一种低温硝化假单胞菌及应用的制作方法

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株硝化-北极低温假单胞菌，还涉及该菌的筛选方法，以及在含氮废水处理中的应用。

背景技术：

随着我国城镇化的不断提高，中小型点源污染的控制是提高水环境质量和解决水资源短缺问题的关键。我国寒冷地区的冬季漫长，生活污水的生物处理一直存在着微生物活性低、生化处理效果差和出水达标困难等难题，这主要是由于温度的降低对污水处理过程中活性污泥的吸附性能、沉降性能、微生物生长发育、种群组成及曝气池中氧转移效率等均有着显著影响。

目前我国北方冬季寒冷地区为了缓解低温对污水处理的影响，在工程实践中一般采用延长污水停留时间、降低污泥负荷、增加污泥回流量、对构筑物采取保温或升温等措施来保证冬季污水处理出水达标，但这会增加工程投资和运行费用，而且处理效果较差，污泥膨胀问题经常出现。同时，盐度对微生物活性也有一定影响，当盐度过高时会抑制微生物生长。为了解决盐度过高的影响，一般通过对活性污泥的驯化、向活性污泥系统中投加一些嗜盐菌和强化理化处理的沉淀生物工艺。这些措施延长了处理的周期，增加了工程成本。因此，需要寻找一种低温高效耐盐的降解菌，应用于低温生活污水的处理，是解决我国北方地区冬季污水厂出水水质难以达标的有效方法。

北极地区具有独特的地理、环境与气候特征，造就了特殊的极地微生物生态系统，周围海域常年处于低温高盐的环境，长时间的沉淀和积累，使得极地海洋沉积物成为一个成分复杂且巨大的微生物栖息地。并且这些微生物往往具有适应其特殊环境的形态学、生理学上的特异性。因此极地被认为是微生物新种质、基因和产物的资源宝库。通过从北极海洋沉积物中筛选耐盐耐低温的硝化细菌，可以有效解决我国北方地区冬季污水水质难以达标的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株从北极海洋沉积物中筛选出的低温硝化假单胞菌，以解决我国北方地区因低温导致的污水处理厂出水水质难以达标的问题。

本发明提供了一种低温假单胞菌，是从北极海洋沉积物中筛选得到，命名为假单胞菌Pseudomonas sp.CC6-YY-74，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No 12611，保藏日期为2016年6月15日。

本发明还提供了一种低温假单胞菌的应用，适用于水体净化。

进一步的，用于水体净化时的适用温度为0-30℃，NaCl浓度为0-60‰。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明的菌株是从北极海洋沉积物中筛选得到，在低温下具有较强的硝化与反硝化活性，污水处理效率较高，省去了延长污水停留时间对构筑物采取保温或升温等措施；另外本发明的菌株盐度适应范围较广，可以处理不同盐度的污水，节省了驯化时间和设施建设的费用；从而在保证处理效率的基础上减小了处理的成本。

附图说明

图1为基于16S rRNA基因序列构建的菌株CC6-YY-74的系统发育树；

图2为实施例2中菌株CC6-YY-74不同温度下硝化作用曲线图；

图3为实施例2中菌株CC6-YY-74不同NaCl浓度下硝化作用曲线图；

图4为实施例3中菌株CC6-YY-74不同温度下反硝化作用曲线图；

图5为实施例3中菌株CC6-YY-74不同NaCl浓度下反硝化作用曲线图；

图6为实施例4中菌株CC6-YY-74不同温度下COD降解曲线图；

图7为实施例4中菌株CC6-YY-74不同NaCl浓度下COD降解曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。本发明所提到的比例、“份”，如果没有特别的标记，均以重量为准。

本实施例提供了一种低温硝化假单胞菌，是一种低温耐盐的硝化细菌，在低温环境下具有较强的硝化与反硝化作用；将其应用于污水的生物处理，同时解决了盐度过高对微生物生长的抑制作用和低温条件微生物活性降低的问题，有效解决我国北方地区冬季污水处理厂出水水质难以达标的问题。

所述低温假单胞菌是从北极海洋沉积物中筛选得到，命名为假单胞菌Pseudomonas sp.CC6-YY-74，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No 12611，保藏日期为2016年6月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述低温假单胞菌能在低温条件下进行硝化和反硝化作用，为北方地区冬季低温生活污水的生物处理提供新的菌种资源和基础资料。

实施例1

本实施例所涉及的低温假单胞菌是通过对北极海洋沉积物进行富集、稀释、选择性培养基培养等方法筛选得到的。

1、使用的材料：

2014年7-9月，中国第六次北极科学考察采取的海洋沉积物。

2、培养基成分：

异养硝化培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 1，醋酸钠2.5，柠檬酸钠2.5，K₂HPO₄ 5，MgSO₄2.5，NaCl 20，微量元素溶液2mL。

