酿酒酵母的高表达或低表达位点的制作方法

本发明属于基因
技术领域：
，具体涉及酿酒酵母的位点效应的测定，以及基因高表达或低表达位点的筛选，特别是涉及一系列在酿酒酵母中基因高表达或低表达的位点以及在高表达位点和低表达位点插入基因的载体。
背景技术：
：酿酒酵母是微生物研究中的主要模式生物之一，经常被用来表达外源蛋白。研究者通常利用生物技术手段将外源基因甚至一系列代谢通路引入酿酒酵母细胞，从而合成某些天然产物，包括萜类、多元不饱和脂肪酸等重要医药、化工产品。外源基因和代谢通路的引入一般有两种方法，一是通过游离型载体存在于酿酒酵母细胞内，另外是被整合至酿酒酵母的基因组中。相较于前者，后者不仅保证了外源基因的稳定性，而且不需要在培养基中加入抗生素或者特殊的化学物质来维持筛选压力，从而简化了培养基并且降低了生产成本。因此在工业生产中，研究人员通常将外源基因或者代谢通路整合在酿酒酵母的基因组上。通常提高外源基因的表达的方法有提高外源基因的拷贝数或者选用较强的启动子。现有研究表明，当基因插入在染色体上的不同位置时，该基因的表达水平是有差异的，这种现象称之为位点效应。这种现象已在许多生物的染色体中得到验证，比如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、乳酸乳球菌、酿酒酵母、果蝇和人类。但目前针对酿酒酵母位点效应的相关研究较少。1998年，Yamane等人使用lacZ作为报告基因并将其整合至酿酒酵母III号染色体的不同位置，通过对β-半乳糖苷酶表达量来表征酿酒酵母基因组的位点效应，发现III号染色体上存在两个高表达的热点区域和七个低表达的抑制区。2001年，Thompson等人采取类似的表征方法，在酵母基因组上随机选取了24个位点对其进行位点效应的研究。2009年，Bai等人同样利用lacZ作为报告基因，选取了20个位点进行了相关研究。然而上述研究仅局限于个别位点或某一条染色体，无法从全局的角度揭示酿酒酵母基因组中位点效应的分布规律和作用机理。技术实现要素：本发明的目的是从全局的角度去揭示酿酒酵母基因组上位点效应的分布规律以及基因高表达和低表达的位点，从而为利用酿酒酵母表达外源基因和代谢通路提供理论依据和指导。本发明选取合适的启动子和报告基因，利用同源重组的方法，利用报告基因片段(RFP)分别替换掉酿酒酵母单基因敲除库选定菌株的KanMX表达框。利用荧光酶标仪来分别检测各重组菌株在对数生长期的相对荧光强度，从而来表征在染色体中不同位置上基因表达强度的差异。结果显示在酿酒酵母16条染色体中，高组和低组的总和有162个位点。其中表达最高的位点位于YBR128C处，该处的RFP的相对荧光强度最大，达到了12.98。另外较高的表达位点还有YDR448W、YGR240C、YHR142W、YML059C、YPL014W和YPR028W。较低的表达位点较为集中在端粒和着丝粒附近，如YBR001C、YGR038W、YIL092W、YLR371W和YPL241C位点。因此本发明提供了酿酒酵母YBR128C、YDR448W、YGR240C、YHR142W、YML059C、YPL014W和YPR028W位点在以酿酒酵母为底盘细胞高表达外源代谢产物中的用途。本发明还提供了酿酒酵母YBR001C、YGR038W、YIL092W、YLR371W和YPL241C位点在以酿酒酵母为底盘细胞低表达副产物中的用途。进一步的，本发明还提供了在酿酒酵母YBR128C、YDR448W、YGR240C、YHR142W、YML059C、YPL014W、YPR028W、YBR001C、YGR038W、YIL092W、YLR371W或YPL241C中至少一个位点中插入基因的载体。其中，所述载体中的启动子为TEF1P或URA3P。优选的，本发明所述载体中的报告基因为RFP、GFP或LacZ。