方案中，免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一个或两个连接子)，例如另一多肽来彼此连接，该另一多肽在一项优选但非限制性实施方案中可为如上所述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可为基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性质的生物效应或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。例如但不限于，该部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。根据一项优选实施方案，尤其在欲使用或用作治疗剂时，本发明的双特异性结合分子包括延长本发明的多肽在患者血清或其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”定义为(经修饰)多肽的血清浓度例如由于天然机制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合而在体内降低50％所花费的时间。更具体地，该半衰期延长部分可共价连接至或融合至免疫球蛋白单一可变域且可为(但不限于)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或羟乙基淀粉(HES)衍生物。在另一实施方案中，本发明的双特异性结合分子包含与存在于血液中的抗原结合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、纤维蛋白原(fibrinogen)或转铁蛋白，因而使所得本发明的多肽的体内半衰期增加。根据一项特别优选的实施方案，该部分为白蛋白结合免疫球蛋白且尤其优选为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白结合VHH域。若欲在人中使用，则该白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域优选结合人血清白蛋白且优选为人源化白蛋白结合VHH域。结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域在本领域中是已知的，且进一步详述于例如WO2006/122786中。具体地，适用的白蛋白结合VHH为ALB1及其人源化对应物ALB8(WO2009/095489)。然而，也可使用在以上专利公开中提及的其他白蛋白结合VHH域。具体适用的白蛋白结合VHH域为由SEQIDNO:98或519所示的氨基酸序列组成的或含有该氨基酸序列的ALB8。根据本发明的另一实施方案，优选呈VHH形式的两个免疫球蛋白单一可变域可融合至血清白蛋白分子，如例如WO01/79271及WO03/59934中所述。如例如于WO2001/79271中所述，融合蛋白可通过以下常规重组技术获得：将编码血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至编码双特异性结合分子的DNA，将所得构建体插入适于在所选宿主细胞(例如酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))或细菌细胞)中表达的质粒中，接着用融合的核苷酸序列转染该宿主细胞，并使之在合适条件下生长。适用的HSA的序列如SEQIDNO:99中所示。根据另一实施方案，本发明的多肽的半衰期延长修饰(此修饰亦降低多肽的免疫原性)包含连接药理学上可接受的合适的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何适合形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体及抗体片段(包括但不限于域抗体及scFv片段)的聚乙二醇化；参考例如：Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv.DrugDeliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；及WO2004/060965。用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售的，例如可从NektarTherapeutics,USA或NOFCorporation,Japan购得，所述试剂例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。优选使用(特别是通过半胱氨酸残基的)定点聚乙二醇化(参见例如Yang等人,ProteinEngineering16,761-770(2003))。例如，出于此目的，PEG可连接至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，本发明的多肽可经修饰以便适当引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用对本领域技术人员而言本身已知的蛋白工程的技术。优选地，对于本发明的多肽，使用PEG的分子量大于5kDa(例如大于10kDa)且小于200kDa(例如小于100kDa)，例如在20kDa-80kDa范围内。关于聚乙二醇化应注意，一般而言，本发明也优选涵盖已在一个或多个氨基酸位置处经聚乙二醇化的任何双特异性结合分子，该聚乙二醇化：(1)增加体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供对于聚乙二醇化本身已知的一种或多种其他有益性质；(4)基本上不影响多肽对其靶点的亲和力(例如通过本领域中所述的适合分析所测定，不使该亲和力降低50％以上、且更优选不使之降低10％以上)；和/或(5)不影响本发明的双特异性结合分子的任何其他所需性质。适合的PEG群组及用于特异性或非特异性与之连接的方法将为本领域技术人员所了解。用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售，例如可从NektarTherapeutics,USA或NOFCorporation,Japan购得，所述试剂例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。根据本发明的一项尤其优选的实施方案，本发明的聚乙二醇化多肽包括一个具有分子量为40kDa或60kDa的线型PEG的PEG部分，其中该PEG部分在连接区域中连接至所述多肽，且特别是在如SEQIDNO:93中所示的GS9连接肽的5位处、在如SEQIDNO:95中所示的GS27连接肽的14位处、或在如SEQIDNO:96中所示的GS35连接肽的15位处、或在如SEQIDNO:97中所示的35GS连接肽的5位处的Cys残基处连接至所述多肽。如以下化学式中所示，本发明的双特异性结合分子可经如上提及的PEG试剂之一(例如ME-400MA”)来聚乙二醇化：含有连接子和/或半衰期延长官能团的双特异性结合分子显示于SEQIDNO:81及图48中。根据另一实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。存在于本发明的双特异性结合分子中的免疫球蛋白单一可变域的序列也可具有对应于已经“骆驼化”的天然存在VH域的氨基酸序列的序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考WO94/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓骆驼科印记残基处(也参见例如WO94/04678)。这些“人源化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO2006/040153的第46页及第98页及WO2006/122786的第107页。所述结合组分分别对Ang2或Dll4具有特异性，因为在一项优选实施方案中其包含分别与Ang2分子内或Dll4分子内的一个或多个表位特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。结合组分对其抗原Ang2或Dll4的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。关于抗原Ang2或Dll4，免疫球蛋白单一可变域在物种方面分别不受限制。因此，若欲用于人中的治疗目的，则免疫球蛋白单一可变域优选分别结合人Ang2或人Dll4。然而，分别结合另一哺乳动物物种的Ang2或Dll4的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种形式的Ang2或Dll4结合的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的各别抗原发生交叉反应。例如，结合人抗原的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的各别抗原和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于可通过抑制Ang2而调节的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(例如本文提及的物种及动物模型)的抗原的交叉反应性。表现这种交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物研发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。此外，所述结合组分不限于其所针对的抗原的特定域或抗原决定簇或不由其所针对的抗原的特定域或抗原决定簇限定。优选地，对于与除人以外的物种(其欲在治疗性Ang2/Dll4拮抗剂的研发期间将其用作动物模型)的一种或多种抗原分子的交叉反应性，结合组分识别与人抗原具有高一致度的各别抗原的区域中的表位。举例而言，对于使用小鼠模型，本发明的双特异性结合分子中含有的抗Ang2免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于Ang2的EGF-2域内的表位，该EGF-2域在人与小鼠之间显示较高的一致度。因此，根据一项优选实施方案，本发明的双特异性结合分子包含Dll4结合分子，其为选自与完全或部分地包含于EGF-2域内的表位结合的免疫球蛋白单一可变域，该EGF-2域对应于SEQIDNO:101的氨基酸残基252-282。在另一方面中，本发明涉及编码本发明的双特异性结合分子的核酸分子。这些核酸分子在本文中也称为“本发明的核酸”且也可呈如本文定义的遗传构建体形式。本发明的核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如具有已特定适于在预定宿主细胞或宿主有机体中表达的密码子用途(codonusage)的DNA)。根据本发明的一项实施方案，本发明的核酸呈如上定义的基本上分离的形式。本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供双特异性结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的调控组件(例如启动子、增强子、终止子等)。这些组件及其鉴于特测序列在特定宿主中的表达的选择为本领域技术人员的常识。对本发明双特异性结合分子的表达有用或必需的调控组件及其他组件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子(integrationfactor)、选择标记物、前导序列、报告基因等公开于例如WO2006/040153的第131-133页。本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的双特异性结合分子和/或含有本发明的核酸的宿主细胞。根据一项特别优选的实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞；其他适用细胞为酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。适合真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞。适合酵母细胞包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、海拉细胞(HeLacell)、COS细胞等。