一种超耐硒细菌对亚硒酸盐的还原作用的研究方法与流程

本发明属于耐硒微生物技术领域，具体涉及一种超耐硒细菌对亚硒酸钠的还原作用的研究方法。

背景技术：

硒是很多生物必需的微量元素，在生物体内，硒被合成为硒蛋白，有些硒蛋白具有抗氧化功能，同时，能够防治一些癌症。硒在含量低时，对生物有益，在含量高时，对人类和动物有害，在人体必需微量元素中，硒从不足到产生毒性，范围最窄。

在土壤中具有生物有效性的硒，主要以硒酸盐和亚硒酸盐形态存在，一些富硒地区的农业排水和半导体工业废水是水体中水溶态硒(硒酸盐/亚硒酸盐)的主要来源，而无机硒对人体是有毒害的，因此，寻找一种解决将具有毒性的无机硒转化为无毒或低毒的硒这一问题的方法至关重要。

目前已报道能够将无机硒还原为单质硒的微生物有：嗜麦芽寡养单胞菌、芽孢杆菌、罗尔斯通菌、陶厄氏菌、脱硫微菌、超嗜热古菌、根瘤菌、假单胞菌等，但是，对硒的耐受性都不是很高。关于赖氨酸芽孢杆菌的报道有：李婷等(2013)报告一株具有吸附功能的微生物固定化载体对间甲酚的降解。Hayat.et.al(2013)报告Lysinibacillus pakistanensis耐硼酸。Bahuguna.et.al(2011)报告从柴油污染土壤中分离出的球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)能够对二苯并噻吩产生脱硫作用。但是，关于硒的化合物对于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)毒性或影响的报道几乎没有。

微生物能将具有较强毒性的亚硒酸盐或硒酸盐还原，产生的红色单质硒毒性降低且溶解度较小，可用于某些硒环境污染的生物治理。近年来的实验还发现，当粒径在5-200nm时，红色单质硒在生物补硒方面可能有很高的应用价值。

技术实现要素：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种超耐硒细菌对亚硒酸盐的还原作用的研究方法，目的是通过微生物使亚硒酸盐具有高还原率，使硒环境污染进行生物治理。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种超耐硒细菌对亚硒酸钠的还原作用的研究方法，该方法包括如下步骤，

a、活化：将耐硒细菌纯培养体接种于LB液体培养基，并置于振荡培养箱中培养；

b、梯度胁迫培养：将步骤a得到的活化耐硒细菌接种于含亚硒酸盐的量为0-25000mg·L^-1的LB液体培养基中，之后置于振荡培养箱中培养，该活化耐硒细菌的接种量为LB液体培养基体积分数的0.5％-1.5％；

c、活菌计数：取步骤b得到的耐硒细菌用无菌水稀释10⁵-10⁷，之后取稀释后的菌液涂布于LB固体培养基，然后在生化培养箱中恒温培养后计数；

d、Se⁴⁺测定：将步骤a得到的活化耐硒细菌接种于含亚硒酸盐的量为180-220mg·L^-1的LB液体培养基中，该活化耐硒细菌的接种量为LB液体培养基体积分数的1％-2％，之后置于振荡培养箱中培养，用分光光度计划分时间间隔测菌液的吸光度值，绘制细菌的生长曲线；取振荡培养后的菌液经离心分离，并用2,3-二氨基萘分光光度法测上清液中Se⁴⁺的浓度。

将步骤a培养的耐硒细菌接种于放置有含200mg·L^-1亚硒酸钠的LB液体培养基中，之后置于振荡培养箱中培养，从第0h开始，每隔3h，用分光光度计测菌液的吸光度值，同时，用pH计测菌液pH值，耐硒细菌接种量为LB液体培养基体积分数的1％，培养基的量为25mL，振荡培养箱的温度为35℃，振荡培养箱的转速为180r·min^-1，振荡培养时间为30h，分光光度计的波长为600nm。

所述研究方法还包括还原产物的表征步骤，还原产物的表征方法包括取步骤a得到的活化耐硒细菌经离心、无菌磷酸盐缓冲液清洗、无菌水清洗，然后用无菌水重悬菌液，之后取菌悬液观察。

