一株解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

自古以来，海参作为我国人民、东南亚等太平洋和西印度洋沿岸国家人们餐桌上的佳肴美味早已闻名遐尔，特别是世界华人素有吃海参“食补”的习惯，人们把海参称为“海产八珍”之一。海参的经济种类中以北方沿海产的仿刺参[apostichopusjaponicus(selenka)]品质最好，为海参之冠。仿刺参具有抗肿瘤、提高生物机体免疫力、抗放射以及抗疲劳、抗炎、降低血粘度、调节血脂、抑制病毒、促进造血功能恢复的作用，不仅是一种良好的保健食品，而且可用于治疗或辅助治疗某些疾病，如对肺结核、神经衰弱、胃及十二指肠溃疡、糖尿病和再生障碍性贫血的治疗效果较为明显。

自2003年起，福建省就积极开展“北参南养”的试验，据《2014中国渔业统计年鉴》记载，2013年全国海参养殖总产量为193705吨，其中福建省养殖总产量为17555吨，产值达18亿元，是继山东、辽宁后全国第三大刺参养殖大省。养殖规模的扩大易造成疾病的滋生，传统上使用抗生素虽然能够在一定程度上控制疾病的发生，但它同时也扰乱了肠道正常有益菌群的生长，导致水产动物对病原的易感性增加，甚至产生耐药性。长期使用抗生素会影响仿刺参的健康和抗病能力，而且会使得仿刺参体内的抗生素含量超标，从而影响其产品质量安全。

益生菌(probiotics)又称微生态制剂、微生态调节剂、活菌制剂、em菌制剂等，是在微生态理论指导下，调整微生态失调，保持微生态平衡，提高宿主健康水平和增进健康状态的益生菌及其代谢产物和生长促进物质的制品。研究表明，健康动物中正常的优势菌或次优势菌可以作为益生菌的潜在来源。而以源于水产养殖动物及周围环境的菌株为对象，以抑制特定病原菌为目的的拮抗筛选法是水产用益生菌株最常用的筛选方法。

芽孢杆菌(bacillus)是一类好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，通常在缺乏营养或遇不良环境时形成内生孢子。研究表明，芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶(果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等)，这些酶能够破坏植物饲料细胞的细胞壁，促使细胞的营养物质释放出来，并能消除饲料中的抗营养因子，减少抗营养因子对动物消化利用的障碍。目前市面上已有一些针对水产动物的有益微生物类产品，但这些产品所用的有益微生物绝大多数来源于环境或其他高等动物，它们在仿刺参肠道内定植及作用效果并不显著。目前关于福建地区南移养殖仿刺参细菌性疾病的报道越来越多，但是还没有用益生菌制剂来防治仿刺参细菌性疾病的相关报道。

创伤弧菌(vibriovulnificus)为革兰氏阴性菌，其广泛分布在海水中，为人兽共患病原，可从海参等海产品中分离得到，主要通过伤口接触和经口感染。经伤口感染时可导致蜂窝织炎及骨髓炎等多种炎症，经口感染时常迅速导致菌血症或败血症。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一株解淀粉芽孢杆菌。

本发明的另一目的在于提供上述芽孢杆菌的应用。

本发明的具体技术方案如下：

一株解淀粉芽孢杆菌，具体为芽孢杆菌cqn-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12420，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年5月9日，分类命名：解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens。

在本发明的一个优选实施方案中，分离自南移健康养殖的仿刺参肠道。

上述芽孢杆菌在改善南移仿刺参养殖水体环境中的应用。

上述芽孢杆菌在改善南移仿刺参肠道有益菌群数量中的应用。

上述芽孢杆菌在制备水产养殖用抗创伤弧菌药物中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明的芽孢杆菌是从健康的南移养殖仿刺参肠道内分离得到，强效拮抗创伤弧菌的芽孢杆菌，对病原菌——创伤弧菌有明显的拮抗效果，可以代替防治创伤弧菌的抗生素类药物。

