人垂体腺瘤细胞系的建立及其应用的制作方法

本发明涉及一种制备人垂体腺瘤细胞系的方法，通过所述方法获得的人垂体腺瘤细胞系及其在医药研发中的应用。

背景技术：

垂体腺瘤是临床上常见的颅内良性肿瘤之一，在颅内肿瘤发病中占10％-15％。近年来，垂体瘤的发生率呈不断上升的趋势，垂体瘤通常发生于青壮年时期。无激素分泌异常的垂体腺瘤(non-functionpituitaryadenoma,nfpa)往往局部占位症状重，常导致失明等症状。垂体瘤分泌激素亢进，可导致患者泌乳素(prolactin，prl)，促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropichormone，acth)等激素水平的增高，从而引起患者满月脸、向心性肥胖、痤疮、毛发增多、高血压、继发性糖尿病和骨质疏松等症状，特别对于女性患者，可导致流产不孕，月经失调，未孕泌乳等后果，对患者及其家庭带来极大伤害。

因为垂体肿瘤良性特征的限制，体外建立人源细胞系非常困难。目前普遍用于垂体腺瘤体外实验的细胞系，均为大鼠和小鼠细胞系。因为缺乏成熟的人源垂体瘤细胞系，人垂体腺瘤体外研究受到很大限制。

1959年thompson等学者首次采用人垂体腺瘤组织进行体外肿瘤原代细胞培养，并测定这些培养细胞的分泌功能。因垂体腺瘤多数为良性腺瘤，肿瘤体积小，完整摘取瘤标本困难，且瘤块获得时所含杂质多，真正的瘤细胞数量少。并且其瘤细胞增殖能力有限，体外生长受到影响因素较多，因而很难在体外长期传代进行培养。wyche等培养了54代的生长激素腺瘤细胞，fuller等培养了20代的acth腺瘤细胞，missale等培养催乳素腺瘤细胞，且移植于裸鼠体内成瘤。jin等用病毒转染的方式，对无功能垂体腺瘤进行感染后，建立了hp75细胞系。但细胞培养的结果均未取得成功，截止目前世界上仍无人垂体腺瘤细胞系。值得注意的是，在垂体腺瘤中不可避免的出现成纤维细胞的过度生长，对成功培养细胞系产生很大的影响。

技术实现要素：

本发明提供一种制备人垂体腺瘤细胞系的方法、由所述方法获得的人垂体腺瘤细胞系及其应用。

在一个方面，本发明提供了一种制备人垂体腺瘤细胞系的方法，包括：

(a)将人垂体腺瘤移植于免疫缺陷的非人动物；

(b)当移植的垂体腺瘤重量达到非人动物体重的15％以上、例如20％、25％或30％以上时、或者当移植的肿瘤体积不再增加时，将所述垂体腺瘤取出并移植入新的免疫缺陷的非人动物；

(c)重复步骤(b)，当所述垂体腺瘤细胞的ki67阳性表达率为20％以上、例如30％以上、40％以上、50％以上或60％以上时，取出垂体腺瘤；

(d)培养取出的垂体腺瘤的细胞，获得垂体腺瘤细胞系。

如本发明所用，垂体腺瘤亦称垂体瘤，是属于内分泌系统的一种肿瘤，主要起源于垂体腺的前叶腺垂体，根据分泌产物可包括功能性垂体腺瘤和无功能型垂体腺瘤。垂体腺瘤可通过本领域已知的诊断检测方法诊断检测，包括实验室检查、影像学检查例如ct检查和mri检查以及内分泌学检查等。

在一个实施方案中，本发明所述垂体腺瘤是无功能型垂体腺瘤。无功能型垂体腺瘤是指内分泌功能不活跃或分泌产物不产生明显的内分泌学症状的垂体腺瘤，其并不使血中激素水平升高，也无激素过多症状。在一个实施方案中，本发明所述无功能型垂体腺瘤是肿瘤细胞表达激素例如生长激素(gh)的无功能型垂体腺瘤。