然而，也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。本发明还提供制造本发明的双特异性结合分子的方法，这些方法通常包含以下步骤：-在允许表达本发明的双特异性结合分子的条件下培养包含能够编码双特异性结合分子的核酸的宿主细胞；及-从培养物回收或分离由宿主细胞表达的多肽；及-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的双特异性结合分子。对于工业规模生产而言，优选的宿主有机体包括适于大规模表达、生产及发酵，且特别是适于大规模医药表达、生产及发酵的大肠杆菌菌株、巴斯德毕赤酵母菌株及酿酒酵母菌株。具体表达系统的选择部分取决于某些翻译后修饰的要求，更特别是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本发明的双特异性结合分子的产生，必需使用能够使所表达蛋白糖基化的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员将了解所获得的糖基化样式(即所连接残基的种类、数目及位置)将取决于用于表达的细胞或细胞株。本发明的双特异性结合分子可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞溶质中、在胞间质(periplasma)中或在包涵体(inclusionbody)中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。在另一方面中，本发明涉及具有包含于抗Dll4-VHH的CDR3的氨基酸序列的肽及编码该肽的核酸分子，其中所述氨基酸序列分别选自SEQIDNO:1-166及458、SEQIDNO:333-353、或SEQIDNO:375-395所示的序列。这些肽对应于源自本发明的VHH的CDR3。这些肽，特别是编码这些肽的核酸分子，适用于CDR移植以置换免疫球蛋白链中的CDR3，或适用于插入非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制剂、DNA结合蛋白、细胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、双硫桥式肽(disulfide-bridgedpeptide)、脂质运载蛋白(lipocalin)或抗运载蛋白(anticalin)中，从而赋予此支架靶结合性质。CDR移植方法在本领域中是公知的且已广泛使用，例如用于使抗体人源化(此通常包含将啮齿动物抗体的CDR移植在人抗体的Fv框架上)。为了获得含有本发明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根据如例如由Daugherty等人,1991,NucleicAcidsResearch,第19卷,9,2471-2476所述的分子生物学标准方法，例如通过基因合成、通过寡核苷酸退火或借助于重叠PCR片段来获得编码此分子的DNA。将VHHCDR3插入非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人,2004,ProteinScience,13,1882-1891公开。本发明还涉及一种产物或组合物，其含有或包含至少一种本发明的双特异性结合分子及任选的这些组合物的本身已知的一种或多种其他组分，即视组合物的预定用途而定。对于药物用途而言，本发明的双特异性结合分子或含有本发明的双特异性结合分子的多肽可调配成药物制剂或组合物，其包含至少一种本发明的双特异性结合分子及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂及任选的一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。借助于非限制性实例，这类调配物可呈适于口服给药、肠胃外给药(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部给药或通过吸入、皮肤贴剂、植入物、栓剂等给药的形式。合适的给药形式(取决于给药方式，可为固体、半固体或液体)及用于其制备的方法及载体将为本领域技术人员所了解且进一步在本文中公开。因此，在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其含有至少一种双特异性结合分子，特别是一种本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有该免疫球蛋白单一可变域的多肽，及至少一种适合的载体、稀释剂或赋形剂(即适于药物用途)及任选一种或多种其他活性物质。本发明的双特异性结合分子可以以本身已知的任何适合方式调配及给予：特别是对于免疫球蛋白单一可变域，例如参考WO2004/041862、WO2004/041863、WO2004/041865、WO2004/041867及WO2008/020079，以及标准手册，例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPublishingCompany,USA(1990)；Remington,theScienceandPracticeofPharmacy,第21版,LippincottWilliamsandWilkins(2005)；或theHandbookofTherapeuticAntibodies(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。例如，本发明的免疫球蛋白单一可变域可以以用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv片段及双特异抗体)及其他药物活性蛋白的本身已知的任何方式调配及给予。这些调配物及制备这些调配物的方法将为本领域技术人员所了解，且例如包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或局部(即经皮或皮内)给药的制剂。用于肠胃外给药的制剂可例如为适于输注或注射的灭菌溶液、混悬液、分散液或乳液。适用于这些制剂的载剂或稀释剂，例如包括(但不限于)灭菌水及医药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、葡萄糖溶液及汉克氏溶液(Hank'ssolution)；含水油(wateroil)；甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及矿物油、动物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其适合的混合物。通常将优选水性溶液或混悬液。因此，本发明的双特异性结合分子可组合药学上可接受的媒介物(例如惰性稀释剂或可吸收食用载体)而全身给予(例如口服给予)。对于口服治疗性给药而言，可将本发明的双特异性结合分子与一种或多种赋形剂组合且以可摄取片剂、口腔片、含片、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。这些组合物及制剂应含有至少0.1％的本发明的Dll4结合分子。其在组合物及制剂中的百分比当然可变化且宜介于既定单位剂型重量的约2％与约60％之间。本发明的双特异性结合分子在用于这些治疗的组合物中的量为获得有效剂量浓度的量。所述片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂及甜味剂或矫味剂，例如在WO08/020079的第143-144页上所提及的。当单位剂型为胶囊剂时，其除以上类型的物质外也可含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。可存在各种其他物质作为包衣或者用以修饰固体单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可由明胶、蜡、虫胶(shellac)或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有本发明的双特异性结合分子、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、色素及矫味剂(例如樱桃或橙香料)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何物质均应为药学上可接受且在所用量下基本上无毒。此外，本发明的双特异性结合分子可并入持续释放制剂及装置中。用于口服给药的制剂及调配物也可具有将使本发明构建体抵抗胃环境且进入肠中的肠溶包衣。更一般地，用于口服给药的制剂及调配物可经适当调配以递送进入胃肠道的任何所需部分中。此外，可使用适合的栓剂以递送进入胃肠道中。如WO2008/020079第144及145页上所进一步公开，本发明的双特异性结合分子也可通过输注或注射而经静脉内或腹膜内给予。对于本发明的双特异性结合分子的局部给药而言，如WO2008/020079第145页上所进一步公开，一般需要将其与皮肤可接受的载体(其可为固体或液体)组合而以组合物或调配物形式给予皮肤。一般而言，本发明的双特异性结合分子在液体组合物(例如洗剂)中的浓度将为约0.1-25重量％、优选约0.5-10重量％。在半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度将为约0.1-5重量％、优选约0.5-2.5重量％。本发明的双特异性结合分子的治疗中需要的量不仅依所选特定双特异性结合分子变化，而且也依给药途径、所治疗症状特性及患者年龄及症状而变化且将最终由当值医师或临床医师酌情决定。此外，本发明的双特异性结合分子的剂量视靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。所需剂量宜呈现为单次剂量或以适当间隔给予的分次剂量，例如呈每天两次、三次、四次或四次以上的亚剂量形式。所述亚剂量自身可经进一步划分，例如分成大量单个的松散间隔的给药；例如来自吹入器(insufflator)的多次吸入或通过对眼中多次滴眼。给药方案可包括长期每天治疗。“长期”是指持续时间至少两周且优选数周、数月或数年。该剂量范围的必要修改可由本领域的一般技术人员仅使用本文教导的常规实验来确定。参见Remington'sPharmaceuticalSciences(Martin,E.W.第4版),MackPublishingCo.,Easton,PA。若发生任何并发症，则该剂量也可由单个的医师来调整。根据另一实施方案，本发明涉及本发明的双特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽)的用途，其用于治疗目的，例如-尤其在人中用于预防、治疗和/或减轻与Dll4介导的和/或Ang2相关的血管生成作用有关或可通过用本发明的双特异性结合分子调节Notch信号转导通路和/或Tie2信号转导通路来预防、治疗或减轻的病症、疾病或症状，-在治疗需要此治疗的患者的方法中，该方法包含给予有需要的个体药物活性量的至少一种本发明的双特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)或含有所述本发明的双特异性结合分子的药物组合物；-用于制备预防、治疗或减轻与Dll4和/或Ang2介导的血管生成作用相关的病症、疾病或症状的药物；-作为用于以上目的药物组合物或药物中的活性成分。根据一个具体的方面，该病症、疾病或症状为如本文定义的癌症或癌性疾病。根据另一方面，疾病为与Dll4和/或Ang2介导的血管生成作用相关或可通过用双特异性结合分子调节Notch信号转导通路和/或Tie2信号转导通路来治疗或减轻的眼病。视欲治疗的癌性疾病而定，本发明的双特异性结合分子可单独或组合一种或多种特别是选自以下的其他治疗剂加以使用：化学治疗剂(如DNA损伤剂)，或抑制癌细胞中血管生成、信号转导通路或有丝分裂检查点(mitoticcheckpoint)的治疗活性化合物。其他治疗剂可任选作为同一药物制剂的组分与双特异性结合分子的给药同时给予、或在该双特异性结合分子的给药之前或之后给予。在某些实施方案中，所述其他治疗剂可为(而不限于)一种或多种选自以下物质的抑制剂：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、Ras、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。