本发明涉及药物化合物领域，具体地说，涉及海洋真菌来源的萘螺缩酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
随着老龄化加剧、生态环境遭到破坏、不健康生活方式及食品安全问题凸现，我国肿瘤发病率多年来持续上升。据世界癌症报告估计，2015年中国癌症发病人数约为430万，约占全球发病人数的五分之一；癌症死亡人数约为280万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。此外，根据国家癌症中心发布的《2015中国肿瘤登记年报》显示，全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病率第一位的是肺癌，其次为胃癌、肝癌和食管癌；同时，死亡第一位的也是肺癌，其次为胃癌、食管癌和肝癌。因此，在我国，癌症已成为一个必须高度重视的公共卫生问题乃至社会问题。现有的治疗癌症的药物中，要么副作用大，要么价格昂贵。所以癌症的高发，增加的不仅仅是患者的伤痛，还给家庭、社会带来沉重的经济负担。为了避免或减少当前药物的不良副作用或耐药性，同时提供更多候选药物和降低治疗癌症药物的成本，因此寻找新的抗肿瘤药物是迫切需要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供来源于海洋红树林内生真菌的一类新的萘螺缩酮类化合物。
本发明的另一个目的是提供上述萘螺缩酮类化合物的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述萘螺缩酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
海洋真菌来源的萘螺缩酮类化合物，结构式如式(Ⅰ)所示：
上述萘螺缩酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将海洋真菌的菌株Lasiodiplodia theobromae ZJ-HQ1从斜面培养基中接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；所述海洋真菌的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC M 2016219，保藏日期为2016年4月21日；
(2)将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养；
(3)将发酵产物过滤得到菌体，菌体用甲醇浸泡，减压浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到萘螺缩酮类化合物1或2。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(1)所述种子培养基的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(2)所述发酵培养基的组分为：东北大米6000g，海盐180g，水6L。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(1)所述摇床培养条件为：转速200rpm，温度28℃，培养时间72h。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(2)所述静置培养温度为25℃，培养时间为28天。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(3)所述浸膏用硅胶柱层析进行分离，分离用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、100％的乙酸乙酯/石油醚梯度淋洗；收集10％－50％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，40％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以凝胶柱层析分离，重结晶纯化，即得到黄色颗粒晶体化合物1和2，即为萘螺缩酮类化合物1和2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的萘螺缩酮类化合物1和2来源于海洋真菌，海洋真菌种类繁多、数量庞大，从真菌提取的方法简单，使得萘螺缩酮类化合物1和2来源丰富、成本低廉；萘螺缩酮类化合物1和2抗肿瘤活性高，应用前景广阔。
附图说明
图1为萘螺缩酮类化合物1和2的X-ray单晶衍射结构图。
具体实施方式
以下结合实施实例进一步解释本发明，但实施实例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
本发明的化合物，可以从海洋真菌Lasiodiplodia theobromae ZJ-HQ1的菌体中分离得到。海洋真菌是从广东省湛江红树林保护区红树植物老鼠簕的叶子部分离得到；具体步骤如下：
1.种子培养：
1.1配制种子培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1L，平均分装于5个500mL锥形瓶，121℃灭30分钟。
1.2种子的培养：将海洋真菌的菌株接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以200rpm的转速，培养72小时得种子培养液。
2.发酵培养：
2.1配制发酵培养基：东北大米6000g，海盐180g，自来水6L，121℃灭30分钟。
2.2发酵培养：
无菌操作将种子液5mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于25℃静置培养28天。
3.提取分离：
发酵物用甲醇浸泡，浸泡液在低于50℃下减压浓缩得浸膏32.2g。该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分成30组分。其中第15组分，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，再用硅胶柱层，40％乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，获得化合物1和2。实施例2：对实施例1中的化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
化合物1：淡黄色晶体，熔点189.0-190.2℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)：430[M]+。
化合物2：淡黄色晶体，熔点198.3-199.9℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)：444[M]+。
化合物1–2的NMR数据见表1。
萘螺缩酮类化合物1和2的X-ray单晶衍射结构图如图1。
表1化合物1–2的NMR数据(125MHz/500MHz，TMS，ppm)
化合物1–2的单晶数据见表2。
表2
实施例2:
对实施例1中的化合物1和2对五种细胞株进行细胞毒活性实验：
1.材料：
1.1四唑化合物(MTS)：
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,CellTiter 96Aqueous One Solution Reagent,Promega,USA)。
1.2靶细胞的制备：人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2,子宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7和人正常细胞HEK293T的复苏与培养。
a.从液氮罐中取出人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2,子宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7和人正常细胞HEK293T的冻存管,迅速置入37℃水浴箱中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；
b.向人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2,子宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7加入DMEM完全培养液至10mL，1000rmp离心5min，弃上清；而人正常细HEK293T则加入RPMI-1640培养液至10mL，1000rmp离心5min，弃上清；
c.重复以上操作一次；
d.人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2,子宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7以DMEM完全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO2，37℃培养；而人正常细HEK293T则加入RPMI-1640培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO2，37℃培养；
e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。
1.3细胞计数：
a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，培养基终止，移入离心管中，加培养基至10mL；
b.取10μl细胞悬液滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘104，即为每毫升培养液所含细胞数；
c.调整细胞数至1×105/mL。
1.4化合物1和2的配制：取氯代萘缩酮化合物1和2加入到DMEM完全培养基中，调整浓度为500μmol/mL，超声乳化，过滤除菌，4℃保存。
2.试验方法
a.96孔板各孔加入人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2,子宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7和人正常细胞HEK293T，50μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培养12h。
b.加入不同浓度受试对象50μL，对照加DMEM完全培养基50μL，继续培养72h。
c.加入MTS(CellTiter 96Aqueous One Solution Reagent,Promega,USA)各10μL，继续培养1h。
d.酶标仪(TECAN，Switzerland)490nm下测定每孔OD值。
e.计算抑制率：
肿瘤细胞杀伤率％＝[(对照组测定的平均OD值－加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]×100％。
f.以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC50值；以lg c为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC50值。
3.试验结果
试验结果显示萘螺缩酮类化合物1和2均能有效抑制人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2,子宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7，人正常细胞HEK293T，化合物1和2的抑制肿瘤IC50值(μM)见表3。
表3化合物1和2的体外细胞毒试验结果(IC50μM)