如本发明所用，免疫缺陷的非人动物是指免疫系统中任何一或多个环节或其组分缺陷而使免疫功能不全的动物。在一个实施方案中，本发明所述免疫缺陷的非人动物是t淋巴细胞功能缺陷的非人动物。在一个实施方案中，本发明所述免疫缺陷的非人动物是t淋巴细胞功能和b淋巴细胞功能都缺陷的非人动物。

在一个实施方案中，本发明所述免疫缺陷的非人动物选自免疫缺陷的小鼠、大鼠和斑马鱼，例如照射后的斑马鱼。

在一个实施方案中，本发明所述免疫缺陷的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，例如t淋巴细胞功能和/或b淋巴细胞功能缺陷的小鼠或大鼠。在一个实施方案中，本发明所述免疫缺陷的非人哺乳动物选自重症联合免疫缺陷(scid)小鼠，如scidbeige小鼠、nodscid小鼠或balb/c-nu小鼠。

在一个实施方案中，本发明所述免疫缺陷的非人哺乳动物是t和b淋巴细胞功能缺陷的非人哺乳动物，例如重症联合免疫缺陷(scid)小鼠，其特征在于所有的t、b细胞功能测试均为阴性，对外源性抗原无细胞免疫及抗体反应，体内缺乏携带前b细胞、b细胞和t细胞表面标志的细胞。在本发明一个具体实施方案中，本发明所述免疫缺陷的非人哺乳动物是scidbeige小鼠。

如本发明所用，移植是将取出的垂体肿瘤组织转移进非人动物中使得肿瘤在其中生长。本发明所述的肿瘤移植可以使用本领域已知的任何方法和手段进行(肖俊，人胰腺癌组织块小鼠皮下移植瘤模型的构建及生物学行为的观察，2014，华中科技大学，第61页；唐诗聪与潘泓，组织块移植法建立人肺癌裸鼠移植瘤模型，昆明医科大学学报，2014(11):第169-171页)。

在一个实施方案中，将肿瘤组织切成小块，例如3×3×3mm³，然后将小块植入动物中。植入部位可以根据本领域已知的标准进行选择，以使得移植的肿瘤组织能够继续生长发育。在一个实施方案中，本发明所述垂体肿瘤组织植入小鼠或大鼠血运比较丰富的部位，例如腋窝皮下。在一个实施方案中，本发明所述垂体肿瘤组织植入小鼠或大鼠左腋窝皮下。

如本发明所述，当移植的垂体腺瘤重量达到非人动物体重的15％以上、例如20％、25％或30％以上时，将所述垂体腺瘤取出并移植入新的免疫缺陷的非人动物。腺瘤重量可以通过本领域已知的任何方法测量，例如当肿瘤重量达到移植了垂体肿瘤的非人动物的体重的15-30％时，例如20-30％、25-30％、20-25％时，例如≥15％、20％、25％、30％时将垂体肿瘤从非人动物取出，再移植入新的免疫缺陷的非人动物。

在一个实施方案中，当所述移植的垂体肿瘤在移植动物中体积不再增大时，从所述动物中取出所述肿瘤，再将取出的肿瘤组织植入新的未移植肿瘤的免疫缺陷动物中。如本发明所用，所述“体积不再增大”是指在一定时间内肿瘤体积不再显著变大，例如在2周内变化不超过10％。在一个实施方案中，当所述移植的垂体肿瘤体积为3cm³时，将垂体肿瘤组织取出并植入新的免疫缺陷动物例如小鼠中。

检测移植肿瘤的免疫缺陷动物中肿瘤细胞的ki67表达率。当移植肿瘤的ki67细胞阳性率为20％以上时，不再进行移植，而是将肿瘤组织取出进行体外细胞培养。如本发明所用，ki67是由mki-67基因编码的核蛋白，又称之为mki-67。已知ki67分子的表达水平与细胞的增殖活跃程度相关。在肿瘤细胞中，ki67阳性率越高，说明肿瘤生长越快。

