本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种B细胞抗原受体(BCR)重链(H链)CDR3白血病致病序列及筛选方法和应用。
背景技术：
：白血病，是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，并导致大量异常的白细胞[1]。症状包括出血和淤血，感觉疲倦，发热和感染的风险增加等[2]。这些症状发生是由于正常血细胞的缺乏，通过骨髓活检来诊断[2]。白血病的危险因素包括吸烟，电离辐射，某些化学物质(如苯等)，既往化疗和唐氏综合症[3][4]。白血病的四种主要类型为急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)以及一些不常见的类型[4][5]。从正常的造血细胞向癌细胞的发展涉及到克隆进化的多步骤过程，这由一系列体细胞突变所驱动。这些突变逐渐将细胞从正常生长转化到癌前状态及最终的癌状态，其中旨在调控细胞生长的所有检查点被打破。恶性转化的诱导似乎涉及到至少两个不同的阶段：起始(initiation)和促进(promotion)。起始涉及到基因组的变化，但它本身不导致恶性转化。恶性转化需要第二个步骤，称为促进。在起始阶段后的侵袭性细胞分裂过程中，因新的DNA改变不断积累，促进可能发生，通常影响原癌基因、肿瘤抑制基因或凋亡基因，导致不受调控的细胞生长。新一代测序通过深度测序检测稀有克隆类型或细胞中的突变的能力，使其能够研究免疫效应子在恶性血液病发病中的作用。一个明显的例子是大量报道认为克隆干细胞疾病的发病牵涉到自身反应性T细胞克隆，例如骨髓增生异常综合征(MDS)和再生障碍性贫血(AA)[6]。这些研究已经得到广泛统一的认识，即抗肿瘤免疫力的破坏，这在生理上是由T细胞介导的，可能容易诱发恶性血液病的发展。总之，这些T细胞库研究以及将免疫球蛋白重链的重排牵连到急性淋巴细胞白血病的克隆进化的新报道已迅速成为血液学中最令人兴奋的研究领域之一[7-9]。免疫组库是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。在机体的多种疾病进程中，都有免疫过程参与，而这些疾病特异性的免疫反应，能被机体及时记录下来。通过检测这些表达的B细胞或T细胞受体基因，就能准确的将其反映出来，用来评估个体的免疫状态，疾病的发生，发展和预后，甚至指导治疗。随着人们对免疫组库理解的深入，其研究技术也经历了3个主要发展阶段，从最初的流式细胞术分析T细胞各亚家族的分布与缺失，到免疫扫描谱系分析技术研究各亚家族CDR3基因长度的多态性，乃至今天高通量测序技术能够完整的检测所有T细胞、B细胞的CDR3序列，免疫组库研究取得引人瞩目的重要进展[10]。当前主要的免疫组库测序(ImmuneRepertoiresequencing，IR-SEQ)技术是以B/T淋巴细胞为研究目标，以多重PCR目的扩增决定B细胞抗原受体(Bcellreceptor，BCR，简称B细胞受体)或T细胞抗原受体(Tcellreceptor，TCR，简称T细胞受体)多样性的互补决定区CDR3，再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性以深入挖掘免疫组库与疾病的关系。肿瘤是当前威胁人类健康最严重的疾病之一，寻找特异性的肿瘤标志物对肿瘤的早期发现以及选择合适的治疗方案具有重要意义。B胞受体测序(BCRseq)，采用多重扩增的手段获取BCR重链的CDR3区域，结合高通量测序技术以及生物信息学分析手段，分析VDJ重排的方式等，已经开始应用于肿瘤(如卵巢癌，肾细胞癌)、自身免疫性疾病、器官移植免疫监测、疫苗注射免疫监测等领域[11，12-13]。参考文献：1."GeneralInformationAboutAdultHodgkinLymphoma".NationalCancerInstitute.2014-04-23.Retrieved20June2014.2.GeneralInformationAboutAdultNon-HodgkinLymphoma".NationalCancerInstitute.2014-04-25.Retrieved20June2014.3.AdityaBardia(2010).JohnsHopkinsPatients'GuidetoLymphoma.Jones&BartlettLearning.p.6.ISBN9781449631413.4.TheLymphomaGuideInformationforPatientsandCaregivers(pdf).LeukemiaandlymphomaSociety.2013.Retrieved20June2014.5.WorldCancerReport2014.WorldHealthOrganization.2014.pp.Chapter5.13.ISBN9283204298.6.Fozza,C.,andLonginotti,M.