华法林‑4‑O‑乙酰‑Arg/Asp,其合成,活性和应用的制作方法
本发明涉及华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp,涉及它们的制备方法，涉及它们的抗动脉血栓活性，涉及它们的抗静脉血栓活性，涉及它们降低体内维生素k的含量的作用，涉及它们降低体内凝血因子ⅱ的含量的作用，涉及它们抑制血小板聚集的作用。因而本发明涉及它们在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备抑制血小板聚集药物中的应用、在制备维生素k拮抗剂中的应用和在制备凝血因子ii拮抗剂中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
动脉血栓和静脉血栓两种病症已成为当下发病率高和死亡率高的疾病。其中静脉血栓症主要包括深静脉血栓和肺栓塞。深静脉血栓和肺栓塞发病的患者数超过了心肌梗塞和中风发病的总人数，而且比乳腺癌和艾滋病所引起死亡的总人数高。由于动脉血栓症和静脉血栓症的发病率随年龄增长呈指数态增加，所以两种病症对我国这样的老龄化国家的人民健康的威胁尤其严重。如果把人口基数考虑进去，对我国国计民生的绝对负面影响尤其严重。于是，动脉血栓症与静脉血栓症的预防及治疗一直是医药领域所关注的重点。虽然华法林作为代表药物于1941年被用于临床实践，由于华法林的窗口窄，其剂量不足会有导致肺栓塞的可能，而剂量过量有导致致命性出血的风险。过去的50多年对华法林进行了大量结构改造，却都没有能够得到抗静脉血栓活性强的类似物。与传统的思维不同，发明人修饰华法林结构的目标是，将华法林转化为具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重活性的类似物。不过，也一直未能如愿。之后，又经过5年探索，发明人发现华法林的4位用乙酰arg或乙酰asp修饰，生成的华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp在体外抗血小板聚集模型上显示优秀的抗血小板聚集活性。显然，它们不是华法林的前药。华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp的抗动脉血栓活性比阿司匹林强167倍，抗静脉血栓活性比华法林强487倍。可见，本发明具有显著的技术进步。于是，发明人提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一个内容是提供华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp。
本发明的第二个内容是提供华法林衍生物的合成方法，该方法包括：
1.合成华法林-4-o-乙酸苄酯；
2.合成华法林-4-o-乙酸；
3.华法林-4-o-乙酸与arg-obzl或asp(obzl)-obzl缩合；采用dcc(二环己基碳二亚胺)为缩合剂，采用hobt(1-羟基苯并三氮唑)为催化剂的液相缩合的方法；
4.合成华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp；
本发明第三个内容是评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp的抗动脉血栓作用。
本发明第四个内容是评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp的抗静脉血栓作用。
本发明第五个内容是评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp抑制由血小板活化因子(paf)、凝血酶(th)及二磷酸腺苷(adp)诱导的血小板聚集的作用。
本发明第六个内容是评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp降低体内维生素k含量的作用。
本发明第七个内容是评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp降低体内凝血因子ⅱ含量的作用。
附图说明
图1华法林-4-o-乙酰-arg或华法林-4-o-乙酰-asp的合成路线.(i)溴-2-乙酸苄酯,丙酮,k2co3,45℃；(ii)ch3oh,pd/c,h2；(iii)dcc,hobt,nmm,四氢呋喃；(iv)ch3oh,pd/c,h2.