其他治疗剂的其他实例为CDK、Akt、src/bcrabl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90的抑制剂；刺猬拮抗剂(hedgehogantagonist)；JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho的抑制剂；wnt信号转导的抑制剂或泛素化(ubiquitination)通路的抑制剂或Notch信号转导通路的另一抑制剂。Aurora抑制剂的实例为(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。PLK抑制剂的一个实例为GSK-461364。raf抑制剂的实例为BAY-73-4506(也为VEGFR抑制剂)、PLX4032、RAF-265(此外也为VEGFR抑制剂)、索拉非尼(sorafenib)(此外也为VEGFR抑制剂)及XL281。KSP抑制剂的实例为伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。src和/或bcr-abl抑制剂的实例为达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL228(也为IGF-1R抑制剂)、尼洛替尼(nilotinib)(也为PDGFR及cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(也为cKit抑制剂)及NS-187。PDK1抑制剂的一个实例为BX-517。Rho抑制剂的一个实例为BA-210。PI3激酶抑制剂的实例为PX-866、BEZ-235(也为mTor抑制剂)、XL418(也为Akt抑制剂)、XL-147及XL765(也为mTor抑制剂)。cMet或HGF的抑制剂的实例为XL-184(也为VEGFR、cKit、Flt3的抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也为VEGFR的抑制剂)、MGCD-265(也为VEGFR、Ron、Tie2的抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。c-Myc抑制剂的一个实例为CX-3543。Flt3抑制剂的实例为AC-220(也为cKit及PDGFR的抑制剂)、KW2449、来他替尼(lestaurtinib)(也为VEGFR、PDGFR、PKC的抑制剂)、TG-101348(也为JAK2的抑制剂)、XL-999(也为cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR的抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(也为PDGFR、VEGFR及cKit的抑制剂)及坦度替尼(tandutinib)(也为PDGFR及cKit的抑制剂)。HSP90抑制剂的实例为坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504及CNF2024。JAK/STAT抑制剂的实例为CYT-997(其也与微管蛋白相互作用)、TG101348(也为Flt3的抑制剂)及XL-019。Mek抑制剂的实例为ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL518。mTor抑制剂的实例为替西罗莫司(temsirolimus)、AP-23573(其也作为VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(此外也为VEGF抑制剂)、XL-765(也为PI3激酶抑制剂)及BEZ-235(也为PI3激酶抑制剂)。Akt抑制剂的实例为哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立滨(triciribine)。cKit抑制剂的实例为AB-1010、OSI-930(也作为VEGFR抑制剂)、AC-220(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、坦度替尼(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、阿西替尼(也为VEGFR及PDGFR的抑制剂)、XL-999(也为Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR的抑制剂)、舒尼替尼(也为Flt3、PDGFR、VEGFR的抑制剂)、及XL-820(也作为VEGFR及PDGFR抑制剂)、伊马替尼(也为bcr-abl抑制剂)、尼洛替尼(也为bcr-abl及PDGFR的抑制剂)。刺猬拮抗剂的实例为IPI-609及CUR-61414。CDK抑制剂的实例为塞来昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG024322。蛋白酶体抑制剂的实例为硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfilzomib)及NPI-0052(也为NFκB的抑制剂)。NFκB通路抑制剂的一个实例为NPI-0052。泛素化通路抑制剂的一个实例为HBX-41108。在优选实施方案中，所述其他治疗剂为抗血管生成剂。抗血管生成剂的实例为FGFR、PDGFR及VEGFR或各自配体的抑制剂(例如VEGF抑制剂，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗体贝伐珠单抗(bevacizumab))及沙立度胺(thalidomide)，这些药物选自(但不限于)贝伐珠单抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(也为CDK的抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD(免疫调节药物)、沙立度胺衍生物CC-4047、来那度胺(lenalidomide)、ENMD0995、IMC-D11、Ki23057、布里瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(也为cKit及Flt3的抑制剂)、1B3、CP868596、IMC3G3、R-1530(也为Flt3的抑制剂)、舒尼替尼(也为cKit及Flt3的抑制剂)、阿西替尼(也为cKit的抑制剂)、来他替尼(也为Flt3及PKC的抑制剂)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也为Flt3及cKit的抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenibtosylate)(也为Raf的抑制剂)、RAF-265(也为Raf的抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(也为EGFR及Her2的抑制剂)、BAY-57-9352(也为Raf的抑制剂)、BAY-73-4506(也为Raf的抑制剂)、XL880(也为cMet的抑制剂)、XL-647(也为EGFR及EphB4的抑制剂)、XL820(也为cKit的抑制剂)及尼洛替尼(也为cKit及brc-abl的抑制剂)。其他治疗剂也可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体的实例(但不限于)为西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制剂的一个实例为吉非替尼(gefitinib)。EGFR调节剂的另一实例为EGF融合毒素。尤其适用于与本发明的双特异性结合分子组合的EGFR及Her2抑制剂为拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、凡德他尼(也为VEGFR的抑制剂)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(也为VEGFR的抑制剂)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。宜在治疗中与本发明的双特异性结合分子组合的其他药物为替坦托西莫单抗(tositumumabtiuxetan)及替坦伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(两种放射性标记的抗CD20抗体)、阿仑单抗(alemtuzumab)(一种抗CD52抗体)、地诺单抗(denosumab)(一种破骨细胞分化因子配体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(一种CD80拮抗剂)、奥法木单抗(ofatumumab)(一种CD20抑制剂)、扎木单抗(zanolimumab)(一种CD4拮抗剂)、SGN40(一种CD40配体受体调节剂)、利妥昔单抗(rituximab)(一种CD20抑制剂)或马帕木单抗(mapatumumab)(一种TRAIL-1受体激动剂)。可与本发明的双特异性结合分子组合使用的其他化学治疗药物选自但不限于激素、激素类似物及抗激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷诺昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、乙酸环丙孕酮(cyproteroneacetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelinacetate)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))；LHRH激动剂及拮抗剂(例如乙酸性瑞林(goserelinacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))；抗代谢物(例如抗叶酸物(如甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、及吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤及腺苷类似物(例如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)(如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊达比星(idarubicin))、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、链佐星(streptozocin))；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、沙铂(satraplatin))；烷化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、塞替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类(vincaalkaloids)，如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷类(taxanes)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)及其调配物、拉洛他赛(larotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel)；及埃博霉素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide))、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及杂项化学治疗药物，例如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、及卟菲尔钠(porfimer)、贝沙罗汀(bexarotene)、塞来考昔(celecoxib)。本发明的双特异性结合分子的特别优选的组合搭配是VEGF拮抗剂，如贝伐珠单抗(bevacizumab)、索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib)。