(2013)T-cellreceptorrepertoireusageinhematologicmalignancies.Criticalreviewsinoncology/hematology86:201–2117.Faham,M.,Zheng,J.,Moorhead,M.,Carlton,V.E.H.,Stow,P.,etal.(2012)Deep-sequencingapproachforminimalresidualdiseaseetectioninacutelymphoblasticleukemia.Blood120:5173–51808.Gawad,C.,Pepin,F.,Carlton,V.E.H.,Klinger,M.,Logan,A.C.,etal.(2012)MassiveevolutionoftheimmunoglobulinheavychainlocusinchildrenwithBprecursoracutelymphoblasticleukemia.Blood120:4407–44179.Jan,M.,Snyder,T.M.,Corces-Zimmerman,M.R.,Vyas,P.,Weissman,I.L.,etal.(2012)ClonalEvolutionofPreleukemicHematopoieticStemCellsPrecedesHumanAcuteMyeloidLeukemia.ScienceTranslationalMedicine4:149ra118–149ra11810.SixA,Mariotti-FerrandizME,ChaaraW,MagadanS,PhamHP,LefrancMP&BoudinotP.ThePast,Present,andFutureofImmuneRepertoireBiology–TheRiseofNext-GenerationRepertoireAnalysis.FrontImmunol2013；4:413.doi:10.3389/fimmu.11.WoodsworthDJ,CastellarinM,HoltRA.SequenceanalysisofT-cellrepertoiresinhealthanddisease.GenomeMed.2013；5(10):98.12.DavidWu,AnnaSherwood,JonathanR.Fromm,StuartS.Winter,KimberlyP.Dunsmore,High-ThroughputSequencingDetectsMinimalResidualDiseaseinAcuteTLymphoblasticLeukemia.SciTranslMed2012；4,134ra6313.RobinsHS,EricsonNG,GuenthoerJ,etal.DigitalGenomicQuantificationofTumor-InfiltratingLymphocytes[J].ScienceTranslationalMedicine,2013,5(214):214ra169.技术实现要素：本发明所解决的现有技术的问题是：白血病发病机制复杂，病因至今仍未完全清楚，缺少有效的早期诊断和检测技术，而传统检测手段、PET(正电子发射断层显像)、CT(计算机断层扫描显像)等方法多是针对疾病的中后期的状态。本发明人在锐意研究后发现了一个B细胞受体CDR3白血病致病序列。该序列的发现可以用来制备治疗同白血病相关的试剂，用来进行白血病复发的早期诊断或进行无创确诊等。B细胞受体CDR3白血病致病序列的发现是采用免疫组库测序技术，以白血病患者的B淋巴细胞为研究目标，采用优化的多重PCR的技术对B细胞受体H链最具多样性的互补决定区CDR3区进行扩增，再结合高通量测序技术，全面分析BCR组成，评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与白血病的关系。具体而言，一方面，本发明提供了一种BCR重链CDR3白血病致病序列，所述序列为SEQIDNO.1。