还原产物的表征方法中所述活化耐硒细菌的量为0.8-1.2mL，菌悬液的量为1-3μL。

步骤a和步骤b中所述振荡培养箱恒温培养的温度为35-37℃，转速160-200r·min^-1，培养时间为10-14h。优选的，振荡培养箱恒温培养的温度为35℃，转速180r·min^-1。

步骤c中所述生化培养箱恒温培养的温度为36-38℃，培养时间24-72h。优选的，生化培养箱恒温培养的温度为37℃。

步骤a中耐硒细菌纯培养体的制备方法包括：

(1)制备富硒土壤悬液；

(2)增菌培养：取步骤(1)制备的富硒土壤悬液加入到含浓度为100-200mg·L^-1亚硒酸盐的LB液体培养基中，并置于振荡培养基中振荡培养；

(3)继代培养：将步骤(2)振荡培养后的菌液接种于含浓度为100-200mg·L^-1亚硒酸盐的LB液体培养基中，菌液的接种量为该LB液体培养基总体积的3％-7％，之后置于振荡培养箱中振荡培养，如此重复3-5次；

(4)稀释涂布平板：将步骤(3)得到的菌液用无菌水稀释10¹-10⁷倍，取稀释10⁵、10⁶、10⁷菌液涂布于含亚硒酸盐的LB固体培养基上，置于生化培养箱中恒温培养；

(5)平板划线；取步骤(4)长出的单菌落结合平板划线法接种于含100-200mg·L^-1亚硒酸盐的LB液体培养基中，之后置于生化培养箱中恒温培养；

所述振荡培养箱恒温培养的温度为35-37℃，转速160-200r·min^-1，培养时间为8-14h；步骤(4)和(5)中所述生化培养箱恒温培养的温度为36-38℃，培养时间24-72h。

所述超耐硒细菌为赖氨酸芽孢杆菌。

本发明有益效果是:本发明以天然富硒土壤为材料，从中分离筛选出两株超耐硒细菌B1和B2，其中B1为Lysinibacillus xylanilyticus，B2为Lysinibacillus macroides，一方面，具有较强的亚硒酸盐耐受性，亚硒酸钠对超耐硒细菌-赖氨酸芽孢杆菌的半最大效应浓度分别约为10000、15000mg·L^-1，另一方面，能够将亚硒酸钠还原为红色单质硒，还原率分别达到99.91％和99.96％。本发明具有材料成本较低、实验方法简单和对环境无污染的优点，同时，产生的纳米级红色单质硒对生物还能起到补硒作用。

附图说明

下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1是本发明的亚硒酸钠对耐硒细菌的半最大效应浓度示意图；

图2是本发明的耐硒细菌还原亚硒酸钠的动力学曲线图；

图3是本发明的耐硒细菌还原亚硒酸钠过程中pH的变化图；

图4是本发明的耐硒细菌还原亚硒酸钠的产物表征图；

其中,左上图是B1的电镜图,右上图是左上图中箭头部分的EDS图，左下图是B2的电镜图，左下图是B2的电镜图，右下图是左下图中箭头部分的EDS图；

图5是本发明的两株超耐硒细菌总DNA、16S rDNA的琼脂糖凝胶电泳检测图；

图6是本发明的两株超耐硒细菌基于16S rDNA基因序列的系统发育树；

图7是本发明两株超耐硒细菌分离、纯化的形态图；

图8是本发明的两株超耐硒细菌的革兰氏染色结果图。

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

一种超耐硒细菌对亚硒酸钠的还原作用的研究方法，该方法包括如下步骤，

a.活化

将筛选得到的耐硒细菌纯培养体接种于放置有LB液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，培养基的量为25mL，振荡培养箱的温度为35℃，振荡培养箱的转速为180r·min^-1，振荡培养时间为12h；

其中耐硒细菌纯培养体的筛选方法为：

(1)制备土壤样品悬液

称取2g富硒土壤样品，加入放置有已灭菌的50mL磷酸盐缓冲液的锥形瓶中，置于振荡培养箱中振荡，振荡培养箱的温度为25℃，转速为180r·min^-1，振荡时间为30min，接着静置30min，取30mL悬浮液于已灭菌的50mL离心管中，放置于离心机中离心，所述离心机的转速为5000r·min^-1，离心时间为10min，弃去上清液，再加入5mL磷酸盐缓冲液以悬浮沉淀。

