野生型IDH2基因作为靶标在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及野生型IDH2基因作为靶标在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。

背景技术：

随着经济社会的发展与疾病谱的改变，我国肺癌等肿瘤的发病率明显上升。根据中国肿瘤登记年报(2012)，我国全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病第一位的是肺癌。其发病率为53.57/10万，人口标化后为25.34/10万，五年生存率只有10％-15％。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。在我国，约80％的肺癌被诊断为非小细胞肺癌。

异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)是细胞代谢途径中参与三羧酸循环的酶，位于染色体15q26.1，亚细胞定位于线粒体基质。其生理功能是正向催化异柠檬酸氧化产生α-酮戊二酸，同时还原NADP+产生NADPH。其逆向反应催化α-酮戊二酸产生异柠檬酸，并消耗NADPH产生NADP+。

近来，在WHO二期和三期胶质瘤中发现大于70％的IDH1/2突变，IDH1R132和IDH2R140/172突变位点也在其它肿瘤中被发现，如急性粒细胞白血病、甲状腺癌、软骨肉瘤、肝内胆管细胞癌、前列腺癌、急性B淋巴细胞白血病、副神经节瘤、结直肠癌和黑色素瘤等肿瘤。IDH1/2突变后获得了新的功能，即催化a-酮戊二酸产生致癌代谢物2羟基戊二酸(2-HG)。IDH1/2突变一方面消耗a-酮戊二酸，另一方面产生2羟基戊二酸，最终抑制以a-酮戊二酸为底物反应的一系列脱双氧酶的活性，从而增强细胞代谢，抑制细胞胶原蛋白形成和细胞分化。目前，突变型IDH2靶向药物已进入I期临床实验阶段，IDH2口服选择性抑制剂AG-221在扩展I期研究发现，158名晚期血液肿瘤患者中63名病情缓解(40％)，76％的患者疗效持续超过6个月，部分患者超过15个月。

野生型IDH2的序列已公开，genebank编号为NG_023302.1。研究表明野生型IDH2也在肿瘤细胞增殖和死亡中具有重要功能。IDH2基因敲除小鼠体内的黑色素瘤细胞移植瘤形成受到明显抑制，肿瘤血管生成标志物明显减少。IDH2逆向反应可以在低氧条件通过谷氨酰胺代谢经过a-酮戊二酸产生柠檬酸，从而促进胶质瘤细胞增殖和增加细胞活力。乳腺癌细胞Myc基因驱动逆向IDH1/2反应产生2羟基戊二酸，抑制细胞凋亡。目前野生型和突变型IDH2在肺癌中的研究尚未有文献报道。

技术实现要素：

本发明的发明人研究表明IDH2信使RNA在肺癌组织中高表达，提示IDH2可能是肺癌的治疗靶标。发明人在非小细胞肺癌细胞H460和A549过表达及敲减IDH2，使用MTS、细胞计数和流式细胞术手段检测IDH2对于非小细胞肺癌细胞生长、增殖和死亡等生物学行为的影响。进一步接种免疫缺陷小鼠，观察IDH2对裸鼠移植瘤生长的作用。发现IDH2能够促进肺癌细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，抑制细胞死亡。敲减IDH2可以有效抑制细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，增加细胞死亡。IDH2过表达降低细胞内α-酮戊二酸(α-KG)含量，采用添加α-酮戊二酸的方式可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，IDH2过表达也增加了细胞内的2-羟基戊二酸的含量，可能抑制细胞死亡。即，本发明提出野生型IDH2可作为非小细胞肺癌的潜在治疗靶标。野生型IDH2基因可作为靶标用于制备非小细胞肺癌治疗药物、用于制备抑制非小细胞肺癌细胞增殖的药物、用于制备诱导非小细胞肺癌细胞死亡的药物。

IDH2在肺癌组织中表达上调，野生型IDH2促进肺癌细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，抑制细胞死亡。敲减野生型IDH2可以有效抑制细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，增加细胞死亡。IDH2过表达降低细胞内α-酮戊二酸含量，采用添加α-酮戊二酸的方式可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，IDH2过表达也增加了细胞内的2-羟基戊二酸的含量，可能抑制细胞死亡。本发明为临床肺癌的治疗提供了靶标基因IDH2，为相关药物靶点的研究提供了理论依据。

附图说明

图1为实施例1实验结果图：图1显示了IDH2在肺癌组织与癌旁组织中的信使RNA表达；

图2、3、4、5为实施例2实验结果图：

图2a显示了H460及A549细胞IDH2热点突变序列测序与NCBI数据库的比对结果；

图2b显示了IDH2过表达细胞IDH2蛋白含量的western检测结果，图2c显示了IDH2敲减细胞IDH2蛋白含量的western检测结果；

图3a显示了IDH2过表达细胞增殖活性的检测结果；图3b显示了IDH2敲减细胞增殖活性的检测结果；

图4a显示了IDH2过表达细胞增殖数目的检测结果；图4b显示了IDH2敲减细胞增殖数目的检测结果；图4c显示了IDH2过表达细胞α-酮戊二酸含量；图4d显示了IDH2敲减细胞α-酮戊二酸含量；如图4e显示了在过表达IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的细胞培养过程中添加α-酮戊二酸，抑制了细胞的增殖；