取决于感兴趣的具体疾病或病症，可使用本身已知的任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或动物模型或其任何组合来测试本发明的双特异性结合分子或含有所述分子的多肽以及包含本发明的双特异性结合分子的组合物的效能。适合的分析及动物模型将为本领域技术人员所了解且例如包括本文所述且用于以下实例中的分析，例如增殖分析。如可例如从图10的ELISA数据了解，本发明实验中获得的数据证实本发明的Dll4结合组分具有优于现有技术的Dll4结合分子的性质，图10的ELISA数据表明亲和力成熟的VHH以完全方式阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用，并且显示了亲和力成熟的VHH在hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中的IC50(nM)值、及纯化的亲和力成熟的VHH对重组人DLL4及小鼠DLL4的亲和力KD(nM)。这表明对于与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病及病症(例如癌症)，本发明的Dll4结合分子为具有治疗功效的有希望的候选者。根据本发明的另一实施方案，提供一种诊断疾病的方法：a)使样品与如上文定义的本发明的Dll4结合组分和/或Ang2结合组分接触，及b)检测该Dll4结合组分和/或Ang2结合组分对该样品的结合，及c)将步骤(b)中检测到的结合与标准物进行比较，其中相对于该样品的结合差异可诊断出与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病或病症。对于此用途及其它用途，例如通过引入作为特异性结合对(例如生物素-(链菌素)抗生物素蛋白结合对)的一部分的官能团来进一步修饰本发明的双特异性结合组分可为有用的。此类官能团可用于将本发明的双特异性结合分子与结合至该结合对另一半的另一蛋白、多肽或化合物进行连接，即通过形成结合对而连接。例如，本发明的双特异性结合分子可接合至生物素并连接至与抗生物素蛋白或链亲和素接合的另一蛋白、多肽、化合物或载体。例如，本发明的这些经接合的双特异性结合分子可用作例如可检测信号产生剂接合至抗生物素蛋白或链亲和素的诊断系统中的报告基因。附图说明图1：人、恒河猴及短尾猴DLL4的氨基酸序列比对。图2：人及小鼠DLL4缺失突变体(上标表示氨基酸域边界)。图3：纯化的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(ELISA)。图4：纯化的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(AlphaScreen)。图5：纯化的VHH阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc和CHO-mDLL4/hNotch1-Fc相互作用(FMAT)。图6：纯化的VHH阻断DLL4介导的Notch1裂解(报告基因)。图7：纯化的VHH对重组人及小鼠DLL4的结合(ELISA)。图8：纯化的VHH对重组人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。图9：纯化的VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4的结合(FACS)。图10：亲和力成熟的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(ELISA)。图11：亲和力成熟的VHH阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc和CHO-mDLL4/hNotch1-Fc相互作用(FMAT)。图12：纯化的VHH对人/小鼠DLL4的结合(ELISA)。图13：纯化的亲和力成熟的VHH对重组人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。图14：纯化的VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4的结合(FACS)。图15：VHH对Dll4介导的HUVEC增殖抑制效应的评估。图16：循环1DLL4xAng2VHH的说明。图17：纯化的循环1DLL4xAng2VHH阻断hDLL4/hNotch1相互作用(ELISA)。图18：纯化的循环1DLL4xAng2VHH阻断CHO-hDLL4/hNotch1(44-1)和CHO-mDLL4/hNotch1(44-2)相互作用(FMAT)。图19：纯化的循环1DLL4xAng2VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4过表达CHO细胞的结合(FACS)。图20：纯化的循环1DLL4xAng2VHH对人/小鼠/大鼠DLL4的结合(ELISA)。图21：纯化的循环1DLL4xAng2VHH对人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。图22：纯化的循环1DLL4xAng2VHH阻断hAng2-hTie2(48-1),mAng2-mTie2(48-2)和cAng2/cTie2(48-3)相互作用(ELISA)。图23：循环2DLL4xAng2双特异性VHH的说明。图24：纯化的循环2DLL4xAng2VHH阻断hDLL4/hNotch1相互作用(ELISA)。图25：纯化的循环2DLL4xAng2VHH阻断CHO-hDLL4/hNotch1(51-1)和CHO-mDLL4/Notch1(51-2)相互作用(FMAT)。图26：纯化的循环2DLL4xAng2VHH阻断hDLL4介导的Notch1活化(报告基因分析)。图27：纯化的循环2DLL4xAng2VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4过表达CHO细胞的结合(FACS)。图28：纯化的循环2DLL4xAng2VHH对人/小鼠/大鼠DLL4的结合(ELISA)。图29：纯化的循环2DLL4xAng2VHH对人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。图30：纯化的循环2DLL4xAng2VHH阻断hAng2-hTie2(56-1),mAng2-mTie2(56-2)和cAng2/cTie2(56-3)相互作用(ELISA)。图31：纯化的循环2DLL4xAng2VHH阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。图32：纯化的循环2DLL4xAng2VHH阻断hAng2介导的HUVEC存活。材料和方法a)过度表达人、小鼠及短尾猴Dll4的CHO及HEK293细胞株的产生使用按照相应序列(参见表1；SEQIDNO:421至426)的5'及3'UTR设计的寡核苷酸分别从人成人正常组织心脏cDNA文库(BioChain,Hayward,CA,USA)及小鼠心脏组织cDNA文库(分离自C57/Bl6株)扩增编码人(SEQIDNO:417；NM_019074.2)及小鼠Dll4(NM_019454.3)的cDNA。将扩增子克隆入哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。表1：用于扩增DLL4基因全长直系同源物(orthologue)的寡核苷酸序列。使用根据亲缘关系接近的物种恒河猴的Dll4编码序列(猕猴(Macacamulatta)Dll4，SEQIDNO:418；XM_001099250.1)的5'及3'UTR设计的引物，从短尾猴正常组织心脏cDNA文库(BioChain,Hayward,CA,USA)扩增短尾猴Dll4cDNA(参见表1)。最终将扩增子克隆于哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。显示短尾猴Dll4的氨基酸序列与恒河猴100％一致且与人99％一致(参见图1；与人序列的差异用粗体加下划线标示)。为了建立过度表达人Dll4、小鼠Dll4或短尾猴Dll4的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，分别用pCDNA3.1(+)-neo-hDll4、pcDNA3.1(+)-neo-mDll4或pcDNA3.1(+)-neo-cDll4对亲本CHO细胞进行电穿孔。过度表达人Dll4及小鼠Dll4的人胚肾(HEK293)细胞是通过分别使用pCDNA3.1(+)-neo-hDll4质粒或pCDNA3.1(+)-neo-mDll4质粒的Fugene(Roche)于HEK293亲本细胞株中进行脂质介导的转染而产生的。对于所有条件，转染子均通过添加1mg/mL遗传霉素(geneticin)(Invitrogen,CarlsbadCA,USA)来选择。b)单克隆抗Dll4IgG及Fab片段的产生在US2008/0014196(Genentech)中，公开了人/小鼠交叉反应性Dll4mAb，其由Ridgway等人(2006)使用以显示大量异种移植模型中VEGFmAb及Dll4mAb对肿瘤生长的累加效应。将该抗Dll4mAb及其相应的Fab纯化，以在生物化学/细胞分析及异种移植模型中针对噬菌体选择期间的特异性洗脱来评估该抗体(片段)性质。将所公开的Dll4mAb的可变重链及轻链序列克隆入hIgG2aκ框架中，在HEK293细胞中短暂表达且使用蛋白A色谱法自上清液纯化。纯化的Dll4mAb在ELISA及FACS(使用CHO-mDll4及CHO-hDll4细胞)中显示对人Dll4及小鼠Dll4的结合，在Biacore中显示对两种生长因子直系同源物(orthologue)的低于纳摩尔的亲和力。通过基于回译(back-translation)及使用Leto's基因最优化软件(www.entechelon.com)针对大肠杆菌中的表达的密码子最优化的基因组装来构建相应的Dll4Fab片段。设计用于组装可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)及重链(CH1)的恒定区1的寡核苷酸引物，并进行组装PCR。分别使用限制位点SfiI、AscI及限制位点KpnI、NotI，将编码VL+CL及VH+CH1的cDNA区段克隆入源自pUC119的载体中，该载体含有LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列。在Fab编码序列的框架内，表达载体编码C-末端HA及His6标签。Fab片段在大肠杆菌中表达为标记His6的蛋白，且随后通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)及尺寸排阻色谱法(SEC)从培养基纯化。描述了可变重链及可变轻链的相关氨基酸序列(分别为US2008/0014196的SEQIDNO:1及SEQIDNO:2)；完全重链及轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO:419及420中所示。c)用于表位定位(epitopemapping)的Dll4突变体的产生为了鉴别Dll4(其包含由抗Dll4VHH识别的表位)的细胞外域(ECD)中的区域，产生了Dll4ECD的渐进缺失突变体。使用标准重组DNA技术产生包含CMV启动子的哺乳动物表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)，该启动子位于编码融合至聚His标签的Dll4ECD的一系列巢式缺失片段的聚核苷酸上游(参见图2；上标为氨基酸域边界)。使用Freestyle293表达系统(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)(可从其中收集条件培养基)在经短暂转染的HEK293细胞中表达这些重组蛋白，并通过IMAC纯化。只有缺乏EGF2样域的Dll4突变体才显示对上述人源化人/小鼠交叉反应性抗Dll4mAb(通过捕获型抗人IgG涂布的Biacore传感器芯片来固定)的减弱结合。已知该IgG在该Dll4域中具有特异性结合表位(专利申请Genentech，US2008/0014196A1)。d)Dll4报告分析质粒的产生基本上如Struhl及Adachi,Cell.1998年5月15日；93(4):649-60所述，基于γ分泌酶介导的Notch1裂解以及Dll4刺激后Notch1细胞内域(NICD)的核转位来开发报告分析(reporterassay)。将Gal4/VP16编码序列插入NICD编码序列中。