(2)增菌培养

取步骤(1)制备的土壤样品悬液1mL，加入到放置有含Na₂SeO₃的LB液体培养基(酵母提取物5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1，胰蛋白胨10g·L^-1，pH＝7.2)的锥形瓶中，Na₂SeO₃浓度为150mg·L^-1，LB液体培养基的量为50mL，置于振荡培养箱中振荡培养，振荡培养箱的温度为35℃，转速为180r·min^-1，培养时间为10h。

(3)继代培养

取步骤(2)菌液接种到放置有含Na₂SeO₃的LB液体培养基的锥形瓶中，菌液接种量为5％(体积分数)，Na₂SeO₃浓度为150mg·L^-1，LB液体培养基的量为50mL，置于振荡培养箱中振荡培养，振荡培养箱的温度为35℃，转速为180r·min^-1，培养时间为10h；如此重复4次。

(4)稀释涂布平板

将步骤(3)菌液用无菌水稀释10¹-10⁷倍，取10⁵、10⁶、10⁷菌液涂布于含Na₂SeO₃的LB固体培养基上，置于生化培养箱中恒温培养，涂布的菌液体积为100μL，Na₂SeO₃浓度为150mg·L^-1，生化培养箱的温度为37℃，培养时间为48h，结果如图7(上)所示，菌斑颜色为红色，菌体较湿润，圆形边缘，边缘整齐，易挑取。

(5)平板划线

用接种环挑取步骤(4)长出的单菌落，结合平板划线法，接种于含Na₂SeO₃的LB固体培养基上，置于生化培养箱中恒温培养，培养基成分及培养条件同步骤(4)，结果如图7(下)所示，划线结果表明，细菌单菌落形态规整。

(6)活化

用接种环挑取步骤(5)长出的单菌落，接种于放置有LB液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，培养基的量为25mL，振荡培养箱的温度为35℃，振荡培养箱的转速为180r·min-1，振荡培养时间为12h。

(7)革兰氏染色

用接种环挑取步骤(5)长出的单菌落，结合平板划线法，接种于LB固体培养基，置于生化培养箱中恒温培养，挑取单菌落用于革兰氏染色，在100倍油镜下观察细胞形态，选择已知革兰氏染色结果的金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌)作为对照，生化培养箱的温度为37℃，培养时间为20h，结果如图8所示，结果表明B1和B2均为革兰氏阳性杆菌。

(8)总DNA提取

根据步骤(7)结果，按革兰氏阳性细菌处理，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取细菌总DNA，提取的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，4S green染色，λDNA/HindⅢ作为DNA Marker，结果如图5(左)所示，结果表明，DNA片段大小在20000bp左右。

(9)16S rDNA基因扩增

将步骤(7)提取的细菌总DNA用细菌16S rDNA通用引物为序列号为SEQ ID NO.1的UF 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(M为A或C)和序列号为SEQ ID NO.2的UR 5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’对16S rDNA基因全长进行扩增，所述扩增的反应体系为30μl，包括dNTPs 2μL，10×buffer 3μL，Mg²⁺ 2μL，Tap酶1μL，引物各1μL，ddH₂O 19μL，总DNA模板1μL，所述扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火4s，72℃延伸1.5min，30个循环；最后在72℃延伸10min，引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，4S green染色，DNA Marker-F作为Marker，结果如图5(右)所示，结果显示扩增产物特异性较好，目的条带较明亮，条带大小在1500bp左右，根据琼脂糖凝胶电泳的结果，将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，根据测序结果，将序列在http://www.ezbiocloud.net中进行同源性比对分析，根据比对分析结果，选取相似性最高(均大于96％)的前10个基因序列，使用ClustalX(1.83)软件进行多重比对，比对结果使用MEGA5.10建立系统发育树，以芽胞乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)作为外源菌，结果如图6所示，B1和B2均属于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)，其中，B1和Lysinibacillus xylanilyticus同源性可信度达到98％，B2和Lysinibacillus boronitolerans、Lysinibacillus macroides同源性可信度达到98％。