其中所述微量元素溶液(g/L)：ZnSO₄ 2.2，CaCl₂ 5.5，MnCl₂ 5.06，FeSO₄ 5.0，钼酸铵1，CuSO₄ 1.57，CoCl₂ 1.61。海水Zobell 2216E培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，过滤陈海水：自来水(v/v2:1)。

3、筛选方法：

取适量北极海洋沉积物样品，移入50mL液体异养硝化培养基中，于10℃振荡培养(130r/min)7d，然后按2％接种量移取培养液，转接到新的相同的液体异养硝化培养基中，于相同条件下培养7d，如此重复两次后，富集的培养液经稀释10000倍后，取100μL涂布筛选培养基平板，置于10℃培养箱中，待菌液完全渗入培养基后，倒置，培养14d后，根据菌落的形态学特征，挑取不同的单菌落重新进行划线分离直至菌落分纯为止，得到纯化的菌株CC6-YY-74。4、菌株CC6-YY-74的系统发育分析：

采用天根生化技术(北京)有限公司基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，16S rRNA基因的PCR扩增的引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR条件为：预变性94℃5min，变性1min，退火55℃30s，72℃90s，循环35次，72℃延伸10min，PCR产权经琼脂糖凝胶电泳检测后送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。获得的16S rRNA基因序列有效长度为1336bp，测序结果在NCBI进行BLAST比对分析。序列比对采用BioEdit的多序列比对排列(Clustalw multiple alignment)，系统发育分析采用Mega5.0的邻接法(Neighbor-Joining method)，与模式菌株的16S rRNA基因相似性比较利用EzTaxon-Database进行分析，选取最相似菌株的16S rRNA基因序列，通过软件BioEdit进行比对，应用MEGA5软件，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。

16S rRNA基因序列比对结果表明，菌株CC6-YY-74与Pseudomonas taeanensis MS-3具有最高的相似性，为98.73％。从图1的系统发育树可以看出，菌株CC6-YY-74属于假单胞菌属。

5、所述低温假单胞菌的理化性质研究：

该菌株为革兰氏阴性菌，可产脲酶，α-葡萄糖苷酶等，并可利用葡萄糖，葡萄糖酸钾，苹果酸，枸橼酸钠，乙酸钠，柠檬酸钠等碳源。菌落在2216E固体培养基上为淡黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，凸起。

6、菌株CC6-YY-74的温度/耐NaCl浓度生长适应性测定：

(1)温度生长范围：将分别按1％的接种量接入海水2216E培养基(蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，海水1L)中，分别于不同温度(0℃、10℃、20℃和30℃)下振荡培养(130r/min)，2d后取样测定培养液浓度(OD₆₀₀)，以此观察菌株对温度的适应范围，结果如表1所示。

(2)耐NaCl浓度生长范围：纯化的菌株CC6-YY-74分别按1％的接种量接入不同NaCl浓度的培养基中(蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，蒸馏水1L；往其中添加不同质量浓度的NaCl，使其终质量浓度分别为0‰、15‰、30‰、45‰、60‰和90‰)，于10℃下振荡培养(130r/min)，2d后取样测定培养液浓度(OD₆₀₀)，以此观察菌株对NaCl浓度的适应范围，结果如表2所示。

(3)检测结果：如表1所示，菌株CC6-YY-74在0-30℃均具有活性，其中，在NaCl浓度相同的情况下，在20℃下生长状况最好，然后依次是10℃、0℃、30℃，因此本实施例的菌株更适应低温的生活环境。

表1.不同温度下测量的培养液浓度

如表2所示，菌株在NaCl浓度为0-90‰的培养基中均可生长。其中，在温度相同的情况下，在NaCl浓度为15‰的条件下生长状况最好，然后依次是30‰、0‰、45‰、60‰、90‰，说明本实施例的菌株可在较广的盐度范围的生活环境下生存。

表2.在不同NaCl浓度下测量的培养液浓度

实施例2

菌株CC6-YY-74的硝化活性检测

(1)将纯化的菌株CC6-YY-74以4％的接种量接种于100mL灭菌的NaCl浓度都为30‰的硝化培养基中，于0℃、10℃、20℃和30℃的培养箱振荡培养，转速为130r/min。每24h检测培养基中氨氮(NH₄-N)浓度的变化，结果如图2所示。

(2)将纯化的菌株CC6-YY-74以4％的接种量接种于100mL灭菌的不同浓度NaCl的硝化培养基中(NaCl浓度分别为0‰、15‰、30‰、45‰、60‰和90‰)，于10℃、130r/min振荡培养，每24h检测培养基中氨氮(NH₄-N)浓度的变化，结果如图3所示。