肿瘤细胞的ki67蛋白表达可以通过本领域已知的任何方法在蛋白水平或者核酸水平检测。例如，可以使用ki67的特异性结合物例如配体、适配体、抗体等测定所述ki67蛋白的表达水平，或者通过检测mki-67基因的转录水平来间接检测ki67蛋白的表达水平。在一个实施方案中，可以使用例如酶、发光或荧光标记的ki67特异性配体或探针直接检测ki67蛋白的水平，或者通过检测配体或探针与ki67的复合物来检测ki67蛋白的水平，从而确定肿瘤细胞ki67阳性率。如本发明所用，肿瘤细胞ki67阳性率是指表达ki67蛋白的肿瘤细胞数占检测的肿瘤细胞总数的百分比。

在本发明一个实施方案中，当移植了垂体肿瘤的动物中移植肿瘤细胞ki67阳性率为20％以上，例如30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或更高时，从所述动物中取出垂体肿瘤，不再移植，而是在培养基中培养以建立垂体肿瘤细胞系。

取出垂体腺瘤组织以及必要的处理过程根据本领域已知的方法和手段进行(例如参见肖俊，人胰腺癌组织块小鼠皮下移植瘤模型的构建及生物学行为的观察，2014，华中科技大学，第61页；唐诗聪与潘泓，组织块移植法建立人肺癌裸鼠移植瘤模型，昆明医科大学学报，2014(11)：第169-171页)。

在一个实施方案中，将取出的垂体肿瘤组织处理以获得单细胞。在一个实施方案中，将取出的垂体肿瘤组织用酶例如胶原酶消化，然后过滤以获得单细胞溶液。

在一个具体实施方案中，将取出的垂体肿瘤组织用胶原酶例如胶原酶i(例如0.1％100mg胶原酶i/100mlpbs)消化，然后过滤(例如使用1ml一次性注射器的无菌活塞在100目筛上轻轻研磨过滤)，将过滤后的细胞任选用pbs洗涤，并收集例如通过离心收集。

如本发明所用，垂体腺瘤细胞可根据本领域已知方法进行传代培养、维持、冻存、复苏等常规操作。在一个实施方案中，本发明所述垂体肿瘤细胞使用dmem培养基进行培养，所述dmem培养基含有胎牛血清(fbs)、胰岛素、肝素和非必需氨基酸。在一个实施方案中，本发明所述垂体肿瘤细胞在含有5％co2的培养箱中在37℃培养。在一个实施方案中，所述dmem培养基含有5-10％的fbs、0.5-1.5单位(u)/100ml的胰岛素、0.1-0.2mg/100ml的肝素和0.1-0.2mg/100ml的非必需氨基酸。在一个特定的实施方案中，所述dmem培养基含有10％的fbs、1u/100ml的胰岛素、0.1mg/100ml的肝素和0.1mg/100ml的非必需氨基酸。

传代培养可以使用常规方法进行，例如倾去培养液，用温pbs洗两次，随后加入0.25％胰酶消化液(含edta)没过单层，3分钟后迅速吸去消化液，加入含有10％fbs的培养基中和并反复吹打，按一定比例如1:5或1:6的比率接种分离培养。

根据本发明的方法获得的细胞可以使用本领域常规方法进行冻存，例如将制备的单细胞悬液离心后重悬于细胞冻存液(含90％血清及10％dmso)中，滴度冻存盒内-80℃静置过夜，然后迅速移入液氮中。

复苏冻存的根据本发明的方法获得的细胞的方法是本领域技术人员已知或者可以容易确定的，例如从液氮中取出冻存细胞，置37-40℃水浴中快速振摇使细胞快速融化，用新鲜的培养液悬浮细胞后，1000rpm离心5分钟，细胞用适当体积的培养基悬起，传至培养瓶(皿)中培养，待细胞长满后传代。传代的单细胞层，约在2小时左右后就可看到其附着在培养瓶壁的特性，2-4天即可在无菌培养瓶内形成单层，需要观察，换液，再传代。

在另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法获得的人垂体腺瘤细胞系。根据本发明所述方法获得的人垂体腺瘤细胞系成功传代30代以上，细胞生长状况良好。根据本发明所述方法获得的人垂体腺瘤细胞的ki67和gh免疫组化染色结果表明均为阳性，ki67为细胞核着色，gh为细胞质着色。