图2华法林-4-o-乙酰-arg或华法林-4-o-乙酰-asp的抗动脉血栓活性，n＝10；
图3华法林-4-o-乙酰-arg或华法林-4-o-乙酰-asp抗静脉血栓活性，n＝10；
图4华法林-4-o-乙酰-arg或华法林-4-o-乙酰-asp对大鼠体内维生素k的含量的影响，n＝5；
图5华法林-4-o-乙酰-arg或华法林-4-o-乙酰-asp对大鼠体内fⅱ含量的影响，n＝5；
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备华法林-4-o-乙酸苄酯
将3.31g(10.00mmol)华法林置于100ml茄瓶中，加入约40ml丙酮，未能将其完全溶解，45℃油浴加热搅拌至华法林溶解，加入1.73ml(11.00mmol)溴-2-乙酸苄酯，继续于45℃油浴下进行反应，约1h后发现有白色固体附于瓶壁上。反应48h后，薄层层析(tlc，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)监测反应进程，华法林消失，将反应产生的无色固体滤去，减压除去丙酮，得到淡黄色油状物，通过硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝8:1)，得到3.02g(65％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):457[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝7.89(dd,j1＝3.0hz,j2＝9.0hz,1h),7.63(dt,j1＝3.0hz,j2＝9.0hz,1h),7.43～7.31(m,9h),7.24(t,j＝9.0hz,2h),7.15(tt,j＝9.0hz,1h),5.26(s,2h),5.61(s,1h),5.02(d,j＝15.0hz,1h),4.85(d,j＝15.0hz,1h),4.97(t,j＝9.0hz,1h),3.45(dq,j1＝9.0hz,j2＝18.0hz,2h),2.11(s,3h)。
实施例2制备华法林-4-o-乙酸
将2.26g(4.95mmol)华法林-4-o-乙酸苄酯溶于20ml甲醇中，加入220mg钯碳(pd/c)，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌10h。tlc监测反应完全，过滤除去pd/c，滤液减压浓缩除去溶剂，残留物用石油醚固化，无水乙醚进行磨洗，得到1.72g(93％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):367[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝12.86(s,1h),7.90(d,j＝6.0hz,1h),7.63(t,j＝6.0hz,1h),7.43～7.34(m,4h),7.27(t,j＝9.0hz,2h),7.17(t,j＝9.0hz,1h),4.99(t,j＝9.0hz,1h),4.75(q,j1＝15.0hz,j2＝30.0hz,2h),3.54～3.47(m,2h),2.14(s,3h)。
实施例3制备华法林-4-o-乙酰-arg(no2)-obzl
将2.03g(5.55mmol)华法林-4-o-乙酸加入到100ml茄瓶中用30ml干燥四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入0.74g(5.48mmol)hobt及1.36g(6.60mmol)dcc，活化45min。有大量二环己基脲(dcu)析出。将2.38g(5.48mmol)tos·arg(no2)-obzl溶解于30ml四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用n-甲基吗啉(nmm)调节ph值到8～9，在室温下搅拌反应8h后tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除dcu，将滤液减压除去溶剂，残留物用50ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶的dcu，滤液分别用饱和na2co3溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)，饱和khso4溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)，饱和na2co3溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)洗涤，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色油状物，进行硅胶柱层析纯化(石油醚/丙酮＝2:1)，得到无色固体2.80g(84％)。esi-ms(m/e):658[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.81(t,j＝8.1hz,1h),8.45(s,1h),7.83(d,j＝7.8hz,1h),7.62(t,j＝7.8hz,1h),7.44～7.33(m,9h),7.25(t,j＝6.9hz,2h),7.16(t,j＝6.9hz,1h),5.17(s,2h),4.89(t,j＝7.2hz,1h),4.59(s,2h),4.46(m,1h),3.36(m,2h),3.17(m,2h),2.12(s,3h),1.90～1.76(m,2h),1.57(m,2h)。
实施例4制备华法林-4-o-乙酰-arg
将1.06g(1.73mmol)华法林-4-o-乙酰-arg(no2)-obzl溶于50ml甲醇中，加入100mgpd/c，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌反应约30h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，将pd/c过滤除去，滤液减压除去溶剂，用石油醚将其固化成无色固体，利用c18柱层析方式将其纯化，得到无色固体产品510mg(60％)。mp:159-161℃；
实施例5制备华法林-4-o-乙酰-asp(obzl)-obzl