有效杂交转录活化因子GAL4-VP16插入Notch1跨膜域的羧基末端，该因子由融合至单纯疱疹病毒转录活化域VP16的酵母GAL4的DNA结合片段组成。γ分泌酶将该构建体裂解，导致Gal4/VP16NICD融合蛋白的释放，该蛋白将转位至核，在核中该融合蛋白将结合至(并以转录方式激活)共转染的萤光素酶报告质粒，其中该报告质粒含有强力GAL4-UAS启动子序列(Struhl,G.及Adachi,A.,Cell,第93卷,649-660,1998)。将人Notch1-Gal4/VP16表达盒(expressioncassette)克隆于pcDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。将pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]载体(Promega,Madison,WI,USA)用作萤光素酶报告质粒。实施例1使用来自不同物种的Dll4免疫来诱导美洲驼(llama)中的体液免疫反应1.1.免疫化在经兽医学学院的伦理委员会(theEthicalCommitteeofthefacultyofVeterinaryMedicine，UniversityGhent,Belgium)批准之后，通过6次肌内注射(以每周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人Dll4(R&DSystems,Minneapolis,MN,US)来使4只美洲驼(命名为第208、209、230、231号)免疫化。用Stimune(CediDiagnosticsBV,Lelystad,TheNetherlands)调配Dll4抗原。根据标准方案，通过4次交替皮下注射如上所述产生的过度表达人Dll4的CHO细胞及过度表达小鼠Dll4的CHO细胞来使另外三只美洲驼(命名为第127b、260、261号)免疫化。将细胞再混悬于DPBS中且在注射之前保存在冰上。此外，根据标准方案，通过4次交替肌内注射(以两周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人Dll4及小鼠Dll4(R&DSystems,Minneapolis,MN,US)来使另外三只美洲驼(命名为第282、283、284号)免疫化。第0天含有人Dll4的首次注射液是用弗氏完全佐剂(CompleteFreund'sAdjuvant，Difco,Detroit,MI,USA)调配的，而随后含有人及小鼠Dll4的注射液是用弗氏不完全佐剂(IncompleteFreund'sAdjuvant，Difco,Detroit,MI,USA)调配的。1.2.美洲驼中诱导免疫反应的评估为了通过ELISA评估动物中对抗人Dll4的免疫反应的诱导，在第0天(免疫前)、第21天及第43天(收集外周血液淋巴细胞[PBL]的时间)从美洲驼208、209、230及231收集血清；在第0天及第51天从美洲驼127b、260及261收集血清；且在第0天、第28天及第50天从美洲驼282、283及284收集血清。简而言之，2μg/mL重组人Dll4或小鼠Dll4(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定过夜。用酪蛋白溶液(1％)阻断各孔。在添加血清稀释液之后，使用辣根过氧化物酶(HRP)接合的羊抗美洲驼免疫球蛋白(BethylLaboratoriesInc.,Montgomery,TX,USA)且接着使用底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下的酶促反应来检测经特异性结合的免疫球蛋白，从而显示诱导对抗Dll4的显著抗体依赖性免疫反应。抗体反应是由表达常规抗体的B细胞谱系及表达仅有重链的抗体的B细胞谱系来发动，因为经特异性结合的免疫球蛋白可用特异性识别常规美洲驼IgG1抗体或仅有重链的美洲驼IgG2或IgG3抗体的抗体来检测(表2-A)。在所有注射小鼠Dll4的美洲驼中，抗体反应由表达常规抗体及仅有重链的抗体的、特异性针对小鼠Dll4的B细胞发动。另外，经细胞免疫的动物的血清效价是通过对过度表达人及小鼠Dll4的HEK293细胞进行FACS分析来确认的(表2-B)。各美洲驼的Dll4血清效价反应见于表2中。表2：抗体介导的对抗DLL4的特异性血清反应A)ELISA(重组蛋白，涂布于固相上)ND：未测定B)FACS(HEK293细胞上的天然表达蛋白)ND：未测定实施例2仅有重链的抗Dll4抗体片段谱系的克隆及噬菌体的制备在末次免疫原注射之后，从免疫化美洲驼收集作为产生重链抗体的B细胞的来源的免疫组织。通常，在末次抗原注射后4天及8天收集每只动物的两个150ml血液样品，及在末次抗原注射之后4天收集一个淋巴结活组织检查。根据制造商说明书(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA)，使用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)由血液样品制备外周血液单核细胞(PBMC)。如WO05/044858中所述，从PBMC及淋巴结活组织检查提取总RNA，其用作扩增编码VHH的DNA区段的RT-PCR的起始物质。对于各免疫化美洲驼，通过汇集从该动物收集的所有免疫组织分离的总RNA来构筑文库。简而言之，经PCR扩增的VHH谱系通过特定限制位点克隆入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。该载体源自pUC119且含有LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白编码序列、氨苄西林或羧苄西林抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列(pAX050)。载体编码与VHH编码序列同框的C-末端c-myc标签及His6标签。根据标准方案制备噬菌体，且在过滤灭菌后储存在4℃以供进一步使用。实施例3通过噬菌体展示进行Dll4特异性VHH的选择将从所有美洲驼获得且克隆为噬菌体文库的VHH谱系用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括：i)Dll4蛋白形式(人Dll4(Met1-Pro524)及小鼠Dll4(Met1-Pro525)的C末端His标记的重组表达的细胞外域(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)、或存在于过度表达Dll4的CHO或HEK293细胞上的全长人Dll4及小鼠Dll4)，ii)抗原呈现方法(直接涂布Dll4的培养板或通过生物素标签涂布Dll4的中性链亲和素(Neutravidin)培养板；溶液相：在溶液中培养，随后在中性链亲和素涂布培养板上捕获)，iii)抗原浓度及iv)不同洗脱方法(通过胰蛋白酶的非特异性方法或通过同源受体Notch1/Fc嵌合体或抗Dll4IgG/Fab的特异性方法)。所有选择均在Maxisorp96孔培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中进行。如下进行选择：如上所述以多个浓度呈现用于固相及溶液相选择形式的Dll4抗原制备物。在与噬菌体文库一起培养2h、随后充分洗涤之后，用胰蛋白酶(1mg/mL)洗脱结合噬菌体30分钟。若胰蛋白酶用于噬菌体洗脱，则施用0.8mM蛋白酶抑制剂ABSF立刻中和蛋白酶活性。平行进行无抗原选择作为对照。将显示超过背景值(无抗原对照)的富集的噬菌体输出(phageoutput)用于感染大肠杆菌。经感染的大肠杆菌细胞用于制备下一轮选择的噬菌体(噬菌体补救)或接种于琼脂培养板(LB+amp+葡萄糖2％)上用于分析单个的VHH纯系。为了筛选特异性结合物的选择输出，从琼脂培养板挑取单一群落且在1mL96深孔培养板中培养。通过在葡萄糖存在下添加IPTG(终浓度为0.1-1mM)来诱导受LacZ控制的VHH表达。根据标准方案制备周质(periplasmic)提取物(体积约80μL)。实施例4Dll4-Notch1AlphaScreen及FMAT竞争分析中周质提取物的筛选在人Dll4/人Notch1AlphaScreen分析中筛选周质提取物以评估被表达的VHH的阻断能力。使用生物素(Sigma,StLouis,MO,USA)及生物素氨基己酸3-硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sigma,StLouis,MO,USA)对人Dll4进行生物素化。根据制造商说明书(PerkinElmer,Waltham,MA,US)，使用偶联至受体微珠的抗FcVHH来捕获Notch1/Fc嵌合体(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。为了评估VHH的中和能力，使周质提取物的系列稀释液与生物素化的人Dll4一起预培养。将受体微珠及链亲和素(streptavidin)供体微珠添加至该混合物中并进一步在室温培养1小时。通过使用680nm的激发波长及520nm的发射波长在Envision多标记培养板读取器(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)上读取培养板来测量荧光。荧光信号减少表明生物素化的人Dll4对人Notch1/Fc受体的结合是由表达于周质提取物中的VHH阻断的。或者，在人Notch1/FcFMAT(荧光微容量分析技术)竞争分析中使用CHO-hDll4及CHO-mDll4细胞。用Alexa-647(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)随机标记重组的人Notch1/Fc嵌合体(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。简而言之，将5μL周质物质连同7,500个分别过度表达CHO-hDll4或CHO-mDll4的细胞一起添加至100pM或175pM经标记的人Notch1/Fc中，且在培养2小时后进行读数。为了设定无竞争基线，用人Notch1/Fc～Alexa647至少30次重复测定细胞且由该基线计算抑制百分比。所有计算均基于FL1总信号，该信号包含每孔荧光的平均值乘以每孔计数数目。从该筛选来选择抑制性VHH且测序。序列分析探明了属于40个不同B细胞系的167个独特的VHH。各B细胞系发现的变异体的总数见于表3中。周质筛选数据的概述在表4中给出。所得全部独特的VHH的氨基酸序列显示于序列表(SEQIDNO:167-332及459)及表5(指示了CDR及框架区)中。表3：用于鉴别DLL4特异性VHHB细胞系的选择参数。表4：含有表达的抗DLL4VHH的周质提取物的筛检(a)若鉴别了B细胞系内的多个独特变异体，则在括号内以斜体字给出细胞系成员的解离速率范围(最大值-最小值)或解离速率。(b)异质拟合(heterogeneousfit)：测出的快速及缓慢解离速率。实施例5纯化的抗Dll4VHH的表征对选自实施例4中所述筛选的抑制性抗Dll4VHH进行进一步纯化且加以表征。所选VHH在大肠杆菌TG1中表达为标记c-myc、His6的蛋白。通过添加1mMIPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。这些提取物用作起始物质且通过IMAC及尺寸排阻色谱法(SEC)纯化VHH，经SDS-PAGE评估得到95％的纯度。5.1.ELISA中阻断Dll4的VHH的评估在人Dll4-人Notch1/Fc阻断ELISA中评估VHH的阻断能力。简而言之，将1μg/mL人Notch1/Fc嵌合体(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。使15nM固定浓度的生物素化的人Dll4与VHH的系列稀释液一起预培养1小时，此后将该混合物在被涂布的Notch1受体上再培养1小时。使用辣根过氧化物酶(HRP)接合的extravidin(Sigma,St.Louis,MO,USA)检测生物素化的人Dll4的残余结合(图3)。如上所述对人Dll4进行生物素化。阻断人Dll4-人Notch1/Fc相互作用的VHH的IC50值见于表6中。表6：hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中VHH的IC50(nM)值VHHIDIC50(nM)6B111.555D1212.356A094.956C0433.956H086.957C1117.362C1172.096C0338.4101G089.5104G011.1115A059.1抗DLL4Fab0.75.2.AlphaScreen中阻断Dll4的VHH的评估简而言之，在链亲和素涂布的供体微珠(20μg/mL)上捕获1nM生物素化的人Dll4，而在抗人FcVHH涂布的受体微珠(20μg/mL)上捕获0.4nM的受体人Notch1(呈Fc融合蛋白形式)。