通过本发明方法获得的垂体腺瘤细胞系具有生长速度快，传代稳定，细胞再次移植小鼠皮下成瘤能力强，成瘤率高等优势。本发明获得的人垂体腺瘤细胞系对垂体腺瘤的肿瘤微环境、基因表达、放化疗干预等研究有着十分重要的意义。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得了人无功能型垂体腺瘤细胞系。在一个具体实施方案中，所述人无功能型垂体腺瘤细胞系是2016年5月12日以保藏号cgmcc12295保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的人垂体无功能腺瘤细胞系。

在另一个方面，本发明涉及通过本发明所述方法获得的人垂体腺瘤细胞系在医药研发中的应用。

在一个实施方案中，本发明涉及通过本发明所述方法获得的人垂体腺瘤细胞系在建立相应动物模型中的应用。在一个实施方案中，本发明涉及建立人垂体腺瘤细胞系动物模型的方法，包括将本发明的人垂体腺瘤细胞系植入感兴趣的动物中。在一个实施方案中，所述感兴趣的动物是前文所述的免疫缺陷的非人动物，例如免疫缺陷的小鼠、大鼠或斑马鱼。

在一个实施方案中，本发明涉及建立人垂体腺瘤细胞系动物模型的方法，包括(a)将人垂体腺瘤或者本发明的人垂体腺瘤细胞系移植于免疫缺陷的非人动物；和(b)当移植的垂体腺瘤重量达到非人动物体重的15％以上、例如20％、25％或30％以上时、或者当移植的肿瘤体积不再增加时，将所述垂体腺瘤取出并移植入新的免疫缺陷的非人动物。

在一个实施方案中，本发明涉及通过本发明所述方法获得的人垂体腺瘤细胞系或动物模型在研发诊断和/或治疗相应垂体肿瘤的药物中的应用。

在一个实施方案中，本发明涉及筛选用于治疗人垂体腺瘤的药物的方法，包括将候选化合物或组合物与本发明的人垂体腺瘤细胞系接触或者给予使用本发明的人垂体腺瘤细胞系制备的动物模型，然后检测所述细胞系的细胞生长或存活、或动物模型中肿瘤的生长或大小，由此选择能够抑制或杀伤肿瘤细胞、或抑制肿瘤生长或清除肿瘤的化合物或组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及通过本发明所述方法获得的人垂体腺瘤细胞系或动物模型在相应垂体肿瘤体外或体内研究中的应用。

本发明人成功地使用本发明的方法获得了人无功能型垂体腺瘤细胞系(hnfpa)并在使用本发明的人垂体腺瘤细胞系建立的动物模型上进行嵌和抗原受体修饰的t细胞治疗(car-t)，证实了细胞系hnfpa和垂体腺瘤动物模型的稳定性。并且皮下移植瘤组织块和垂体腺瘤细胞系hnfpa的垂体激素免疫组化色均提示gh激素阳性，结合病理he染色，验证了垂体腺瘤细胞系和动物模型的准确性。使用这一实验平台，本领域技术人员可以深入研究非编码rna调控靶基因对垂体腺瘤生长的作用机制等。

附图说明

图1为通过本发明方法获得的人无功能型垂体腺瘤细胞系(hnfpa)细胞的相差图。细胞在传代培养72小时后可见肿瘤细胞具有明显的体外成瘤生长能力。

图2为通过本发明方法获得的人无功能型垂体腺瘤细胞系(hnfpa)细胞表达人生长激素情况的检测图。无功能垂体腺瘤肿瘤成纤维细胞作为对照样本。

图3人无功能型垂体腺瘤移植小鼠中肿瘤细胞ki67表达。

图4是患者无功能垂体腺瘤组织块scidbeige皮下移植瘤传代后进行免疫组化he染色结果图。图4a-c：种植皮下的无功能垂体腺瘤移植瘤包块取出后观察；图4d和4f：取出包块的he染色；图4e：不表达人生长激素的无功能垂体腺瘤手术组织作为阴性对照；图4g：正常垂体组织作为阳性对照。