上述硝化培养基成分(g/L)：NH₄Cl 0.191，KH₂PO₄ 0.05，MgSO₄ 0.1，乙酸钠2.5，柠檬酸钠2.5，微量元素溶液2mL。NH₄-N浓度测量采用纳氏试剂光度法。

(3)检测结果：在以NH₄Cl为唯一氮源，乙酸钠、柠檬酸钠为碳源，初始pH为7.2，不同温度、NaCl浓度培养时，硝化反应的效率不同。如图2可以看出，当NaCl浓度相同时，温度为20℃处理效果最好，24h后氨氮含量从45mg/L降到了13mg/L；在温度为10℃时处理效果较好，24h后氨氮含量从45mg/L降到了40mg/L，48h后降到了20mg/L。如图3可以看出，当温度相同时，NaCl浓度为15‰时处理效果最好，48h后氨氮含量从45mg/L降到了10mg/L，氨氮去除率接近80％。

实施例3

菌株CC6-YY-74的反硝化活性检测

(1)将纯化的菌株CC6-YY-74以4％的接种量接种于100mL灭菌的NaCl浓度为30‰的反硝化培养基中，于0℃、10℃、20℃和30℃的培养箱振荡培养，转速为130r/min。每24h检测培养基中硝态氮(NO₃-N)、亚硝态氮(NO₂-N)浓度的变化，结果如图4所示。

(2)将纯化的菌株CC6-YY-74以4％的接种量接种于100mL灭菌的不同浓度NaCl的反硝化培养基中(NaCl浓度分别为0‰、15‰、30‰、45‰、60‰和90‰)，于10℃、130r/min振荡培养，每24h检测培养基中硝态氮(NO₃-N)、亚硝态氮(NO₂-N)浓度的变化，结果如图5所示。

上述反硝化培养基成分(g/L)：KNO₃ 0.144，KH₂PO₄ 0.05，MgSO₄ 0.1，乙酸钠2.5，柠檬酸钠2.5，微量元素溶液2mL。测量NO₃-N浓度采用麝香草酚光度法，测量NO₂-N浓度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法。

(3)检测结果：在以KNO₃为唯一氮源，乙酸钠、柠檬酸钠为碳源，初始pH为7.2，不同温度、NaCl浓度培养时，反硝化反应的效率不同。如图4可以看出，当NaCl浓度相同时，温度为20℃处理效果最好，24h后硝态氮的含量从53mg/L降到了23mg/L；在温度为10℃时处理效果较好，24h后硝态氮从53mg/L降到了43mg/L，48h后降到了36mg/L。如图5可以看出，当温度相同时，NaCl浓度为15‰时处理效果最好，24h后硝态氮的含量从54mg/L降到了27mg/L。

实施例4

将菌株CC6-YY-74用于处理模拟生活污水时处理效果检测

(1)将纯化的菌株CC6-YY-74以4％的接种量接种于100mL灭菌的NaCl浓度为30‰的模拟生活污水中，模拟生活污水的配方为(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖3，磷酸氢二钾3，稀释80倍用于实验，COD约为1300mg/L，于0℃、10℃、20℃和30℃的培养箱振荡培养，转速为130r/min。每24h检测培养基中COD降解率，COD测定采用重铬酸钾法，结果如图6所示。

(2)将纯化的菌株CC6-YY-74以4％的接种量接种于100mL灭菌的不同NaCl浓度的液体模拟生活污水中(NaCl浓度分别为0‰、15‰、30‰、45‰、60‰和90‰)，稀释80倍用于实验，COD约为1300mg/L，于10℃、130r/min振荡培养，每24h检测培养基中COD降解率，COD测定采用重铬酸钾法，结果如图7所示。

(3)检测结果：初始pH为7.2，不同温度、NaCl浓度培养时，COD的去除率不同。如图6可以看出，当NaCl浓度相同时，温度为20℃处理效果最好，24h后COD的含量从1337mg/L降到了714mg/L，48h后降到205mg/L；温度为10℃时，24h后COD的含量从1321mg/L降到了823mg/L，48h后降到365mg/L；温度为0℃时，24h后COD的含量从1356mg/L降到了987mg/L，48h后降到471mg/L，可以看出菌株在0-20℃的低温下具有较好的活力。

如图7可以看出，当温度相同时，NaCl浓度为15‰时处理效果最好，24h后COD的含量从1324mg/L降到了789mg/L。

综合实施例2、3和4可知，可以将所述低温假单胞菌应用于生活污水的低温或高盐处理中。

以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。