两种负载微珠均与一定稀释度范围的竞争VHH一起培养(图4)。阻断人Dll4-人Notch1/Fc相互作用的VHH的IC50值见于表7中。表7：hDLL4/hNotch1竞争AlphaScreen中VHH的IC50(nM)值VHHIDIC50(nM)5B110.76B110.37A020.47B051.18A090.48C110.7(a)19F040.05(a)55D122.356A091.256C045.456H081.657C112.262C1124.1115A055.0抗DLL4Fab0.3(a)部分抑制剂5.3.抗Dll4VHH对人Notch1/Fc与表达在CHO细胞上的人或小鼠Dll4的结合的抑制在如实施例4中概述的人及小鼠Dll4-人Notch1/Fc竞争性FMAT分析(图5)中来评估VHH的阻断能力。阻断人Notch1/Fc与表达在CHO细胞上的人或小鼠Dll4的相互作用的VHH的IC50值见于表8中。表8：阻断人Notch1/Fc与在CHO细胞上表达的人或小鼠DLL4的相互作用的纯化的VHH的(平均)IC50值(nM)(FMAT)hDLL4mDLL4VHHIDIC50(nM)IC50(nM)6B118.9-8A095.5-19F0433.0-55D1239.141.056A0910.615.056C0428.749.656H0822.033.757C1153.949.562C11172.2106.396C03160.828.8101G0824.692.1104G012.5-115A0522.043.0抗DLL4Fab5.42.35.4.报告分析中阻断Dll4的VHH的评估为了评估所选VHH的效能，建立基于Notch1的γ分泌酶介导的裂解及Dll4刺激后Notch1细胞内域(NICD)的释放的报告分析。将Notch1-GAL4/VP16构建体与pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]报告质粒一起共转染于HEK细胞中，使融合蛋白短暂表达。通过与HEK293-hDll4稳定细胞株共培养来刺激这些经短暂转染的细胞24小时。转染后48小时进行读数。VHH在开始共培养之前与HEK293-hDll4细胞一起预培养1小时且包括在共培养期间内(图6)。阻断Notch1的Dll4介导的裂解且随后阻断其NICD转位至受体细胞核的VHH的IC50值见于表9中。表9：DLL4/Notch1报告分析中纯化的抗Dll4VHH的(平均)IC50值(nM)VHHIDIC5056A0954062C11466396C035156101G082760104G01964115A051740抗DLL4Fab1335.5.表位重新分级(epitopebinning)在例如基准抗体经结合时，为了确定VHH是否可同时结合Dll4，通过BiacoreT100仪器上的表面等离子共振(SPR)进行表位重新分级实验。抗-Dll4Fab片段以不可逆方式固定在CM5传感器芯片的参照液体池(flowcell)及活性液体池上。对于各样品(循环)，将人Dll4注射在活性及参照液体池上且由抗Dll4Fab以可逆方式捕获。通过注射在固定表面上评估另外的VHH结合。所有VHH及抗Dll4Fab均以100nM注射，表面接触时间为120秒，且流速为10微升/分钟。使用10mM甘氨酸(pH1.5)使表面再生。用BiacoreT100评估软件来评估经处理的曲线。表10-A表示所分析的VHH及对照品的依序注射/再生的途径。显示VHHDLLBII56A09(SEQIDNO:300)、DLLBII96C03(SEQIDNO:326)、DLLBII101G08(SEQIDNO:197)及DLLBII115A05(SEQIDNO:224)不另外地与由Dll4Fab捕获到的人Dll4结合。Dll4Fab的注射也未能另外地结合人Dll4，表明所有表位均已饱和。因此，可断定这些VHH识别了与用于结合人Dll4的Dll4Fab重叠的表位。人所独有的VHHDLLBII6B11(SEQIDNO:174)及DLLBII104G01(SEQIDNO:215)显示对Dll4Fab捕获的人Dll4的额外结合，表明对人Dll4具有特异性的这些VHH识别了与人/小鼠交叉反应性VHH不同的表位。表10-A：抗DLL4VHH的表位重新分级-同时与DLL4Fab进行结合注射步骤结合/再生[样品]结合水平(RU)1hDLL4100nM17272DLL4Fab100nM无结合359A9100nM无结合46B11100nM4055甘氨酸pH1.510mM906hDLL4100nM13497104G1100nM2768甘氨酸pH1.510mM879hDLL4100nM133610甘氨酸pH1.510mM7011hDLL4100nM13331296C3100nM无结合13101G8100nM无结合14115A05100nM无结合15甘氨酸pH1.510mM705.6.使用Dll4缺失突变体的表位定位在Biacore中评估VHH对这些Dll4突变体的结合。简而言之，将VHHDLLBII101G08(SEQIDNO:197)及DLLBII115A5(SEQIDNO:224)涂布于CM4传感器芯片上且横跨芯片注射200nM的各缺失突变体。对结合进行定性评估。未观测到DLLBII56A09(SEQIDNO:300)、DLLBII101G08(SEQIDNO:197)及DLLBII115A05(SEQIDNO:224)分别对缺乏EGF样2域的人及小鼠Dll4突变体hDll4.1及mDll4.8的结合(表10-B)。使用hDll4/Dll4IgG竞争性ELISA的间接证据已指出了该观测结果。简而言之，将1μg/mLDll4IgG涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。使固定浓度6nM的生物素化的人Dll4与VHH的系列稀释液一起预培养1小时，此后将该混合物在经涂布的IgG上再培养1小时。使用辣根过氧化物酶接合的extravidin(Sigma,St.Louis,MO,USA)检测生物素化的人Dll4的残余结合(数据未显示)。如上所述对人Dll4进行生物素化。从专利文献得知单克隆抗Dll4IgG(Genentech,US2008/0014196A1)与Dll4的EGF样2域内的表位相结合。表10-B：抗DLL4VHH的表位定位-结合DLL4缺失突变体5.7.测定hDll4-VHH相互作用的亲和力测定Dll4-VHH相互作用的亲和力的动力学分析通过BiacoreT100仪器上的表面等离子共振(SPR)来进行。使用EDC及NHS通过胺偶联将重组人Dll4固定在CM5芯片上或在SA芯片(链亲和素表面)上捕获生物素化的人Dll4。将纯化的VHH或Fab片段在不同浓度(介于10与300nM之间)下注射2分钟且使其在45μl/分钟的流速下解离20分钟。在样品注射的间隙，用10mM甘氨酸(pH1.5)及100mMHCl使表面再生。将HBS-N(Hepes缓冲液，pH7.4)用作操作缓冲液。若有可能，则通过将1:1相互作用模型(朗缪尔(Langmuir)结合)拟合在结合曲线上来评估数据。亲和力常数KD由所得缔合及解离速率常数(ka)及(kd)来计算。抗Dll4VHH的亲和力见于表11中。表11：纯化VHH对重组人DLL4的亲和力KD(nM)(a)导致非1:1拟合的异质结合曲线5.8.与直系同源物(mDll4，cDll4)及家族成员(hJagged-1，hDLL1)结合为了测定对小鼠Dll4的交叉反应性，进行结合ELISA。简而言之，重组小鼠Dll4(R&DSystems,Minneapolis,MS,USA)在4℃以1μg/mL于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中涂布过夜。用酪蛋白溶液(1％的PBS溶液)阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP接合物(Sigma,StLouis,MO,USA)来检测结合(图7)。测量对人Dll4的结合作为参照。EC50值概述于表12中。表12：重组人DLL4及小鼠DLL4结合ELISA中VHH的EC50(nM)值rhDLL4rmDLL4VHHIDEC50(nM)EC50(nM)5B111.8-6B111.4-7A021.4-7B057.2-8A090.9-8C111.1-17F100.9-19F040.90.855D1213.130.056A093.66.356C0444.3244.056H084.18.757C117.983.462C11137.013.196C0386.58.7101G088.953.9104G018.4-115A055.033.4抗DLL4Fab3.03.0为了确定VHH的短尾猴交叉反应性，进行FACS结合实验。将表达短尾猴Dll4的HEK293细胞(短暂或稳定转染)用于VHH的滴定结合实验。在冰上培养30分钟后，洗涤所有样品且通过施用抗c-myc～Alexa647(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USA)来进行检测。过度表达人及小鼠Dll4的HEK293细胞作为参照。在FACSArray上测定平均MCF值且用于计算EC50值(参见图9)。通过固相结合分析(ELISA)评估对同源配体人DLL1及人Jagged-1结合的缺失。简而言之，人DLL1(Alexis,SanDiego,CA,USA)及人Jagged-1(Alexis,SanDiego,CA,USA)在4℃以1μg/mL于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中涂布过夜。用酪蛋白溶液(1％的PBS溶液)阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP接合物(Sigma,St.Louis,MO,USA)来检测结合。所有抗Dll4VHH均视为对这些同源配体无交叉反应性(图8)。5.9.VHH阻断Dll4介导的HUVEC增殖的评估在如Ridgway等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7所述的增殖分析(以经修饰的形式)中评估所选VHH的效能。简而言之，用纯化Dll4-His(RnDSystems；C-末端His标记的人Dll4，氨基酸27-524，0.75毫升/孔，10ng/ml)在涂布缓冲液(PBS，0.1％BSA)中的溶液涂布96孔组织培养板。用PBS洗涤各孔，随后一式四份每孔接种4000个HUVEC细胞。在第4天通过掺入[3H]-胸苷来测量细胞增殖。图15中所示的结果说明DLL4VHHDLLBII101G08、DLLBII104G01、DLLBII115A05、DLLBII56A09及DLL4Fab以剂量依赖性方式抑制对HUVEC增殖的DLL4依赖性效应，IC50值概述于表13中。所测试VHH在10μM下完全抑制DLL4依赖性效应。表13：DLL4增殖分析中获得的IC50值实施例6所选抗Dll4VHH的亲和力成熟使VHHDLLBII101G08及DLLBII115A05经受两个循环的亲和力成熟。在第一循环中，使用易错PCR方法在框架(FW)及互补决定区(CDR)两者中随机引入氨基酸置换。用两轮基于PCR的方法(从Stratagene,LaJolla,CA,USA获得的GenemorphII随机诱变试剂盒)来进行诱变，该方法使用1ngDLLBII101G08或DLLBII115A05cDNA模板，随后使用0.1ng的第1轮产物进行第二次易错PCR。在精制步骤之后，将PCR产物通过独特限制位点插入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。使用递减浓度的生物素化重组人DLL4(biot-rhDLL4)及胰蛋白酶洗脱来进行连续多轮的溶液中选择(in-solutionselection)。也在第三轮中使用冷rhDLL4(至少比biot-rhDLL4过量100倍)进行亲和力驱动选择(affinity-drivenselection)。关于鼠类DLL4的选择不包括在内，因为交叉反应性(的保留)是在筛选水平上加以评估的。使用源自pUC119的表达载体产生呈重组蛋白形式的单个的突变体，该表达载体含有LacZ启动子、氨苄西林抗性基因、多克隆位点及ompA前导序列(pAX50)。