图5a是人无功能垂体腺瘤组织块scidbeige移植瘤进行car-t细胞治疗的萤光素酶检测结果图；图5b是患者自身外周血t细胞转染hcd87-car的共聚焦显微镜检测结果图，表明转染成功；图5c是患者自身无功能型垂体腺瘤组织块scidbeige皮下移植瘤进行治疗后的包块直接测量结果图。cd87-car-t：hcar-t细胞治疗组；nc-car-t：空白car-t细胞对照组；ns：生理盐水对照组。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，对本发明提供的技术方案进一步详细说明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例1：人垂体腺瘤细胞系和动物模型的建立

免疫缺陷鼠scidbeigecb17.cg-prkdcscidlystbg/crl(4周，雄性，20g)购买自维通利华生物技术有限公司。

1.1方法：通过经蝶单鼻孔入路垂体腺瘤切除术，取得无功能型垂体腺瘤肿瘤组织，然后置于含有1％双抗(青霉素和链霉素)的dmem培养液的15ml无菌试管中，尽量在4℃条件下运输至细胞培养室。在细胞无菌培养台里，使用含有1％双抗(青霉素和链霉素)的pbs液将组织块三次清洗后，用无菌手术剪刀在一次性无菌培养皿中仔细将组织剪碎成直径2mm左右的小块，再用pbs液清洗，移入另一无菌培养皿中，使用一次性吸管弃去pbs液。使用无菌10cm长度12号针头将组织块装入无菌3cm14号无菌针头中，将已填装完毕的14号无菌针头装入另一无菌培养皿中，封口膜封闭培养皿四周，4℃条件下带至重型免疫缺陷小鼠饲养动物房。

在动物房的消毒操作台上，使用去掉针头的一次性1ml无菌注射器，通过气压推力将14号无菌针头中的组织注射入腹腔注射麻醉的小鼠左腋窝皮下。进针后路径尽量弯曲，使用4号丝线缝和进针口，防止肿瘤组织漏出。在注射前后均用碘伏以预进针点周边2cm认真消毒，消毒前不需对注射点剪毛，同时消毒小鼠四个爪子，防止注射后小鼠抓进针口引起的污染。

术后每5天观察记录一次小鼠体重，并观察肿瘤生长情况，此小鼠记为第一代。观察至少12周时间，若有瘤体长出，使用数显游标卡尺测量肿瘤长径(a)及短径(b)，按公式计算肿瘤体积和体重。待瘤体达到3cm³时或重量为小鼠体重20％时，可颈部脱臼处死小鼠，快速完全浸泡于75％乙醇中30分钟。将小鼠移至一次性无菌培养皿上，使用无菌外科手术器械取出肿瘤组织，去除中心坏死部分、血液及筋膜组织，并按照上述步骤剪切成组织碎块，移植到新的scidbeige小鼠皮下，记为第二代，并且从此代开始，具体操作步骤同上述。

注：肿瘤体积计算公式v＝长*宽*宽/2(出处：euhusd,huddc,lareginam,johnsonf.(1986).tumormeasurementinthenudemouse.jsurgoncol31:229–234；tomaykom,reynoldsc.(1989).determinationofsubcutaneoustumorsizeinathymic(nude)mice,cancerhemother.pharmacol24:148–154.)，长和宽分别为瘤体长径a(mm)和短径b(mm)。

重复以上过程，待传至第四代时，此时ki67阳性率是≥20％，取出扩增的皮下移植瘤。ki67计数：数着色最明显的地方计数10个20倍视野，每次500个细胞，统计染色阳性细胞的比例，取平均值。

将取出的腺瘤组织进行垂体腺瘤原代细胞培养，包括：用i型胶原酶(0.1％100mg胶原酶i/100mlpbs)消化40分钟，然后使用1ml一次性注射器的无菌活塞在100目筛上轻轻研磨过滤，将过滤后获得的细胞悬浮在dmem(补加了fbs10体积％+1u/100ml胰岛素+0.1mg/100ml的肝素+0.1mg/100ml的非必需氨基酸)中，获得了人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa(图1)。

通过上述方法获得的人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa于2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc12295。