2、本发明的芽孢杆菌为有益菌，可以改善养殖水体环境以及南移仿刺参肠道有益菌的种群数量，从而可以使防治效果更加突出。

3、本发明的芽孢杆菌可以多次使用不会产生药物残留和耐药性问题。

4、本发明的芽孢杆菌耐高温，为应用中的运输和保存提供便利。

附图说明

图1为本发明的芽孢杆菌cqn-2抑制创伤弧菌的平板生长图，采用点种法，底板为创伤弧菌涂布，点种芽孢杆菌cqn-2后产生抑菌圈。

图2为本发明的芽孢杆菌cqn-2的透射电镜照片。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)菌株的分离及拮抗性分析：

1)菌株的分离纯化：

先用75％酒精冲洗实验刺参体表。无菌条件下，用剪刀剪开刺参体腔，取出刺参消化道，用0.9％生理盐水冲洗肠道外壁，挤出肠道内容物。将采集的养殖和野生刺参的肠道内容物和肠壁分别置于无菌试管中，称重。分别置于研钵内，用5ml无菌生理盐水充分研磨为均匀样品。用无菌生理盐水对样品进行倍比稀释至10^-6，各稀释度样品均用旋窝振荡器震荡均匀。选取合适浓度梯度，分别取100μl涂布2216e平板，每个浓度下设置3个重复，28℃条件下培养5d。培养后选菌落生长分布均匀的平板进行菌落计数。选择细菌菌落数在30～300的平板，随机挑取40个单菌落并编号，在2216e培养基上多次划线分离纯化，直到得到纯种菌株为止。将得到的纯种菌株保存于–80℃备用。其中1000ml的2216e配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，陈海水1000ml。

2)菌株的拮抗性分析：

将上述分离纯化的仿刺参肠道菌株划线于2216e培养基上，28℃培养18-24小时后，采用点种法，用接种环挑取步骤(1)中分离纯化的单菌落点种于涂布有菌株创伤弧菌的2216e、lb、tsa培养基上，28℃培养24-48小时，观察有无抑菌圈，将出现抑菌圈的菌株进行再次点种，确认其抑菌性，最终获得一株抑菌效果好的拮抗菌，命名为cqn-2，其抑制创伤弧菌的效果图如图1所示。

(2)菌株的鉴定：

1)16srrna序列分析

在50ul离心管内加入20ul的双蒸水，将分离纯化的菌种用灭过菌的枪头挑取单菌落放入的离心管中，在pcr仪器上设定99.9℃10min使其裂解，取上清液作为pcr模板。

在离心管内加入pcr反应体系(50ul)：

扩增体系

94℃→5min→﹛94℃30s→55℃30s→72℃90s﹜*35→72℃7min→4℃保存

pcr产物得到菌株16srrna基因序列，将该基因序列提交至ncbi数据库进行基因序列号注册，得到序列登录号为kt023552。经数据比对，确定菌株cqn-2为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，现保存于福建省水产研究所，测得其16srrna基因片段长度为1423bp。序列如下(seqidno03)：

ttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgcat

2)biolog自动鉴定系统分析

将菌株cqn-2划线接种于biolog专用培养基上，28℃培养18-24小时后，接种于biologa型培养液，而后分装于biologgenⅲ鉴定板，28℃培养12小时后上机读数，得到菌株生化鉴定指标及鉴定结果。

菌株的生化鉴定结果如表1所示：

表1菌株cqn-2的生理生化鉴定结果

注：+为阳性，-为阴性，n为临界值

3)菌株cqn-2电镜拍照

采用透射电镜对菌株cqn-2进行拍照，其结果如图2所示，具体为芽孢杆菌cqn-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12420。

(3)菌株cqn-2最佳培养基的筛选

选取四种培养基[胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tsa)、乳酸细菌培养基(mrs)、2216e、lb]对菌株cqn-2进行培养，观察在不同培养基上的抑菌效果，结果表明，菌株cqn-2在tsa培养基上对创伤弧菌的抑制效果最好。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。