图5a显示了IDH2过表达细胞死亡比例的检测结果；图5b显示了IDH2敲减细胞死亡比 例的检测结果；图5c显示了IDH2过表达的肺癌细胞的2-HG含量；

图6为实施例3实验结果图：

图6a显示了IDH2过表达后，肺癌细胞裸鼠移植瘤体积的变化；图6b显示了IDH2过表达后，肺癌细胞裸鼠移植瘤重量的变化；

图6c显示了IDH2敲减后，肺癌细胞裸鼠移植瘤体积的变化；图6d显示了IDH2敲减后，肺癌细胞裸鼠移植瘤重量的变化。

具体实施方式

实施例1.IDH2信使RNA表达在肺癌组织中增加

目前多个数据库包含大量肿瘤临床样本数据，如美国癌症“登月计划”近期已公布1.2万名癌症患者的原始数据，供研究者分析。为分析IDH2在肺癌组织与癌旁组织的表达差异，申请人调取临床样本数据库中IDH2肺癌组织与癌旁组织的信使RNA表达，进行分析统计。

实验方法：

通过查询oncomine数据库中IDH2表达数据。采用t-test函数分析表达数据，绘制IDH2表达差异数据，并进行统计学分析。

实验结果：

IDH2在数据库多个芯片数据中在肺癌组织中相对癌旁组织均高表达，没有低表达的样本。其中样本数目最多的实验组如图1所示，IDH2在肺癌组织中高表达，且具有统计学差异(P＝2.8E-13)。

实施例2.IDH2促进非小细胞肺癌细胞增殖，抑制细胞死亡。

本部分以非小细胞肺癌细胞H460和A549为母细胞，以慢病毒导入的方式构建了H460和A549过表达及敲减野生型IDH2的细胞模型。检测IDH2过表达及敲减后非小细胞肺癌细胞增殖和死亡的改变。

1.H460和A549过表达及敲减野生型IDH2的细胞模型构建

我们首先对H460和A549细胞的IDH2热点突变区域进行测序，确认细胞模型中IDH2为野生型。为研究IDH2对细胞增殖与死亡的作用，采用慢病毒导入的方式构建了H460和A549过表达及敲减野生型IDH2的细胞模型。

实验方法：

H460和A549细胞细胞经过RNA提取及逆转录制备cDNA后，PCR扩增IDH2热点区域序列，送华大基因进行测序，最后与NCBI数据库中野生型IDH2序列进行比对。

过表达、敲减细胞的母细胞复苏，培养后，将待感染的细胞接种于培养皿后，待细胞生长至80％-90％的融合度时弃培基。慢病毒溶液按1:3与新鲜培养基混合后加入培养皿中，同时加入终浓度为1ug/ml的polybrene促进病毒感染。24小时后消化细胞，加入终浓度为1ug/ml的puromycine筛选细胞，设置对照组。约72小时后，对照组细胞大量死亡，实验组中残留的细胞为病毒感染成功的细胞。通过Western检测IDH2蛋白表达确定细胞模型是否构建成功。

实验结果：如图2a所示，H460与A549细胞中IDH2热点突变序列与数据库中野生型序列462个碱基100％相同，证明H460与A549细胞IDH2为野生型。如图2b所示，过表达野生型IDH2细胞H460-IDH2和A549-IDH2相对其对照细胞H460-EV和A549-EV，IDH2的蛋白含量增加。如图2c所示，IDH2野生型敲减细胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相对其对照细胞H460-shcon和A549-shcon，IDH2的蛋白含量降低。证明IDH2过表达及敲减细胞构建成功。

2.IDH2促进非小细胞肺癌细胞增殖活性

MTS是四唑盐(MTT)比色试验改良方法，是常用于检测细胞增殖活性的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTS还原为可溶性的蓝紫色甲臢结晶物－Formazan，而无活性的细胞无此功能，用酶标仪测定其在490nm波长的吸收值，可间接反映细胞增殖活性，该方法已广泛应用于大规模的抗肿瘤药物筛选。

实验方法：

使用已构建的肺癌细胞模型，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl细胞悬液(设置3个以上的复孔)，使待测细胞调密度1000-10000孔，置于5％CO2，37℃培养箱中培养72小时，各样品孔加MTS溶液20μl，生化培养箱内孵育1.5小时。在酶标仪490nm波长处测定各孔的吸光值并绘制生长关系曲线。

