本发明属于生物化学领域，涉及一种取胚缓冲液及其应用。
背景技术：
从两性胚子结合开始，经过细胞分裂、细胞分化、胚层形成和组织发生、特定基因表达等的复杂过程，形成了器官系统，组成了一个完整的生命个体。经过多年的发展，人们虽然对生命的系统发生过程有了很多了解，但其中的许多奥秘，至今尚未被揭露。其中，猪的基因组序列和生理代谢状况与人高度相似，因此，猪被认为是研究人类复杂疾病的良好模型。在猪胚快速发育的神经胚时期，此时仔猪的神经系统发育快速，心脏、肾脏、肠道及耳朵等原基也开始形成，因此，是研究这些组织器官的发育过程及其相关疾病的良好模型。
我国是世界生猪生产的第一大国，猪肉是我国居民的主要肉食来源，在肉类的消费比重中占到了65%左右，但我国生猪产业的生产水平却不高。其中，产仔数不高是影响生猪产业发展的一个重要因素，而妊娠最初35天内的损失占整个妊娠期的70%左右，提高受精卵的着床率可以显著提高母猪的产仔数。猪神经胚时期前后，呈半管状，胚长3mm左右，并开始着床于子宫角的内膜上，因此，此时的猪胚不能通过常规的冲胚手段获得。而目前没有高效收获神经胚时期猪胚的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的取胚缓冲液，高效地收获仔猪神经胚时期胚胎，用于开展神经、肾脏、耳朵等发育疾病及与猪胚着床率相关的繁殖学研究。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种取胚缓冲液，主要是由磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钠溶液、BSA干粉和蒸馏水组成，所述取胚缓冲液的配制方法为：取磷酸二氢钾溶液和磷酸氢二钠溶液按体积比3:7混匀，调pH至7.2，制得的1×PBS缓冲液，然后加入1×PBS缓冲液质量的0.1%的BSA干粉，完成取胚缓冲液的配制。
所述取磷酸二氢钾溶液和磷酸氢二钠溶液的浓度都为0.1mol/L。
步骤如下：
（1）将取胚缓冲液置于37℃恒温水浴备用，向培养皿中加入1×PBS缓冲液，冰浴备用，取出冷藏的子宫组织，将子宫组织移至37℃恒温台；
（2）在37℃恒温台上，放置2-3个培养皿，剪掉子宫的肠系膜，平展子宫，在远端输卵管处剪开子宫角，捏紧远端子宫角，剪开近端子宫角，将子宫分成两个部分，在剪开的子宫角近端处，注入100-200mL备用的37℃取胚缓冲液，冲刷子宫角，从子宫角远端开始，向子宫角近端挤压包含取胚缓冲液在内的子宫角内容物到培养皿内；
（3）将试验步骤（2）获得的盛有子宫角内容物培养皿移至体视镜下，寻找胚胎，并逐个分离胚胎；
（4）将分离得到的胚胎，连同其相连的胚胎外组织一起转移至装有PBS缓冲液的冰浴培养皿中，漂洗胚胎并编号记录。
所述子宫组织含有的胚胎处于神经胚时期。
所述步骤（4）中分离胚胎：采用沿每个胚胎的胚胎外组织切断，逐个分离的方法。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供了一种取胚缓冲液的配制方法及应用，利用该取胚缓冲液可高效地收获神经胚时期胚胎，且能保证所收获胚胎的活力，收获到的胚胎可用于细胞培养及发育学和繁殖学研究。
（2）本发明发现向pH 7.2，PBS母液里添加1×PBS母液质量0.1%的BSA，可促进开始着床的猪胚无伤地从子宫角内壁脱落，且能顺畅地移出子宫角，提高了猪胚的收获效率；同时，在收获过程中进行温度控制，进一步保证了所收获胚胎的活力，收获到的存活猪胚可继续进行相关器官组织细胞的培养及与神经系统、心脏、肾脏系统发育及繁殖等相关的研究。
附图说明
图1为收获胚胎视镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
1、配制反应溶液：
PBS缓冲液的配方为：0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和0.1mol/L磷酸氢二钠溶液的按体积比3:7的比例混匀，调pH至7.2，完成1×PBS缓冲液的配制。
取胚缓冲液的配方为：向1×PBS缓冲液中加入0.1% BSA干粉（不含有Ca2+、Mg2+和酚红），完成取胚缓冲液的配制。
2、高效的收获猪胚的方法：
（1）将取胚缓冲液置于37℃水浴锅内恒温备用。
（2）往直径为3.5cm的coning培养皿里加入1×PBS缓冲液，置于碎冰上备用。
（3）在37℃恒温条件下，将冷冻神经胚时期子宫组织移至37℃恒温台上。
（4）在37℃恒温台上，放置2-3个直径为10cm的灭菌培养皿，用经过灭菌消毒的医疗剪刀剪掉子宫的肠系膜，平展子宫；在远端输卵管处剪开子宫角，捏紧远端子宫角，剪开近端子宫角，将子宫分成两个部分；使用50mL的一次性医疗注射器，在剪开的子宫角近端处，小心注入100-200mL备用的37℃取胚缓冲液，冲刷子宫角；从子宫角远端开始，不间断地向子宫角近端稍用力挤压包含取胚缓冲液在内的子宫角内容物到预置的10cm培养皿内。
（5）将试验步骤（4）获得的盛有子宫角内容物的10cm培养皿移至体视镜下，使用解剖镊子在镜下视野内寻找胚胎。
（6）用解剖镊子，沿着每个胚胎的胚胎外组织切断，逐个分离胚胎。
（7）将分离到的胚胎，连同其相连的胚胎外组织一起转移至冰上装有PBS的3.5cm coning培养皿里，漂洗胚胎，编号记录。
3、结果共收获了19个胚胎，胚胎照片见图1。
本发明在37℃恒温条件下分离子宫收获胚胎，能够模拟猪胚在母体的生存温度，维持猪胚的存活。使用37℃、加有0.1% BSA、pH 7.2的1×PBS缓冲液作为母液，配制的取胚缓冲液，首先能够保持组织细胞需要的pH范围；其次，此缓冲液的盐浓度与体内环境的相似，对组织细胞没有毒性作用；最后，在不间断地从子宫角的一端挤压至另一端，收获胚胎时，可以起到润滑作用，利于猪胚从子宫角内膜脱落，提高猪胚收获效率，且能收获活的猪胚，用于后续相关组织和细胞培养。