将2.03g(5.55mmol)华法林-4-o-乙酸加入到100ml茄瓶中用30ml干燥四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入0.74g(5.48mmol)hobt及1.36g(6.60mmol)dcc，活化45min。有大量dcu析出。将1.72g(5.49mmol)tos·asp(obzl)-obzl溶解于30ml四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用nmm调节ph值到8～9，在室温下搅拌反应8h后tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除dcu，将滤液减压除去溶剂，残留物用50ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶的dcu，滤液分别用饱和na2co3溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)，饱和khso4溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)，饱和na2co3溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)洗涤，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色油状物，进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝80:1)，得到无色固体3.01g(83％)。esi-ms(m/e):662[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.97(dd,j1＝2.1hz,j2＝8.1hz,1h),7.78(m,1h),7.63(t,j＝7.8hz,2h),7.43(d,j＝7.8hz,1h),7.34(m,12h),7.25(d,j＝6.9hz,2h),7.17(t,j＝6.9hz,1h),5.16(s,2h),5.09(d,j＝3.0hz,2h),4.95(m,1h),4.87(m,1h),4.55(s,2h),3.44(dd,j1＝4.8hz,j2＝7.5hz,2h),3.02(m,2h),2.12(s,3h)。
实施例6制备华法林-4-o-乙酰-asp
将1.02g(1.54mmol)华法林-4-o-乙酰-asp(obzl)-obzl溶于50ml甲醇中，加入100mgpd/c，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌反应约10h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，将pd/c过滤除去，滤液减压除去溶剂，用石油醚将其固化成无色固体，利用无水乙醚进行反复磨洗的方式将其纯化，得到无色固体产品520mg(70％)。mp:107-109℃；
实施例7评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp的抗动脉血栓作用
实验材料：
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，cas：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(cas：9041-08-1，百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
实验动物：
sd品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法：实验采用动静脉旁路血栓形成模型。
旁路插管的准备：
旁路插管由三段组成，将内径1.0mm，外径2.0mm的聚乙烯管受热拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右颈静脉和左颈动脉插管，位于旁路插管的两端；中段由内径3.5mm的聚乙烯管构成，定长为8.0cm；将表面毛糙的丝线定长为6.0cm，选用重4.0±0.1mg且毛糙程度相同的丝线。
三段聚乙烯管内壁均用1％的硅醚溶液(1％硅油的乙醚溶液)进行硅烷化，在完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中，利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。
分组及给药剂量：
本发明的化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp剂量为0.1μmol/kg，阳性对照阿司匹林剂量为167μmol/kg和16.7μmol/kg，阴性对照为生理盐水
所用试剂配制：
麻醉剂为用生理盐水配制的20％的乌拉坦水溶液，抗凝剂为用生理盐水配制的42mg/100ml的肝素钠水溶液。
实验操作：
以0.3ml/100g体重的剂量分别对大鼠进行灌胃给药，给药30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7ml/100g)。仰卧位将大鼠固定于大鼠固定板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一v字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定，以0.1ml/100g体重的剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总动脉近心端，在暴露的动脉上剪一v字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外循环旁路。
维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，在滤纸上吸去丝线上的浮血后称量并记录其湿重，代表抗动脉血栓活性。数据采用t检验进行统计。
实验结果：