(10)耐低温检验

取步骤a培养的菌液接种于放置有含Na₂SeO₃的LB液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，Na₂SeO₃浓度为150mg·L^-1，LB液体培养基的体积为25mL，振荡培养箱的温度为35℃，振荡培养箱的转速为180r·min^-1，振荡培养时间为12h，接着将菌液稀释，稀释倍数为10¹-10⁶，然后取稀释的10⁶菌液涂布于含Na₂SeO₃的LB固体培养基上，置于4℃冰箱中恒温培养，观察菌落形态特征，涂布的菌液量为100μL，所述Na₂SeO₃含量为150mg·L^-1，所述培养时间为72h，结果如下表1所示，结果表明两株细菌均能够在4℃条件下生长，具有一定的耐低温能力，根据Coorevits.et.al(2012)研究结果，确定B1为Lysinibacillus xylanilyticus，B2为Lysinibacillus macroides。

表1

b.梯度胁迫培养

将步骤a培养的耐硒细菌接种于放置有含亚硒酸钠的LB液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，其中LB液体培养基中含亚硒酸钠的量为0、5000、10000、15000、20000、25000mg·L^-1，耐硒细菌接种量为LB液体培养基体积分数的1％，培养基的量为25mL，振荡培养箱的温度为35℃，振荡培养箱的转速为180r·min^-1，振荡培养时间为12h。

c.活菌计数

取步骤b培养的耐硒细菌放置于灭菌的离心管中，加无菌水稀释，菌液的稀释倍数为10⁵、10⁶、10⁷，接着取稀释的菌液涂布于LB固体培养基上，菌液涂布的量为100μL，于生化培养箱中恒温培养后计数，生化培养箱的温度为37℃，培养时间为48h，如图1所示，结果显示，亚硒酸钠对细菌B1和B2的半最大效应浓度分别约为10000、15000mg·L^-1。

d.Se⁴⁺测定

将步骤a培养的耐硒细菌接种于放置有含200mg·L^-1亚硒酸钠的LB液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，从第0h开始，每隔3h，用分光光度计测菌液的吸光度值，绘制细菌的生长曲线，同时，从锥形瓶中取1.5mL的菌液于灭菌的离心管中，放置于离心机中离心，取1mL上清液于新的灭菌的离心管中，放置于4℃冰箱保存，待所有取样及样品制备结束，用2,3-二氨基萘分光光度法测上清液中Se⁴⁺的浓度，耐硒细菌接种量为LB液体培养基体积分数的1.5％，培养基的量为150mL，振荡培养箱的温度为35℃，振荡培养箱的转速为180r·min^-1，振荡培养时间为36h，分光光度计的波长为600nm，离心机的转速为10000r·min^-1，离心机的离心时间为10min，如图2所示，结果显示，细菌B1和B2对亚硒酸钠的还原率分别达到99.91％和99.96％；

e.pH测定

将步骤a培养的耐硒细菌接种于放置有含200mg·L^-1亚硒酸钠的LB液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，从第0h开始，每隔3h，用分光光度计测菌液的吸光度值，同时，用pH计测菌液pH值，耐硒细菌接种量为LB液体培养基体积分数的1％，培养基的量为25mL，振荡培养箱的温度为35℃，振荡培养箱的转速为180r·min^-1，振荡培养时间为30h，分光光度计的波长为600nm，如图3所示，结果显示，在细菌B1和B2的生长过程中，pH逐步升高并趋于稳定。

f.还原产物表征

取1mL步骤a培养的耐硒细菌的菌液于灭菌的离心管中，放置于离心机中离心，接着用无菌磷酸盐缓冲液清洗，再用无菌水漂洗，然后用无菌水重悬菌液，接着取2μL菌悬液，滴在打磨光滑、清洗好的铜片上，置于空气中干燥，然后用扫描电镜观察，离心机的转速为10000r·min^-1，离心机的离心时间为10min，如图4所示，其中,左上图是B1的电镜图,右上图是左上图中箭头部分的EDS图，右上图EDS图中满量程3715cts，光标0.000，左下图是B2的电镜图，左下图是B2的电镜图，右下图是左下图中箭头部分的EDS图，右下图的EDS图中满量程5140cts，光标0.000；扫描电镜结果发现，两株细菌细胞内均可见膨大的芽胞结构，样品中菌体周围及外部存在高电子密度颗粒，对这些颗粒进行EDS(Energy Dispersive Spectroscopy)分析，在0～2keV出现了铜和硒的特征吸收峰，其中铜为铜片的成分，另外，还原过程中伴有刺激性气体生成，因此，Se⁴⁺被还原为纳米级的红色单质硒和挥发性的硒化物。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。