大肠杆菌TG1细胞经表达载体文库转化且涂布于琼脂培养板(LB+Amp+2％葡萄糖)上。从琼脂培养板挑取单一群落且在1mL96深孔培养板中培养。通过添加IPTG(1mM)来诱导VHH表达。根据标准方法制备周质提取物(体积约80μL)且在ProteOn(BioRad,Hercules,CA,USA)解离速率分析中针对与重组人及小鼠Dll4的结合加以筛选。简而言之，GLCProteOn传感器芯片在“配体通道”L2及L4(L1/L3作为参照通道)上由重组人Dll4涂布，而“配体通道”L3及L6由小鼠Dll4涂布。将亲和力成熟纯系的周质提取物稀释10倍且横跨“分析物通道”A1-A6加以注射。计算存在于培养板中的野生型纯系的平均解离速率且作为计算解离速率增加的参照。在第二循环中，通过同时将第一循环中鉴别的敏感位置随机化来产生组合文库。为此，使用在随机化位置处经简并的寡核苷酸(NNS)，通过重叠PCR来合成全长DLLBII101G8或DLLBII115A05cDNA且进行补救PCR。用于产生组合文库的引物列举于表14及SEQIDNO:427至457中。如上(实施例2)所述，使用特定限制位点将随机化的VHH基因插入噬菌体展示载体(pAX50)中。如先前所述制备单个的VHH纯系的周质提取物。表14：寡核苷酸亲和力成熟文库ProteOn解离速率分析中针对与重组人Dll4的结合进行的筛选鉴别出了解离速率增加多达38倍的纯系(DLLBII101G08)及多达11倍的纯系(DLLBII115A05)(表15)。表15：DLLBII101G08及DLLBII115A05亲和力成熟纯系的解离速率筛选在具有C-末端c-myc标签及(His)6标签的框架内，将最佳的顶端(top)DLLBII101G08变异体及DLLBII115A05变异体克隆入表达载体pAX100中。重组小鼠Dll4的解离速率也得以增加。VHH是以His6标记的蛋白形式在大肠杆菌中产生，且通过IMAC及SEC来纯化。序列分别见于表16-A(DLLBII101G08)及表16-B(DLLBII115A05)中。实施例7亲和力成熟的纯化抗Dll4VHH的表征如上(实施例6)所述，表达并纯化VHHDLLBII101G08及DLLBII115A05的亲和力成熟变异体。在以下中对VHH进行表征：rhDLL1/rhJAG1结合ELISA及hDll4/mDll4/短尾猴Dll4FACS(实施例5.8；表20；图12及13)、rhDll4-rhNotch1竞争ELISA(实施例5.1；表17；图10)、竞争rhNotch1-CHO-hDll4FMAT(实施例5.3；表18；图11)。表征数据概述于表21中。总之，亲和力成熟VHH显示亲和力及效能的明确增加，同时维持其对mDll4及短尾猴Dll4的结合且未观测到对hDLL1或hJAG1的结合。表17：hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中亲和力成熟VHH的IC50(nM)值VHHIDIC50(nM)101G0810.0129A031.8129B050.9129D081.2129E111.3129H071.0130B031.5130F061.3抗DLL4Fab1.5VHHIDIC50(nM)115A057.5133A052.1133A091.5133G052.0134D101.3136C071.40150.9抗DLL4Fab1.2表18：阻断人Notch1/Fc与表达在CHO细胞上的人或小鼠DLL4的相互作用的纯化的亲和力成熟VHH的IC50值hDLL4mDLL4VHHIDIC50(nM)IC50(nM)101G0869.3140.5129B057.414.4129D087.811.0129E118.112.3抗DLL4Fab5.53.0hDLL4mDLL4VHHIDIC50(nM)IC50(nM)115A05106.7348.9133A096.618.6133G055.912.0136C078.031.20155.721.2抗DLL4Fab3.41.6表19：纯化的亲和力成熟VHH对重组人DLL4及小鼠DLL4的亲和力KD(nM)表20：结合CHO-hDLL4、CHO-mDLL4及CHO-cDLL4的亲和力成熟VHH的EC50(nM)值hDLL4mDLL4cDLL4VHHIDEC50(nM)EC50(nM)EC50(nM)101G08(wt)17.511.2129B059.73.93.9129D089.63.73.8129E111.44.14.2抗DLL4Fab5.62.12.5hDLL4mDLL4cDLL4VHHIDEC50(nM)EC50(nM)EC50(nM)115A05(wt)11.313.8133A097.21.72.3133G058.52.82.7136C0710.98.33.501514.87.05.1抗DLL4Fab5.62.12.5表21：源自DLLBII101G08及DLLBII115A05的亲和力成熟VHH的特征nb：无结合实施例8使用抗血清白蛋白结合作为半衰期延长形式构建、产生和表征靶向DLL4和Ang2的双特异性VHH在第一循环中，使用抗-DLL4VHHDLLBII00018(US2011/0172398A1)和循环1序列优化的抗-Ang2VHH00042(SEQIDNO:482),00045(SEQIDNO:484)和00050(SEQIDNO:483)作为构件以产生双特异性VHHDLLANGBII00001-00016。使用与血清白蛋白结合VHH的遗传融合作为半衰期延长方法。通过9Gly-Ser柔性连接子连接构件。按实施例5中的描述生产和纯化VHH。所有双特异性VHH的形式和序列描述于图6和表22-A(连接序列以下划线表示)、SEQIDNO460至475中。表达水平显示于表22-B中。表22-A表22-Bn.e.:未进行表达为探究与单价构件DLLBII00018相比抗-DLL4的阻断性质，在hDLL4/hNotch1竞争性ELISA(参见实施例5.1，如专利US2011/0172398A1中所述)(图17)和CHO-hDLL4/CHO-mDLL4竞争性FMAT(参见实施例5.3，如专利US2011/0172398A1中所述)(图18)中分析了所有纯化的双特异性VHH。在此，使用固定浓度8nM的生物素化hDLL4进行ELISA竞争性分析。分别用12.5μM和25μM人血清白蛋白预孵育VHH后也进行ELISA和FMAT竞争性分析。IC50值及抑制％汇总于表23中。表23:在hDLL4/hNotch1竞争性ELISA和CHO-hDLL4和CHO-mDLL4竞争性FMAT中的IC50值(nM)和抑制百分比n.d.,未测定另外，为测定双特异性VHH对小鼠和短尾猴DLL4的交叉反应性，进行了FACS结合实验。简而言之，将过表达小鼠和短尾猴DLL4的CHO细胞用于VHH的滴定结合实验。冰上孵育30分钟后，洗涤所有样品并使用抗-c-myc后续PE标记的羊-抗小鼠IgG进行2步检测。过表达人DLL4的CHO细胞作为参照。使用FACSArray确定平均MCF值并用于EC50值计算(表24；图19)。表24:与CHO细胞上过表达的人、小鼠和短尾猴DLL4结合的双特异性VHH的EC50值(FACS)为测定对小鼠DLL4和大鼠DLL4的交叉反应性，进行了结合ELISA。简而言之，在4℃将重组小鼠DLL4(R&DSystems,Minneapolis,MI,USA)和大鼠DLL4涂布于96-孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中过夜。用1％酪蛋白(casein)溶液阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并先后用生物素化抗-VHH1A4和extravidin-HRP检测结合。1A4是抗-VHHVHH(AblynxNV内部生产)。检测对人DLL4的结合作为参照。EC50值总结于表25和图20中。表25:结合人、小鼠和大鼠DLL4的双特异性VHH的EC50值(ELISA)通过固相结合分析(ELISA)评价对同源的人配体DLL1和Jagged-1是不结合的。简而言之，在4℃将1μg/mL重组人DLL1(Alexis,SanDiego,CA,USA)或重组人Jagged-1(Alexis,SanDiego,CA,USA)涂布于96-孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中过夜。用1％酪蛋白溶液阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并先后用生物素化抗-VHH1A4和extravidin-HRP检测结合。认为所有双特异性VHH对这些同源配体没有交叉反应。结果显示于图21。为探究与单价抗-Ang2构件00042、00045和00050相比抗-Ang2的阻断性质，在人Ang2/hTie2-Fc(图22-1)、小鼠Ang2/mTie2(图22-2)和短尾猴Ang2/cTie2(图22-3)竞争性ELISA中分析了所有纯化的双特异性VHH。用0.5μM人血清白蛋白孵育VHH后也进行该分析。IC50和抑制百分比的总结如表26所示。表26:在人、小鼠和短尾猴Ang2/Tie2竞争性ELISA中的IC50值(pM)和抑制百分比n.d.,未测定；％inh，抑制百分比。已经确定了某些DLL4-Ang2双特异性VHH针对人血清白蛋白的亲和力(参见实施例5)并在表27中显示。从所得的缔合及解离率常数ka和kd计算亲和力常数KD。表27:纯化的VHH对人血清白蛋白(HSA)的亲和力KD在第二循环中，使用抗-DLL4VHHDLLBII00018(US2011/0172398A1)和最终序列优化的抗-Ang2VHH00921(SEQIDNO:485)、00938(SEQIDNO:486)和00956(SEQIDNO:488)作为构件以产生双特异性VHHDLLANGBII00017-00019。使用与血清白蛋白结合VHH的遗传融合作为半衰期延长方法。通过9Gly-Ser柔性连接子连接构件。所有双特异性VHH的形式和序列描述于图23和表28(连接序列以下划线表示)、SEQIDNO476至478中。表28为探究与单价构件DLLBII00018相比抗-DLL4的阻断性质，在hDLL4/hNotch1竞争性ELISA(参见实施例5.1，如专利US2011/0172398A1中所述)(图24)、CHO-hDLL4/CHO-mDLL4竞争性FMAT(参见实施例5.3，如专利US2011/0172398A1中所述)(图25)和hDLL4介导的Notch1活化(报告基因)分析(参见专利实施例5.4，如US2011/0172398A1中所述)(图26)中分析了所有纯化的双特异性VHH。在此，使用固定浓度8nM的生物素化hDLL4进行ELISA竞争性分析。分别用12.5μM、25μM和162μM人血清白蛋白预孵育VHH后也进行ELISA竞争性分析、FMAT竞争性分析及报告基因分析。IC50值及抑制百分比汇总于表29中。在Biacore中评估对人DLL4、小鼠DLL4和大鼠DLL4的结合。简而言之，通过在BiacoreT100仪上的SPR进行双特异性VHH的动力学分析。重组人DLL4(R&DSystems,Minneapolis,MI,USA)和小鼠DLL4(R&DSystems,Minneapolis,MI,USA)通过胺偶联固定在CM5芯片上。以2.5至1,800nM的不同浓度将VHH注射到这些表面上。样品注射2分钟并允许以45μl/min的流速解离20分钟。在样品注射间隙，用10mM甘氨酸pH1.5以100s脉冲使表面再生。通过拟合1:1相互作用模型(朗缪尔结合)评估缔合/解离数据。从所得的缔合及解离率常数ka和kd计算亲和力常数KD(表30)。表30:结合人和小鼠DLL4的双特异性VHH的结合动力学(Biacore)另外，为测定双特异性VHH对小鼠和短尾猴DLL4的交叉反应性，进行了FACS结合实验。简而言之，将过表达小鼠和短尾猴DLL4的CHO细胞用于VHH的滴定结合实验。冰上孵育30分钟后，洗涤所有样品并先后使用生物素化抗-VHH1A4和PE标记的链霉亲和素进行2步检测。将过表达人DLL4的CHO细胞作为参照。使用FACSArray测定平均MCF值并用于EC50值计算(表31；图27)。表31:与CHO细胞上过表达的人、小鼠和短尾猴DLL4结合的双特异性VHH的EC50值(FACS)为测定对小鼠DLL4和大鼠DLL4的交叉反应性，进行了结合ELISA。简而言之，在4℃将重组小鼠DLL4(R&DSystems,Minneapolis,MI,USA)和大鼠DLL4涂布于96-孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中过夜。