数据列入图2。结果表明化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp治疗的大鼠的血栓重(25.08±2.72mg和24.93±6.54mg)显著小于生理盐水治疗的大鼠血栓重(30.42±3.49mg，p<0.05)，说明化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp表现出抗动脉血栓活性。而16.7μmol/kg剂量下的阿司匹林并没有抗动脉血栓的活性，说明化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp的抗动脉血栓活性比阿司匹林至少强167倍。这是意想不到的技术效果。
实施例8评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp的抗静脉血栓作用
实验材料：
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，cas：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、华法林钠(cas：129-06-6，百灵威科技有限公司)；
实验动物：
sd品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法：实验采用大鼠下腔静脉结扎模型。
分组及给药剂量：
本发明的化合物化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp剂量为0.1μmol/kg，阳性对照华法林剂量为4.87μmol/kg和0.1μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
所用试剂配制：
麻醉剂为用生理盐水配制的20％的乌拉坦水溶液。
实验操作：
实验大鼠在手术前适应环境并禁食一天，以0.3ml/100g体重的剂量对大鼠进行灌胃给药，采用灌胃方式进行给药，给药30min后于手术前2min用20％的乌拉坦溶液进行腹腔给药麻醉。将大鼠固定于大鼠固定板上，从颈动脉取血2ml，用于血液相关指标的测定。将大鼠腹部备皮且消毒后沿腹白线打开腹腔，下至凝固腺，上至露出肝脏一角即可。将腹腔内小肠等器官拖出，暴露出下腔静脉，拖出的器官用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织，暴露下腔静脉及其分支，在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开，然后用被生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉的交汇处将下腔静脉结扎，按解剖位置将肠等器官放回腹腔，用缝合线逐层缝合腹腔。
术后将大鼠置于25～28℃的环境中循环4h，打开腹腔后，逐个将其分支结扎，从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处开始取出2cm下腔静脉，从中取出血栓。计算血重并利用t检验的方式统计结果。手术以每组两只交替进行。实验数据见图3。
实验结果：
结果表明，化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp治疗的大鼠的血栓重(10.81±3.90mg和13.78±4.15mg)显著小于生理盐水治疗的大鼠血栓重(22.93±5.03mg，p<0.01)，说明化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp表现出抗静脉血栓活性。并且在0.1μmol/kg剂量下化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp治疗的大鼠的栓重与4.87μmol/kg剂量下华法林治疗的大鼠的栓重(12.12±3.86mg，p>0.05)没有显著差异，并且在0.1μmol/kg剂量下华法林-4-o-乙酰-arg治疗的大鼠的栓重显著优于同剂量下的华法林(15.65±2.58mg，p<0.01)。说明化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp的抗静脉血栓活性比华法林至少强48.7倍。这是意想不到的技术效果。
实施例9化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp对paf、th及adp诱导的血小板聚集的抑制作用
实验材料：
柠檬酸钠(cas：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、凝血酶(th，cas:506-32-1，sigma试剂公司)、二磷酸腺苷(adp，cas:58-64-0，sigma试剂公司)、血小板活化因子(paf，cas:74389-68-7，sigma试剂公司)。
实验仪器：血小板聚集仪：model700，chrono-log
实验用血：新鲜猪颈动脉血
实验分组：
本发明的化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp，阴性对照为生理盐水。
所用试剂配制：
抗凝剂为生理盐水配制的3.8％的柠檬酸钠水溶液，血小板活化诱导剂用生理盐水溶解配制成50u/ml的th水溶液、1mm的adp水溶液、5×10-5mm的paf水溶液。诱导剂的最终浓度为：th：1u/ml、adp：20μm、paf：1×10-6mm。
实验方法：
在提前一天硅烷化并晾干的取血瓶中加入50ml柠檬酸钠水溶液(与血比例1:9)。取得新鲜猪颈动脉血后轻轻摇匀，迅速于1000rpm的转速离心10min，收集上清液，得到富血小板血浆(prp)，剩下的血于3500rpm的转速离心10min，收集上清液，得到贫血小板血浆(ppp)。
在血小板聚集仪上将500μl的ppp加入小玻璃管中，加入ppp孔中，将480μl的prp加入小玻璃管中，加入prp孔中。将所用prp于37℃温育10min后进行测量。在仪器开始运行、加入转子并调零之后，先向prp中加入10μl的生理盐水或化合物水溶液，再向prp中加入10μl的血小板活化诱导剂。记录透光率的变化，计算出化合物对血小板聚集的抑制率。实验结果见表1。
实验结果：
表1华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp抑制由paf、th、adp诱导的血小板聚集抑制率(x±sd％)
n＝3；化合物终浓度：2×10-5m，诱导剂的最终浓度为：th：1u/ml、adp：20μm、paf：1×10-6mm。
