一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测试剂盒及检测方法与流程

文档序号:11804074阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测试剂盒,其特征在于,包括针对金黄色葡萄球菌的CRISPR位点基因序列设计的引物,所述金黄色葡萄球菌的CRISPR位点基因序列有三种,分别为CRISPR-1,CRISPR-2和CRISPR-3,对应的引物序列如下所示:

CRISPR-1 上游引物 5’-GTAGTGATTTTTGGGAGTGG-3’,

下游引物 5’-GTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’,

CRISPR-2 上游引物 5’-CAATGACTTGGAGTGTGA-3’,

下游引物 5’-GGTTAATGTGTAGGAACC-3’,

CRISPR-3 上游引物 5’-ACTCAATGGCATGGAGTGTGA-3’,

下游引物 5’-GGTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测试剂盒,其特征在于,还包括10×Tag Buffer,0.2 mM dNTP,2 mM MgCl2,0.05U/μL Tag DNA聚合酶,灭菌超纯水和DNA Marker 2000。

3.一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)以细菌样品的基因组DNA为模板,分别利用3种CRISPR位点基因序列的引物进行PCR扩增,引物序列如下所示,

CRISPR-1 上游引物 5’-GTAGTGATTTTTGGGAGTGG-3’,

下游引物 5’-GTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’,

CRISPR-2 上游引物 5’-CAATGACTTGGAGTGTGA-3’,

下游引物 5’-GGTTAATGTGTAGGAACC-3’,

CRISPR-3 上游引物 5’-ACTCAATGGCATGGAGTGTGA-3’,

下游引物 5’-GGTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’,

待PCR扩增结束后,得扩增产物;

(2)将所得扩增产物经凝胶电泳分析,CRISPR-1的预期扩增片段长度为330bp,CRISPR-2的预期扩增片段长度为380bp,CRISPR-3的预期扩增片段长度为387bp,得到相应大小的基因片段即为扩增成功。

4.根据权利要求3所述的一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测方法,其特征在于,所述PCR扩增的反应体系为:10μmol/L上游引物1μL,10μmol/L下游引物1μL,10×Tag Buffer 2.5μL,0.2 mM dNTP 0.5μL,2 mM MgCl2 2μl,0.05U/μL Taq DNA 聚合酶0.125μL,细菌样品基因组DNA 2μL,灭菌超纯水15.875μL。

5.根据权利要求3所述的一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测方法,其特征在于,针对不同的CRISPR位点基因序列所采用的PCR扩增反应程序分别为:

CRISPR-1 94℃预变性5min;94℃变性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环,72℃继续延伸10min;

CRISPR-2 94℃预变性5min;94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环,72℃继续延伸10min;

CRISPR-3 94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环,72℃继续延伸10min。

6.根据权利要求3所述的一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测方法,其特征在于,凝胶电泳的条件为:1.5%琼脂糖凝胶,电压5V/cm,时间25min。

7.根据权利要求3所述的一种金黄色葡萄球菌CRISPR位点检测方法,其特征在于,细菌样品的基因组DNA采用煮沸法提取。

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