一种评价催乳作用的体外细胞模型分析方法与流程

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种新颖的利用垂体前叶细胞评价催乳作用的体外分析方法。

背景技术：

产后缺乳是指分娩后乳腺泌乳量小，不能满足喂养婴儿的需要。母乳喂养有利于婴儿和产妇的健康，但近年来，由于高龄产妇增多、剖宫产率上升、尤其二胎政策的全面放开，产后缺乳现象呈上升趋势。2014年国家卫计委发布数据显示，0-6月龄婴儿纯母乳喂养率为27.8%，其中农村为30.3%，城市仅为16.8%，远低于国际平均水平（38%）。所以，如何有效地治疗产后缺乳，是迫切需要解决的问题。

催乳药物的开发需要建立良好的体内缺乳动物模型和体外细胞模型，以便评价药物的催乳作用。关于药物催乳作用的体内模型多有报道^[1]，该模型具有准确、直接地反映样品催乳作用的特点，但也存在需要样品检测量大和无法灵敏反映量效关系等缺陷。天然提取和人工合成的活性成分都具有质量少的特点，无法满足体内活性测定需要大量样品的要求，而体外细胞模型可以解决上述问题。针对评价样品催乳作用的体外细胞模型尚无报道这一问题，本发明建立了一种利用体外细胞模型，通过检测催乳素水平，评价样品催乳作用的方法。

通过检测大鼠血清催乳素含量可以评价样品的催乳作用^[1]，并且已知利用elisa方法可以测定体外培养的垂体前叶细胞的分泌prl水平^[2]。在上述两点研究基础之上，发明人经过研究发现，取体外培养缺乳大鼠的垂体前叶细胞，加入样品孵化后，应用elisa方法可以评价细胞分泌prl的水平，进而可以测定样品的催乳作用，且样品的加入量与活性在测定范围内具有良好的量效关系。此方法简单方便实用，可以大幅度降低评价催乳活性的样品加药量，并且可以测定催乳活性强弱。此体外测定方法为催乳药物的开发提供了简洁准确的技术手段。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供一种评价催乳作用的体外细胞模型分析方法，此方法中涉及的体外细胞检测模型，与传统的体内评价方法相比，无需制备大量的测试样品。此检测方法具有简便、稳定性好、用时短、成本低和可体现量效关系等特点。

为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：

利用缺乳大鼠垂体前叶细胞进行催乳体外活性评价。

其中，该方法含有如下步骤：

（1）孕鼠饲养；

（2）溴隐亭造模；

（3）垂体前叶细胞培养；

（4）样品制备；

（5）样品活性检测；

（6）原始数据处理。

进一步地，该方法的详细步骤如下所示

（1）孕鼠饲养：

选用成年健康清洁级sd大鼠孕鼠，产仔后母鼠和其仔鼠一起饲养，母鼠正常哺乳；

（2）溴隐亭造模：

母鼠产后第2d起溴隐亭灌胃造模（3mg/kg/d）及生理盐水灌胃作为阴性对照，连续7d；

（3）垂体前叶细胞培养：

第8天分别取溴隐亭组和生理盐水组大鼠垂体前叶细胞培养；将2种细胞用dmem+10%fbs调整细胞密度，按照5000个/100ul/孔，接种于96孔板中，37度，5%二氧化碳，孵育过夜；

（4）样品制备：

取四叶参切成薄片，干燥，粉碎，过筛，于75%乙醇溶液中超声3次，每次30min；将三次滤液合并，减压抽滤分离上清液，减压干燥成干浸膏，即得；

（5）样品活性检测：

加入不同浓度的四叶参提取物和阳性药乳泉颗粒样品，培养36h，按照elisa试剂盒说明书要求，检测各孔催乳素（prl）含量，以测定不同浓度样品对缺乳大鼠垂体催乳素分泌的影响；

（6）原始数据处理：

采用spss19.0统计软件进行数据处理；各组数据均采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异性比较采用t检验。

其中，步骤（1）中所使用的实验大鼠为孕鼠。

步骤（2）中对产后母鼠溴隐亭灌胃造模的给药浓度是3mg/kg/d。

步骤（3）中对产后缺乳母鼠的垂体前叶细胞进行培养。

步骤（4）中对四叶参粉末在75%乙醇溶液中超声3次萃取的浸膏。

步骤（5）中在体外测定缺乳大鼠垂体前叶细胞催乳素的分泌情况。

本发明的有益效果在于：

（1）直接使用即将临产孕鼠进行实验，省去了雌鼠和雄鼠配对和孕期1个多月的时间，缩减了实验周期，降低了实验成本；

（2）本方法使用体外细胞进行测试，需要微量的测定样品即可，使得催乳作用的检测不会受到样品量不足的限制。

（3）本方法使用体外细胞进行测试，细胞株可以经过传代、冷冻及复苏后使用，不必在每次测定时准备造模的动物细胞，可直接对细胞复苏活化后进行测试，进一步缩减了实验周期，降低了实验成本。