本发明从全基因组尺度上研究酿酒酵母的位点效应，揭示位点效应在酿酒酵母基因组上的分布规律，筛选获得酿酒酵母的高表达位点如YBR128C、YDR448W、YGR240C、YHR142W、YML059C、YPL014W和YPR028W位点，和酿酒酵母的低表达位点如YBR001C、YGR038W、YIL092W、YLR371W和YPL241C位点，为以酿酒酵母细胞为底盘细胞表达外源代谢产物和副产物提供了理性设计的依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示质粒PUC19的示意图；图2示启动子和报告基因的电泳验证图，其中泳道1为URA3P，泳道2为ADH1P，泳道3为PGI1P，泳道4为PGK1P，泳道5为TEF1P，泳道6为TEF2P，泳道7为THDH3P，泳道8为MarkDL2000，泳道9为GFP，泳道10为RFP，泳道11为Mark2KPlus；图3示正确的转化子的筛选平板，其中a为以SD-LEU营养缺陷型培养基作为正对照的筛选平板，b为YPD+G418培养基作为负对照的筛选平板；图4示验证片段的电泳图片，其中泳道1为URA3P+GFP，泳道2为ADH1P+GFP，泳道3为PGI1P+GFP，泳道4为PGK1P+GFP，泳道5为TEF1P+GFP，泳道6为TEF2P+GFP，泳道7为THDH3P+GFP，泳道8MarkDL2000；图5示不同启动子和不同报告基因的荧光强度比较，其中a、b为YCR001C，c、d为YOL001W，e、f为YPR015C；a、c、e报告基因为GFP，b、d、f报告基因为RFP；图6示RFP替代KanMX序列的替换过程示意图；图7示RFP表达菌株库荧光强度分布图；图8示2号染色体上各位点的荧光相对表达强度图；图9示酵母16条染色体中162个位点的高表达位点和低表达位点分布图；图10示10株菌在RFP拷贝数上的差异比较图；图11示10个位点上RFP基因的转录情况，其中，示FluorescenceIntensity，示mRNA；图12示10个位点不同启动子的荧光强度比较，其中示URA3P+RFP，示TEF1P+RFP；图13示10个位点不同报告基因相对荧光强度和半乳糖苷酶活比较图，其中，示TEF1P+RFP，示TEF1P+GFP，示TEF1P+LacZ。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。为进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1、一、材料与方法1、菌株和培养基单基因敲除库菌株培养基为YPD(葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L)培养基中加入200mg/mL的G418。替换上报告基因的重组菌株，带有LEU2基因，培养基为SD-LEU(6.7g/L不含氨基酸的酵母氮源，2g/L氨基酸混合物，20g/L葡萄糖，20mg/L组氨酸，20mg/L色氨酸，20mg/L尿嘧啶)。2、表达框的构建表达质粒是在质粒PUC19(图1)的基础上构建，包括了KANMX-L，终止子CYC1T，启动子，报告基因(RFP、GFP)及终止子，营养缺陷型筛选标记LEU2和KANMX-R，表达框两侧的酶切位点为SACI和BAMHI。其中KANMX-L和KANMX-R是整合到酵母单基因敲除菌染色体上的同源臂。CYC1T是为了消除在整合位点前启动子的影响。LEU2是营养缺陷型的筛选标记。分别将不同的启动子以及报告基因连入这个表达框中。用SacI和BamHI两种限制性内切酶处理质粒，胶回收报告基因片段用于后续转化实验。3、转化方法高通量酵母转化采用96孔板进行转化操作，将单基因敲库中的菌株转接至每孔含有150μLYPD+G418的96孔板中，30℃过夜培养，次日转接。转接至每孔含有150μLYPD+G418的96孔板中，30℃孵育培养6h。4000g离心2min，去上清。用200μL水重悬，4000g离心2min，去上清。将细胞重悬于200μL0.1MLiAc(LithiumAcetate)中。4000g离心2min，弃上清。再将细胞重悬与40μL的0.1MLiAc中，每孔加入160μL的转化混合体系(transformationmix)含PEG50％124μL，1MLiAc16μL，SSDNA10μL(10mg/mL)，10μL目的基因片段(含200ng目的基因片段)。在30℃孵育30min，加入10μL二甲基亚枫，42℃热激30min，4000g离心5min，弃上清，加入2000μL5mM的CaCl2重悬，4000g离心2min，弃上清，重悬涂在水中。涂布在SD-LEU营养缺陷型的平板上，30℃培养。为了验证目的基因插入到基因组中，采用了正反筛(SD-Leu和YPD+G418)以及PCR验证。4、荧光测定将验证正确的转化子转接入每孔含有150μLSD-Leu培养基的96孔板中，30℃过夜培养。次日，将10μL菌液转接至含每孔含有150μLSD-Leu培养基的96孔板中，培养5h。