实验结果：

如图3a所示，过表达IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2增殖活性相对对照细胞H460-EV和A549-EV增加。如图3b所示，敲减IDH2的肺癌细胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相对其对照细胞H460-shcon和A549-shcon增殖活性降低。

3.IDH2增加非小细胞肺癌细胞增殖数目

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。

IDH2突变蛋白降低细胞内α-酮戊二酸的含量，为确定野生型IDH2消耗α-酮戊二酸， 从而促进细胞存活与增殖。我们采用biovision公司的α-酮戊二酸含量检测试剂盒(K677-100)，对野生型IDH2过表达及敲减细胞内α-酮戊二酸含量进行检测。并采用外源添加可以进入细胞利用的α-酮戊二酸类似物辛基化α-酮戊二酸，验证α-酮戊二酸对细胞增殖的作用。

实验方法：

用Hanks液配制0.1％台盼蓝溶液；用0.5％胰蛋白酶和0.2％EDTA 1：1混合液来消化培养的贴壁细胞；再加入适量细胞培养基液终止消化，Hanks液漂洗3次后制成细胞悬液；将待染色细胞稀释至所需浓度(方法及浓度范围与细胞计数相同)；每0.1ml细胞悬液约加新鲜配制的染液一小滴，室温下染3—5min；染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置血球计数板，加盖玻片后放高倍镜下观察并计数；死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽。活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。

构建的野生型IDH2过表达及敲减H460和A549模型细胞接种于6孔板，12小时后添加1mM辛基化α-酮戊二酸(cayman)，使用血球计数板不同时间点检测细胞数目变化，并进行统计分析。

实验结果：

如图4a所示，过表达野生型IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的细胞数目相对对照细胞H460-EV和A549-EV增加。如图4b所示，敲减IDH2的肺癌细胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相对其对照细胞H460-shcon和A549-shcon细胞数目降低。

如图4c所示，过表达IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的细胞内α-酮戊二酸含量相对对照细胞H460-EV和A549-EV增加，如图4d所示，敲减IDH2的肺癌细胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相对其对照细胞H460-shcon和A549-shcon细胞内α-酮戊二酸含量降低。

如图4e所示，在过表达IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的细胞培养过程中添加α-酮戊二酸，抑制了细胞的增殖。

4.野生型IDH2抑制非小细胞肺癌细胞死亡

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。可以通过流式细胞术检测PI阳性细胞的比例确定细胞的死亡比例。

2-羟基戊二酸是突变型IDH2的产物，在乳腺癌中IDH2逆向反应可以产生2-HG并抑制细胞凋亡。我们对野生型IDH2过表达H460和A549模型细胞中2-HG含量进行了检测。

实验方法：

用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；用预冷1×PBS(4℃)重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；加入300μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；上机前5分钟再加入5μL的PI染色进行流式检测。

2-HG含量检测使用biovision公司的试剂盒(K213-100)进行检测，操作按照说明书步骤进行。

实验结果：

如图5a所示，过表达IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的死亡细胞比例相对对照细胞H460-EV和A549-EV降低。如图5b所示，敲减IDH2的肺癌细胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相对其对照细胞H460-shcon和A549-shcon死亡细胞比例增加。

如图5c所示，过表达IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的2-HG含量相对对照细胞H460-EV和A549-EV增加。

实施例3.野生型IDH2促进非小细胞肺癌细胞裸鼠移植瘤的生长

动物实验，由于其更能模拟人类的生理和病理条件，动物实验获得的结果，又称临床前证据。裸鼠移植瘤模型是肿瘤研究最常用的动物模型。

实验方法：

4周龄免疫缺陷小鼠Bclb购自中南大学动物学部，经本室饲养一周后，过表达实验每只裸鼠注射2x10⁶个细胞，敲减细胞成瘤每只注射1x10⁶个细胞。所有实验裸鼠均在接种后第四天开始测量裸鼠体重及瘤体体积，每2-3天测量一次，对应分组检测到三次差异后处死小鼠，剥离瘤体，并称量瘤体重量。

实验结果：

1.野生型IDH2过表达增加非小细胞肺癌细胞移植瘤体体积和重量

如图6a所示，IDH2过表达肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的裸鼠移植瘤体积相对对照细胞H460-EV和A549-EV增加。

如图6b所示，IDH2过表达肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的裸鼠移植瘤重量相对对照细胞H460-EV和A549-EV增加。

2.野生型IDH2敲减降低非小细胞肺癌细胞移植瘤体积和重量

如图6c所示，敲减IDH2的肺癌细胞H460-shIDH2相对其对照细胞H460-shcon体积减少。

如图6d所示，敲减IDH2的肺癌细胞H460-shIDH2相对对照细胞H460-shcon重量降低。