用1％酪蛋白溶液阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并先后用生物素化抗-VHH1A4和extravidin-HRP检测结合。检测对人DLL4的结合作为参照。EC50值总结于表32和图28中。表32:与人、小鼠和大鼠DLL4结合的双特异性VHH的EC50值(ELISA)通过固相结合分析(ELISA)评价对同源的人配体DLL1和Jagged-1是不结合的。简而言之，在4℃将1μg/mL重组人DLL1(Alexis,SanDiego,CA,USA)或重组人Jagged-1(Alexis,SanDiego,CA,USA)于96-孔MaxiSorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中涂布过夜。用1％酪蛋白溶液阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH并先后用生物素化抗-VHH1A4和extravidin-HRP检测结合。认为所有双特异性VHH对这些同源配体没有交叉反应。结果显示于图29。为探究与最终序列优化的单价抗-Ang2构件00921、00938和00956相比抗-Ang2的阻断性质，在人Ang2/hTie2(图30-1)、小鼠Ang2/mTie2(图30-2)、短尾猴Ang2/cTie2(图30-3)和hAng1/hTie2(图31)竞争性ELISA以及hAng2介导的HUVEC存活分析(图32)中分析了所有纯化的双特异性VHH。IC50和抑制百分比的总结如表33所示。已经确定了DLLANGBII00017-18-19对人、小鼠、短尾猴和大鼠Ang2的亲和力(参见实施例5)并在表34中显示。表34:纯化的VHH对重组人/短尾猴/小鼠/大鼠Ang2的结合动力学已经确定了DLLANGBII00017-18-19对人、小鼠和短尾猴血清清蛋白的亲和力(实施例5)并在表35中显示。从所得的缔合及解离率常数ka和kd计算亲和力常数KD。表35:纯化的VHH对重组人/小鼠/短尾猴血清清蛋白的结合动力学*无法适当拟合综上所述，本发明包括但不限于以下技术项：1.一种双特异性结合分子，其包含至少一个Ang2结合组分和至少一个Dll4结合组分。2.根据技术项1所述的双特异性结合分子，其还包含至少一种血清白蛋白结合组分。3.根据技术项1或2所述的双特异性结合分子，其包含Dll4结合组分，所述Dll4结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域，其中所述CDR3具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列：a.SEQIDNO:1至166和458，b.SEQIDNO:333至353，或c.SEQIDNO:375至395。4.根据技术项3所述的双特异性结合分子，该双特异性结合分子的所述Dll4结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列：a.SEQIDNO:1至166和458，b.SEQIDNO:333至353，或c.SEQIDNO:375至395。5.根据技术项4所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含：a.CDR3，其具有选自SEQIDNO:1至166所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b.CDR1及CDR2，其具有如表5所示的氨基酸序列，该序列作为部分序列包含于选自SEQIDNO:167至332和459所示的第二组氨基酸序列的序列中；c.其中对于SEQIDNO:1至166的所述第一组的SEQIDNO:x对应于所述第二组的SEQIDNO:y，其中y＝x+166。6.根据技术项4所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含：a.CDR3，其具有选自SEQIDNO:333至353所示的所述第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b.CDR1及CDR2，其具有如表16-A所示的氨基酸序列，该序列作为部分序列包含于选自SEQIDNO:354至374所示的第二组序列的序列中；c.其中所述第一组的SEQIDNO:x对应于所述第二组的SEQIDNO:y，其中y＝x+21。7.根据技术项4所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含：a.CDR3，其具有选自SEQIDNO:375至395所示的所述第一组氨基酸序列的氨基酸序列；b.CDR1及CDR2，其具有如表16-B所示的氨基酸序列，该序列作为部分序列包含于选自SEQIDNO:396至416所示的第二组序列的序列中；c.其中所述第一组的SEQIDNO:x对应于所述第二组的SEQIDNO:y，其中y＝x+21。8.根据技术项4至7任一项所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH。9.根据技术项8所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQIDNO:167至332和459所示氨基酸序列的氨基酸序列。10.根据技术项8所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQIDNO:354至374所示氨基酸序列的氨基酸序列。11.根据技术项8所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQIDNO:396至416所示氨基酸序列的氨基酸序列。12.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使如技术项5中定义的免疫球蛋白单一可变域亲和力成熟而获得。13.一种VHH，其通过使如技术项9中定义的VHH亲和力成熟而获得。14.一种Dll4结合VHH，其具有选自SEQIDNO:356和358所示氨基酸序列的氨基酸序列。15.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使技术项14中定义的VHH人源化而获得。16.一种Dll4结合VHH，其具有选自SEQIDNO:402、407和416所示序列的氨基酸序列。17.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使技术项16中定义的VHH人源化而获得。18.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使如技术项5中定义的免疫球蛋白单一可变域人源化而获得。19.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使如技术项12中定义的免疫球蛋白单一可变域人源化而获得。20.根据技术项1所述的双特异性结合分子，其结合至完全或部分包含于EGF-2域内的Dll4的表位，所述EGF-2域对应于SEQIDNO:417的氨基酸残基252-282。21.根据技术项20所述的双特异性结合分子，其为免疫球蛋白单一可变域或含有所述免疫球蛋白单一可变域的多肽。22.根据技术项1至20中任一项所述的双特异性结合分子，其包含Ang2结合组分，所述Ang2结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域，其中所述CDR3具有选自如SEQIDNO:491、494、497、500、503、506、509、512、515、或518所示氨基酸序列的氨基酸序列。23.根据技术项22所述的双特异性结合分子，该双特异性结合分子的所述Ang2结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自SEQIDNO:491、494、497、500、503、506、509、512、515、或518所示氨基酸序列的氨基酸序列。24.根据技术项23所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含：a.CDR3，其具有选自如下SEQIDNO所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列：SEQIDNO:491、494、497、500、503、506、509、512、515、或518(表36)；b.CDR1，其具有如表22-A或28所示氨基酸序列，该序列作为部分序列包含于选自SEQIDNO:489、492、495、498、501、504、507、510、513、或516(表36)所示的第二组氨基酸序列的序列中；c.CDR2，其具有如表22-A或28所示氨基酸序列，该序列作为部分序列包含于选自SEQIDNO:490、493、496、499、502、505、508、511、514、或517(表36)所示的第二组氨基酸序列的序列中。25.根据技术项22至24中任一项所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH。26.根据技术项25所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQIDNO:479、480、481、482、483、484、485、486、487、或488所示氨基酸序列的氨基酸序列。27.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使如技术项24中定义的免疫球蛋白单一可变域亲和力成熟而获得。28.一种VHH，其通过使如技术项26中定义的VHH亲和力成熟而获得。29.一种Ang2结合VHH，其具有选自SEQIDNO:479、480、481、482、483、484、485、486、487、或488所示氨基酸序列的氨基酸序列。30.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使技术项29中定义的VHH人源化而获得。31.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使如技术项24中定义的免疫球蛋白单一可变域人源化而获得。32.根据技术项2至31中任一项所述的结合分子，该结合分子的所述血清清蛋白结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自SEQIDNO:522、525、528、531、534、537、或540所示氨基酸序列的氨基酸序列。33.根据技术项32所述的结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含：a.CDR3，其具有选自如下SEQIDNO所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列：SEQIDNO:522、525、528、531、534、537、或540；b.CDR1，其具有选自SEQIDNO:520、523、526、529、532、535、或538所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列；c.CDR2，其具有选自SEQIDNO:521、524、527、530、533、536、或539所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列。34.根据技术项32至33中任一项所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH。35.根据技术项34所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有SEQIDNO:98或519所示的氨基酸序列。36.根据技术项2至35中任一项所述的双特异性结合分子，其具有选自SEQIDNO:460至478所示氨基酸序列的氨基酸序列。37.一种核酸分子，其编码技术项1至36中任一项所述的结合分子或含有所述结合分子的载体。38.一种宿主细胞，其含有技术项37所述的核酸分子。39.一种药物组合物，其含有至少一种技术项1至36中任一项所述的双特异性结合分子作为活性成分。40.根据技术项39所述的药物组合物，其用于治疗与Dll4介导的和/或Ang2介导的血管生成作用相关的疾病。41.根据技术项40所述的药物组合物，其用于治疗癌症及癌性疾病。42.根据技术项39所述的药物组合物，其用于治疗眼病。