1.2结果：

第一代scidbeige小鼠移植瘤模型的建立及体内传代情况：一共收集了10例无功能垂体腺瘤患者肿瘤组织标本移植到scidbeige小鼠皮下，术后病理证实均为垂体腺瘤；第一代移植瘤成功例数共2例，成功率为20％。成功的2例中，第1例已成功传至第7代小鼠，并已成功建立来源于人垂体腺瘤组织块的小鼠皮下移植瘤模型，另1例已传至第2代。第一代移植瘤生长周数为9周，瘤体平均大小为2.26士0.69cm3。并且随着小鼠体内传代次数的增加，肿瘤生长速度加快。

每一代肿瘤从小鼠体内取出后可留取部分组织进行多聚甲醛固定及石蜡包埋，制备4μm切片并用苏木素和伊红进行染色(结果见图4)，并根据该患者人垂体生长激素gh(+)的免疫组化结果，采用免疫组织化学染色法检测增殖细胞核抗原(ki67)和人垂体生长激素的表达情况。

ki67和gh免疫组化染色(针对gh使用单抗nb500-364(rabbitmab，corp.novusbiologicals,usa)作为一抗，针对ki-67使用单抗8d5(mousemab#9449，cst，usa)作为一抗，使用hrp标记的二抗通过dab显色，并用苏木素复染细胞核，使用imagepro-plus6.0软件分析免疫组化图片，应用spss16.0分析处理数据(单因素方差分析和t检验，p＜0.5表示有统计学意义)。结果显示：二者在病人组织及各代移植瘤内均为阳性表达，ki67为细胞核着色，gh为细胞质着色。ki67呈现出表达增强的趋势。(见图3)

1.3结论：直接移植垂体腺瘤患者的肿瘤组织块可以成功建立垂体腺瘤小鼠皮下移植瘤模型，该移植瘤组织形态与其来源较为相似，可稳定传代。

实施例2：人垂体腺瘤细胞系的证实

将根据实施例1获得的人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa的5×10⁶细胞接种在10ml含有10％fbs、1u/100ml的胰岛素、0.1mg/100ml肝素和0.1mg/100ml非必需氨基酸的dmem培养基中并在5％co2、37℃培养。当细胞形成贴壁生长的单细胞层，倾去培养液，用温pbs洗两次，随后加入0.25％胰酶消化液(含edta)没过单层，3分钟后迅速吸去消化液，加入3倍体积新鲜的含有10％fbs的dmem培养基中和并反复吹打，按1:5或1:6的比率接种新鲜的含有10％fbs、1u/100ml的胰岛素、0.1mg/100ml肝素和0.1mg/100ml非必需氨基酸的dmem培养基在5％co2、37℃继续培养传代。

接种的细胞一般于1小时后即能贴壁生长，根据接种的细胞的密度，3天到4天后可形成贴壁生长的单细胞层，5天后可见部分细胞呈立体球状生长。

将所述人无功能型垂体腺瘤细胞系传代超过30代后，细胞生长状况良好。

垂体腺瘤细胞的形态检测

垂体腺瘤细胞的形态及结构均建立在细胞培养的基础上，具有以下特点：主要由圆形和多边形两种类型为主，细胞生长密集时可在上述液体培养基中部分呈立体球状生长。见图1。

体外培养细胞上清激素测定

基本过程设立实验组及对照组，实验组取如实施例1所述制备的人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa传代细胞第5，10，15，20，25，30代上清液，对照组取原代培养的生长激素腺瘤细胞上清液，采用光化学法对每组激素的分泌进行上机检测。结果见下表1，示出人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa无激素分泌。

表1：

-：未检出

细胞生长激素表达测定

抗人垂体生长激素单克隆抗体染色阳性表达在细胞质内，阳性颜色呈黄棕色颗粒状；先用×100-200的视野下，对×200-400肿瘤细胞进行观察，按照一定顺序，基本确定后在×400视野下，继续观察200个肿瘤细胞；并确定计算免疫细胞反应阳性的百分比率。