实验结果表明，华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp可抑制由paf、th、adp诱导的血小板聚集。对paf诱导的血小板聚集的抑制率为40％和35％；对th诱导的血小板聚集的抑制率为29％和24％；对adp诱导的血小板聚集的抑制率为22％和32％。由于华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp能够抑制血小板聚集，所以它不是前药。这是意想不到的技术效果。
实施例10评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp降低体内维生素k含量的作用
实验材料：
柠檬酸钠(cas：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、ns(石家庄四药有限公司)、移液枪(德国普兰德公司)、蒸馏水；
实验样本：
实施例8给华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp后大鼠颈动脉血
实验方法：
实验采用大鼠维生素k1酶联免疫分析试剂盒来进行检测。
样品的采集：
用3.8％的柠檬酸钠溶液为抗凝剂，采集大鼠给华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp后的颈动脉血，与30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液(血浆)作为样品进行检测。
标准品的配制：
从试剂盒中取出标准品，用150μl标准品稀释液稀释150μl的原倍标准品，充分混合得到标准品s5，取4个1.5ml的离心管依次排列，各加入150μl样本稀释液，吸取150μl标准品s5于s4离心管中，吹打混匀，依次配得s5-s1标准品。标准品浓度分别为：s5(6ng/ml)、s4(3ng/ml)、s3(1.5ng/ml)、s2(0.75ng/ml)、s1(0.375ng/ml)、s0(0ng/ml)。
分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品加样50μl，待测样品孔中先加样样品稀释液40μl，再加入待测样品10μl，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次，每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外，37℃温育30min，洗涤，每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加终止液50μl，终止反应，在15min内以空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(od值)。根据标准品的od值绘制标准曲线，计算样本出样本浓度，数据列入图4。
实验结果：
从图4的数据可以看出，0.1μmol/kg化合物华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp治疗的的大鼠体内维生素k含量显著低于生理盐水治疗大鼠的维生素k含量(p<0.05)，即在0.1μmol/kg的剂量下华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp可以降低大鼠体内维生素k的含量，并且与4.87μmol/kg剂量下华法林治疗大鼠的的体内维生素k含量相当。可见，华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp降低大鼠体内维生素k含量的活性比华法林强48.7倍。这是意想不到的技术效果。
实施例11评价华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp降低大鼠体内凝血因子ⅱ含量的作用
实验材料：
柠檬酸钠(cas：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、移液枪(德国普兰德公司)、蒸馏水；
实验样本：
实施例8给华法林-4-o-乙酰-arg和华法林-4-o-乙酰-asp后大鼠颈动脉血
实验方法：
实验采用大鼠fⅱ酶联免疫分析试剂盒来进行检测。
样品的采集：
用3.8％的柠檬酸钠溶液为抗凝剂，采集大鼠给药后的颈动脉血，与30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液(血浆)作为样品进行检测。
标准品的配制：
从试剂盒中取出标准品，用150μl标准品稀释液稀释150μl的原倍标准品，充分混合得到标准品s5，取4个1.5ml的离心管依次排列，各加入150μl样本稀释液，吸取150μl标准品s5于s4离心管中，吹打混匀，依次配得s5-s1标准品。标准品浓度分别为：s5(6ng/ml)、s4(3ng/ml)、s3(1.5ng/ml)、s2(0.75ng/ml)、s1(0.375ng/ml)、s0(0ng/ml)。
分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品加样50μl，待测样品孔中先加样样品稀释液40μl，再加入待测样品10μl，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次，每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外，37℃温育30min，洗涤，每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加终止液50μl，终止反应，在15min内以空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(od值)。根据标准品的od值绘制标准曲线，计算样本出样本浓度，数据列入图5。
实验结果：
从图5数据中可以看出，0.1μmol/kg华法林-4-o-乙酰-asp治疗的大鼠的fii含量显著低于生理盐水治疗大鼠的fii含量(p<0.05)，即在0.1μmol/kg的剂量下华法林-4-o-乙酰-asp可降低大鼠体内fii含量，并且与4.87μmol/kg华法林治疗大鼠的体内fii含量相当。可见，华法林-4-o-乙酰-asp降低大鼠体内fii含量的活性比华法林强48.7倍。这是意想不到的技术效果。
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