4000g离心2min，重悬于PBS中(phosphate-bufferedsaline)。进行OD600以及荧光测定。红色荧光蛋白(McherryRFP)的发射光和激发光分别是587nm/610nm，绿色荧光蛋白的激发光和发射光分别是485nm/510nm。根据样品测得的荧光强度/样品的OD600得到样品的相对荧光强度来表征该插入位点的位点效应。二、结果1、相关质粒的构建以分别带有启动子URA3P、ADH1P、PGI1P、PGK1P、TEF1P、TEF2P和TDH3P的质粒为模板，设计引物，分别在启动子的5’端引入酶切位点BglII，3’端引入XbalI酶切位点，分别扩增得到启动子URA3P、ADH1P、PGI1P、PGK1P、TEF1P、TEF2P和TDH3P(图2)七种启动子。再以带有GFP和RFP基因的质粒为模板，设计引物，在报告基因的5’端引入酶切位点XbalI酶切位点，3’端引入SalI酶切位点，分别扩增得到报告基因GFP和RFP(图2)。在质粒PUC19M1的基础上分别替换启动子或报告基因，组合得到14种质粒，列于表1中。表1相关质粒质粒名称启动子报告基因筛选标记PUC19M1URA3PRFPLeuPUC19M2ADH1PRFPLeuPUC19M3PGI1PRFPLeuPUC19M4PGK1PRFPLeuPUC19M5TEF1PRFPLeuPUC19M6TEF2PRFPLeuPUC19M7TDH3PRFPLeuPUC19M8URA3PGFPLeuPUC19M9ADH1PGFPLeuPUC19M10PGI1PGFPLeuPUC19M11PGK1PGFPLeuPUC19M12TEF1PGFPLeuPUC19M13TEF2PGFPLeuPUC19M14TDH3PGFPLeu2、报告基因的同源重组及验证用SacI和BamHI两种限制性内切酶分别处理上述14种质粒，胶回收纯化报告基因片段，分别转化至单基因缺失菌株YCR011、YOL001W和YPR015C，获得42种重组菌株。以SD-LEU营养缺陷型培养基作为正对照，YPD+G418培养基作为负对照筛选正确的转化子，结果如图3所示。提取筛选后的菌株的基因组作为模板，利用相应的验证引物验证目的基因的插入，结果如图4所示。并且利用相应的引物验证KANMX片段的缺失，从而得到正确的转化子。利用荧光酶标仪分别测定了在不同插入位置上，在不同启动子的作用下，GFP和RFP的荧光强度(图5)。GFP测定的激发光485nm，发射光510nm。RFP测定的激发光485nm，发射光510nm。荧光测定结果显示，由于酵母自身荧光的影响，当选用GFP作为报告基因时，酵母自身的自荧光会对较弱的启动子产生较大的影响。相对于GFP，RFP的本底要低很多，对于测定结果影响较小。相对于强启动子，弱启动子更容易让报告基因的信号放大，让位点之间的差异更容易分辨出来，综上所述，实验最终选择以URA3P作为启动子，RFP作为报告基因进行后续的实验。3、高通量同源重组方法的建立及单基因敲库菌的替换酿酒酵母单基因敲除库(MATalphalibrary)是以酿酒酵母菌株BY4742为背景菌株，每个重组菌株均有一个开放阅读框(ORF)被KanMX表达盒代替，具有G418抗性。本发明从酿酒酵母单基因敲除库中选择了1044个位点，选择原则是在16条染色体中，每隔12KB选择一个位点，各染色体位点选择如表2所示。之后选用红色荧光蛋白作为报告基因，通过酵母转化将报告基因同源整合至选出的单基因敲除库中，替代KanMX序列，从而构建了一个酿酒酵母单位点荧光标记库，利用各位点的相对荧光强度来表征该位点的基因表达水平。替换过程如图6所示。表2各染色体位点选择长度KB总长百分比％挑选位点数染色体1230.21.9119染色体2812.36.7370染色体3316.12.6229染色体41531.412.67129染色体5576.84.7849染色体6270.12.2424染色体71090.99.0494染色体8562.64.6647染色体9439.83.6439染色体10745.76.1862染色体11666.85.5359染色体121078.18.9388染色体13924.27.6679染色体14784.36.5168染色体151091.29.0492染色体16948.17.8681依次利用报告基因片段替换掉选出菌株中的KANMX片段，一方面利用SD-LEU营养缺陷型培养基进行正向筛选，YPD+G418培养基进行反向筛选，另一方面利用相应的引物，进行菌落PCR验证，再次对筛选出来的菌株进行基因型的验证。