优选的，所述序列采用高通量的方式进行测序得到，所述序列通过扩增V区和J区序列并进行比对得到。优选的，所述V区序列扩增引物为SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13和SEQIDNO.14；所述J区序列扩增引物为SEQIDNO.2。另一方面，本发明提供了一种B细胞受体重链CDR3白血病致病序列的筛选方法，包括如下步骤：(1)样本制备：外周血取样，提取样本RNA；(2)文库制备及测序：将RNA反转录为cDNA，然后采用多重PCR扩增B细胞受体重链CDR3序列，并进行上机测序；(3)下机数据进行生物信息分析：采用软件对生物序列数据进行分析，筛选出序列SEQIDNO.1。优选的，所述步骤(2)中进行多重PCR扩增时，采用V区引物SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13和SEQIDNO.14和J区引物SEQIDNO.2扩增V区和J区序列。优选的，所述步骤(2)，对B细胞受体重链CDR3序列进行末端修复和末端加A，然后连接adapter。同时，本发明提供了以上任一项所述的序列在制备诊断和/或治疗同白血病相关的试剂中的应用。优选的，所述试剂包括试剂盒、试纸或高通量测序用试剂。优选的，所述试剂盒包括用于序列SEQIDNO.1基因转录水平检测的试剂盒；所述试纸包括用于序列SEQIDNO.1基因转录水平检测的试纸；所述高通量测序用试剂包括用于序列SEQIDNO.1基因转录水平的高通量测序用试剂。本发明的有益效果是：(1)通过扩增B细胞受体重链(H链)CDR3并进行高通量测序，对患者治疗前后的BCRH链CDR3的多样性及特异性进行研究，发现与白血病疾病相关的一条CDR3序列。检测血液中BCR(H链)CDR3多样性及特异性具有无创、可随时监控的特点，因此通过BCR-seq检测外周血BCR(H链)CDR3的表达特征，可与临床检测结果相结合，以实现结白血病的早期诊疗或对治疗效果的评估。(2)健康个体在无抗原刺激时，BCR基因重排是随机的，因此正常人外周B细胞呈多家族、多克隆性特点。当不同抗原刺激后，CDR3区域可对该抗原产生特异性识别并产生高亲和力突变，使带有这类基因的B细胞得到优势扩增，通过对待检者外周血PBMC中的B细胞受体重链CDR3进行扩增及高通量测序，可分析与疾病相关的免疫CDR3序列，从而为应用于白血病的诊断和治疗提供另一种治疗与评估手段。1)微创性：正常受检者及肿瘤患者只需要提供5mL外周血样本；2)实时性：可对受检者进行多次实时采血进行检测3)高通量：基于新一代测序技术的免疫组库测序，能够在很短的时间内同时进行多例样本检测。一次测序得到百万级别条数的序列信息。下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明。附图说明图1为实施例一的白血病患者治疗前与治疗后15天与30天的致病克隆情况图。具体实施方式如上所述，本发明提供了一种B细胞受体H链CDR3白血病致病序列及筛选方法和应用。在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供了一种B细胞受体H链CDR3白血病致病序列，其序列为SEQIDNO.1。在本发明的另一种优选实施方式中，B细胞受体H链CDR3白血病致病序列SEQIDNO.1可以用来制备治疗或诊断同白血病相关的试剂。利用该被诊断的试剂进行检测时，检测到被测人员中含有该序列，则被测人群患有白血病或者很大程度上患有白血病的风险。其中，在本发明的具体实施例中，采用免疫组库技术对白血病患者的B细胞受体CDR3序列进行分析，筛选出同白血病致病相关的序列。实施例一本实施例为对1例白血病患者治疗前和治疗后不同时间共三次抽血样本，分别进行了BCR重链CDR3的测序检测。免疫组库测序检测以外周血中分离的PBMC作为研究对象，具体操作如下：1.外周血取样1)取患者外周血样本5ml于EDTA抗凝管中。上下轻轻颠倒4-6次充分混匀后，室温放置，并在2小时以内完成PBMC分离工作；2)加入3倍体积的无菌生理盐水，上下颠倒混匀；3)取3ml细胞分层液于15ml离心管中，并小心的吸取2)步稀释的全血细胞4ml沿管壁叠加于分层液面上，体积大于4ml的分多管进行。水平离心，400g，室温条件下离心30分钟；4)小心吸取淋巴细胞层，置于另一离心管中，加入5倍以上体积的无菌生理盐水，400g室温条件下离心10分钟；5)倒掉上清液，加入1mlTRIzol。