根据细胞阳性化学反应显色强度及范围进行评估：半定性(l)阴性(一)：视野内阳性细胞小于巧％，或无染色阳性的细胞；(2)弱阳性(+)：视野内阳性染色细胞在小于25％或着色浅；(3)中阳性(++)视野内阳性细胞在26％一50％之间或着色深；(4)强阳性(+++)：视野内阳性细胞大于60％以上。对照：代替一抗的磷酸缓冲液片子，作为阴性对照，用已知垂体腺瘤阳性切片作为阳性对照。结果见图2，表明人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa表达生长激素。

实施例3：皮下移植无功能型垂体腺瘤模型干预实验

利用实施例1制备的患者自身无功能型垂体腺瘤重型免疫缺陷鼠scidbeige组织块皮下移植瘤模型进行干预实验。重型免疫缺陷鼠scidbeige购买自维通利华生物科技有限公司。患者已签署知情同意书。

实验步骤如下：

1、scidbeige2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mg/kg)，将带有无功能腺瘤细胞的新鲜组织切成3×3×3mm³的组织块移植于scidbeige左腋窝皮下，建立对应人无功能型垂体腺瘤手术组织块重型免疫缺陷鼠scidbeige移植瘤模型。分别在移植后第5，10，15，20，25天进行历史和影象分析。对移植部位皮下肿块进行测量，明确肿瘤包块大小。当肿瘤包块长到体积为3cm³左右，进行下面第2步实验。

2、scidbeige2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mg/kg)，将200μl1×10⁶hcar-t细胞(参见中国专利申请201510829241.1)在scidbeige移植瘤模型包块形成的第1、2和3周分别进行尾静脉注射。分别在注射后第5，10，15，20，25天进行fx-pro活体成像分析(in-vivoimagingsystemfx,corp.carestreamhealth)。并对移植部位皮下肿块进行测量。结果如图5a和图5b所示。图5c中的纵坐标为肿瘤包块的体积。对于scidbeige皮下的包块，能够利用游标卡尺测量，得出包块的体积。

如图5a所示，患者原代hcar-t细胞模型在体内第25天达到特异性杀伤肿瘤的最佳效果，肿瘤缩小了95％以上，而对照组可能由于t细胞缺少膜表面的hcd87scfv，对肿瘤抗原hcd87特异性结合不强，或未能有效激活t细胞的肿瘤特异性杀伤作用造成无效。患者原代hcar-t细胞能够有效地特异性杀伤肿瘤。如图5a和图5b所示，上述实验结果验证了患者原代hcar-t在体内对无功能型垂体腺瘤scidbeige移植瘤的特异性杀伤能力较强。

实施例4：使用人无功能型垂体腺瘤细胞系建立垂体腺瘤动物模型

将根据实施例1的方法制备的人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa(cgmmc12295)以1×10⁷细胞/100μlpbs，使用1ml一次性胰岛素注射器(u40，corp.bd，usa)注射入scidbeige小鼠左腋窝皮下，注射体积1ml，注射前后，碘伏消毒注射处，建立对应人无功能型垂体腺瘤重型免疫缺陷鼠scidbeige移植瘤模型。分别在植入后第5，10，15，20，25天进行历史和影象分析。对移植部位皮下肿块进行测量，明确肿瘤包块大小。如实施例2所述检测动物血液中激素水平和肿瘤细胞生长激素表达。当肿瘤包块长到体积为3cm³左右，进行下面第2步实验。

2、scidbeige2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mg/kg)，将200μl1×10⁶hcar-t细胞(参见中国专利申请201510829241.1)在scidbeige移植瘤模型包块形成的第1、2和3周分别进行尾静脉注射。分别在注射后第5，10，15，20，25天进行fx-pro活体成像分析(in-vivoimagingsystemfx,corp.carestreamhealth)。并对移植部位皮下肿块进行测量。

结果显示采用人无功能型垂体腺瘤细胞系hnfpa(cgmmc12295)建立的动物血液中激素水平无异常，肿瘤细胞表达生长激素，而且患者原代hcar-t细胞模型在体内第25天达到特异性杀伤肿瘤的最佳效果，肿瘤缩小了95％以上。表明患者原代hcar-t在体内能够特异性杀伤无功能型垂体腺瘤scidbeige移植瘤。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。