最终获得含报告基因的重组菌株，保存进行后续的荧光测定实验。4、替换菌株的荧光测定结果根据RFP基因的相对表达强度，将RFP表达菌株库分为了5个组，高、较高、中、较低、低，分别用(图7)。5个组中菌株的数量分别为91、161、410、311和71，分别占到了总量的8.7％、15.4％、39.3％、19.8和6.8％。在挑选的1044个位点中，较高组、中组、较低组占到了绝大多数，只有较少基因出现在高组和低组中。高组中最高的相对荧光强度达到了12.98，低组中最低的相对荧光强度只有0.98，最大差异达到了13.21倍的差异。表3替换菌株的荧光测定结果荧光相对表达强度菌株占基因组的百分比TEL/CEN高8.7％0较高15.4％6.0％中39.325.6％较低29.851.3％低6.8％17.1％为了进一步研究位点效应在染色体上的分布规律，以2号染色体做为研究样本进行各位点的荧光相对表达强度分析，结果见图8。从图8中可以发现在临近端粒和临近着丝粒的位点RFP的相对荧光表达较低。进一步统计了RFP表达菌株库中，替换位点临近端粒和着丝粒的菌株，在各组中的分布。对比表3结果可见，在全基因组1044个位点分布最为集中在中组，但是临近端粒和着丝的菌株主要集中在较低组中，占据了51.3％，并且临近端粒和着丝粒的菌株没有出现在高组中。因此认为在临近着丝粒和端粒区域的位点效应较低，可能是由于这些位置蛋白与DNA结合的较为紧密，所以致使这些位点的基因的表达水平较低。5、染色体上高表达位点和低表达位点在16条染色体中，高组和低组的总和有162个位点，如图9所示。其中表达最高的位点位于YBR128C处，该处的RFP的相对荧光强度最大，达到了12.98。另外较高的表达位点还有YDR448W、YGR240C、YHR142W、YML059C、YPL014W和YPR028W。较低的表达位点较为集中在端粒和着丝粒附近。6、影响位点效应的因素基因的表达会受到多方面的影响，比如拷贝数，启动子强度等等。为了证明位点效应是真正由于位置差异而产生的的影响，必须去除基因拷贝数的影响。从高组中挑选了5株RFP相对荧光强度较强的菌株，YBR128C、YDR448W、YGR240C、YML059C和YPL014W，同时从低组中也选取了5株RFP相对荧光强度较弱的菌株，YBR001C、YGR038W、YIL092W、YLR371W和YPL241C。分别提取10株菌的基因组，以ALG9最为参照基因，利用Q-PCR技术，来比较10株菌在RFP拷贝数上的差异，结果如图10所示。10株菌在RFP拷贝数上的最大差异仅有1.39倍，所以拷贝数对于RFP相对荧光强度造成的最大差异倍数为1.39。但高低组中的RFP相对荧光强度的差异远远大于这个数值，因此位点效应造成的差异并不是由于拷贝数的影响造成的。因为位点效应相对强度时是使用的RFP基因转录翻译后的荧光测定值推算出来的，因此需要确认RFP基因的转录水平是否和该相对强度相对应。申请人以ALG9基因做为内参基因测定了10个位点上RFP基因的转录情况，结果如图11所示，在高低组菌株的对比中，高组中的RFP基因转录水平还是显著高于低组中的转录水平，但是相对于RFP的相对荧光强度的差异，RFP基因转录的差异出现缩减，推测可能是由于mRNA的不稳定性或翻译调控造成的结果。不同的启动子的强度会对基因的表达造成影响，为了探究在相同的插入位置上，当改变启动子后，是否会对位点效应造成影响，设计了如下的实验。首先构建了用TEF1P启动子替换掉URA3P启动子的新的表达框，报告基因都选用了RFP，随后将新的表达框利用同源重组的方法导入到上述10个位点中。如图12所示，在更换启动子后，10个位点的差异趋势没有改变，但是差异倍数出现了一些改变，差异倍数的变小了。以URA3P+RFP为表达框时，位点之间最大差异为13.2倍，但当启动子换成强启动子TEF1P后，位点之间的最大差异只有3.9倍，可见换用强启动子后，位点之间的差异会被缩小。启动子的强弱会对位点之间的差异造成一定的影响，申请人进一步确认报告基因的更换是否也会影响位点效应。进一步构建了具有相同启动子(TEF1P)，但更换报告基因，将RFP基因分别换成GFP和LacZ基因的表达框，再次利用同源重组，导入上述10个高低差异位点中，获得新的重组菌株后，分别测定各位点GFP的相对荧光强度和半乳糖苷酶活来表征该位点的相对表达强度。如图13所示，在强启动子TEF1P的作用下，更换报告基因，对于位点效应几乎没有影响。当前第1页1 2 3