附图说明

图1为溴隐亭组和生理盐水组阴性对照prl分泌情况比较。

图2为溴隐亭组给药后（乳泉颗粒和四叶参）prl分泌情况比较。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将其理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。显然，根据本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换和变更。

第一步：提取物的制备

取四叶参切成薄片，干燥，粉碎，过筛，于75%乙醇溶液中超声3次，每次30min；将三次滤液合并，减压抽滤分离上清液，减压干燥成干浸膏，即得四叶参提取物。

试验例1.评价催乳作用体外细胞模型的建立

1、试验材料

（1）四叶参：青岛流清河森宝生物科技开发有限公司提供，青岛大学药学院李英霞教授鉴定。

（2）乳泉颗粒：15克/袋，河南天方药业中药有限公司，批准文号:国药准字z20033022。

（3）甲磺酸溴隐亭片：2.5mg/片，匈牙利吉瑞大药厂生产，进口药品注册证号:h20110116，生产批号:t54343a。临用前用生理盐水配制成0.3mg/ml的药液。

（4）大鼠（rat）催乳素（prl）elisa试剂盒：购自南京建成生物科技有限公司。

（5）生理盐水：500ml，4.5g，山东齐都药业有限公司生产，国家准字号:h37020766，产品批号：8b13010402。

（6）sd大鼠：孕鼠，6只，由青岛市药检所实验动物中心提供，清洁级动物，合格证号:0014107。

2、试验方法：

选用成年健康清洁级sd大鼠孕鼠6只，产仔后母鼠和其仔鼠一起饲养，母鼠正常哺乳；产后第2d起，随机取母鼠3只，溴隐亭灌胃造模（3mg/kg/d），为a组，其余3只生理盐水灌胃作为阴性对照，为b组，连续7d。第8天将6只大鼠断头处死，分别取两组大鼠垂体前叶细胞胰蛋白酶消化；将两种细胞用dmem+10%fbs调整细胞密度，按照5000个/100ul/孔，接种于96孔板中，37度，5%二氧化碳，孵育过夜。于第二天，a组分别加入高、中、低浓度四叶参提取物（100、10、1ug/ml）和阳性药乳泉颗粒高、中、低浓度溶液（100、10、1ug/ml）1ul,样品用dmso溶解，空白对照组使用培养基+1uldmso；b组与a组同，培养36h。最后按照elisa试剂盒说明书要求，检测各孔催乳素含量，以测定不同浓度的四叶参样品和阳性药乳泉颗粒对缺乳大鼠垂体催乳素分泌的影响。

3、实验结果

与细胞b对照组比较，细胞a对照组prl分泌量明显降低（p<0.01），说明在体外环境培养的溴隐亭诱导大鼠的垂体细胞，prl分泌明显降低，提示本发明建立的缺乳细胞模型成功。与细胞a对照组比较，细胞a乳泉颗粒各给药组prl分泌量明显提高（p<0.01），并且具有良好的量效关系。说明催乳药物可以明显提高缺乳大鼠垂体细胞体外分泌prl的含量，提示本发明所涉及的评价催乳作用的体外细胞模型建立成功。结果见表1.

表1.药物对缺乳大鼠垂体细胞prl分泌的影响（±s，n=3）

注：与细胞b对照组比较^ap<0.01;与细胞a对照组比较^bp<0.01;与细胞a对照组比较^cp<0.01。

试验例2：四叶参提取物对缺乳大鼠体外细胞模型prl分泌影响

实验材料和实验方法同试验例1，实验结果为：与细胞a对照组比较，细胞a四叶参提取物各给药组prl分泌量明显提高（p<0.01），说明四叶参可以明显提高缺乳大鼠垂体细胞体外分泌prl的含量，并且具有良好的量效关系。提示本发明所涉及的体外细胞模型可以评价四叶参的催乳作用。

参考文献

[1]yonedan,iraharam,saitos,etal.usefulnessofrecombinanthumanprolactinfortreatmentofpoorpuerperallactationinaratmodel[j].eurjendocrinol,1995,133(5):613-7.

[2]steinmetsr,brownng,allendl,etal.theenvironmentalestrogenbisphenolastimulates

prolactinreleaseinvitroandinvivo[j].endocrinology,1997,138(5):1780-6.