用吸头反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；转移至2ml离心管。6)液氮速冻后-80°保存，干冰盒运输，避免反复冻融。2.RNA的提取采用TrizolReage，货号15596-018，规格200ml，厂家INVITROGEN试剂盒对患者RNA进行提取。步骤如下：1)每管PBMC加入1mlTrizol，混均，冰上放置5min。2)加入氯仿0.2ml/管，振摇15s。15-30℃孵育2-3min，4℃，12000g，离心15min。3)吸取上层无色液体转移至新的EP管中。4)加入等体积异丙醇，混匀，15-30℃孵育10-30min，4℃,12000g，离心10min。5)去上清，加入75％乙醇1ml，涡旋振荡30s，4℃，7500g，离心5min。6)吸净上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置3-5min。7)加入20ulDEPC水溶解，-80℃冰箱保存。3.RNA反转录(RNAreversetranscripyion)按照表1所示，采用SuperScriptIIReverseTranscriptase，货号18064-014，规格10000u，厂家：INVITROGEN反转录试剂盒和RNASEOUTRECOMB.R，货号10777019，规格5000UNITS，厂家：INVITROGEN试剂盒对步骤2制得的RNA进行反转录，得到cDNA。表1RNA反转录体系4.文库构建4.1多重PCR(multiplexpolymerchainreaction)扩增T细胞受体CDR3区4.1.1使用QIAGEN公司的MultiplexPCR试剂盒，配置PCR的反应体系，进行PCR，其中PCR反应体系见表2，V区引物和J区引物序列见表3，PCR反应条件见表4。引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。表2PCR反应体系其中，表2中用到的V区引物和J区引物序列如表3所示：表3V区引物和J区引物序列SEQIDNO.2IgHJCTACGGAGACGGTGACARKSATSEQIDNO.3IgHV1-aAGACACACCATGACCAACGACSEQIDNO.4IgHV1-bAGAGTTACAAKRACCACGGACSEQIDNO.5IgHV1-cAGTGTCACTATGACTGAGGACSEQIDNO.6IgHV1-dAGAGTCACTATTACYAGGGACSEQIDNO.7IgHV1-eAGAGTCACGASWACCRCGGACSEQIDNO.8IgHV1-fAGAGTCACCAAGACCAGGATCSEQIDNO.9IgHV2ACCAGGCTCATCATYWCCAAAGSEQIDNO.10IgHV3GGCCGATTCACCATCTCCAGSEQIDNO.11IgHV4CGAGTCACCATRTCMGTACACSEQIDNO.12IgHV5CAGCTGACAAGTCCATCCGCSEQIDNO.13IgHV6AGTCTAATAACCATCAACACAGSEQIDNO.14IgHV7GACGGTTTGCCTTCTCCTAG其中，表3中的R、K、S、Y、W、M分别代表简并碱基，其中R为A或G，K为G或T，S为G或C，Y为C或T，W为A或T，M为A或C。表4PCR反应条件4.1.2多重PCR产物，QIAquickGelPurificationKit(QIAGEN)纯化胶回收产物1)配置2％的回收胶2)将多重PCR产物进行电泳，400mA，100V，电泳2h3)EB染胶4)片段选择：100-200bp；5)使用30ul超纯水进行回溶。4.2末端修复采用SureSelectXTReagentkit，HSQ，16-G9611A，厂家：AgilentTechnologies和HerculaseIIFusionDNAPlymerase，货号600677，规格200rxn，厂家：AgilentTechnologies试剂盒对得到的多重PCR产物进行末端修复，其中修复步骤如下：1)在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系，其中末端修复反应体系见表5。表5末端修复反应体系多重PCRDNA产物30μLddH2O45μL10xPolynucleotideKinaseBuffer(B904)10μLdNTPSolutionMix(10mM)4μLT4DNAPolymerase5μLKlenowFragment1μLT4PolynucleotideKinase5μL2)上述100μL反应混合物轻微振荡混合均匀，瞬时离心，在Thermomixer中20℃温浴30min。3)用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN)纯化产物，34μL回溶。4.3末端加“A”(A-Tailing)采用SureSelectXTReagentkit，HSQ，16-G9611A，厂家：AgilentTechnologies和HerculaseIIFusionDNAPlymerase，货号600677，规格200rxn，厂家：AgilentTechnologies试剂盒对末端修复产物进行末端加A，其中操作步骤如下：1)在1.5ml的离心管中配制末端加“A”反应体系，见表6。表6末端加A反应体系DNA32μL10xbluebuffer5μLdATP(1mM)10μLKlenow(3’-5’exo-)3μL2)上述50μL反应混合物轻微振荡混合均匀，瞬时离心后置于Thermomixer中37℃温浴30min。3)用QIAquickMinElutePCRPurificationKit(QIAGEN)纯化产物，17μL回溶。4.4Adapter的连接(AdapterLigation)采用SureSelectXTReagentkit，HSQ，16-G9611A，厂家：AgilentTechnologies和HerculaseIIFusionDNAPlymerase，货号600677，规格200rxn，厂家：AgilentTechnologies试剂盒对末端加A产物进行adapter的连接，其中操作步骤如下：1)在1.5ml的离心管中配制Adapter连接反应体系：表7adapter连接反应体系DNA15μL2xRapidligationbuffer25μLPEAdapteroligomix(1μM)5μLT4DNALigase(Rapid)5μL2)上述50μL反应混合物轻微振荡混匀，瞬时离心后置于Thermomixer中20℃温浴15min。3)QIAquickMinElutePCRPurificationKit纯化产物，25μL回溶。4.5连接产物PCR按照表8所述的体系和表9所述的PCR反应条件，对连接产物进行PCR扩增。表8PCR反应体系DNA23μLPrimer1公用(10μm)1μLPrimerindexX(10μm)1μL2×phusionmastermix25μL总体积50μL表9PCR反应条件4.6连接产物的纯化(AGENCOURTAMPureXPbeads)采用AgencourtAMPureXP-Medium，货号：A63882，厂家：Beckman进行连接产物的纯化。在50μL连接产物中，加入1.2倍体积的磁珠(60μL)，进行磁珠纯化，加入20μLUltraPureWater，进行回溶。5.文库检测使用Agilent2100Bioanalyzer检测文库大小；使用qPCR定量检测文库产量6.上机测序BCR-seq采用IlluminaHiSeq进行上机测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。7.下机数据生物信息分析及免疫组库测序结果分析7.1生物信息分析1)测序数据的预处理，低质量，接头污染等进行过滤。2)使用免疫组库多套分析软件并行分析，以确保所找出序列准确性。使用软件为(MiXCR，IMonitor等)3)根据治疗前后的结果比较，确认与疾病相关CDR3序列7.2免疫组库测序结果分析我们从白血病患者治疗前的备注样品中找出治疗克隆为SEQIDNO.1的序列，其中SEQIDNO.1序列如下：TGTGCGAGAGTCCCTGTATAGCAGCTCGTCCGGTGGTGGCTGG其中，治疗前患者的SEQIDNO.1的占比为62.81％；治疗后15天患者的SEQIDNO.1的占比为22.06％。治疗30天后为未检测到该克隆。其中将白血病治疗前与治疗后15天与30天的致病克隆情况用图1表示，图示Pre为治疗前，治病克隆比率为62.81％，治疗后15天该克隆比率降为22.06％，在治疗30天后检测不到该克隆情况。以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。当前第1页1 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