一种近岸海水中大肠杆菌的检测方法与流程

本发明涉及常见菌检测技术领域，特别涉及近海岸大肠杆菌检测方法。

背景技术：

近年来，随着我国经济的高速发展和人民生活水平的不断提高，近岸海水，尤其是海水浴场成为夏季人们休闲活动的重要场所。但由于我国城市污水处理系统不够完善，很多未经处理的污水直接排入近海水域，对海水浴场的公共健康安全造成极大威胁。大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。与人类肠道疾病密切相关，在卫生学中被用作饮用水、食品、娱乐用水等粪源性污染卫生指标。同时，由于与其他肠道病原菌在外界的存活时间近似，使其成为国际上公认的卫生监测指示菌。因此，对海水中大肠杆菌的监测能够有效的评估海水浴场的公共健康安全。

然而现阶段针对大肠杆菌的检测主要为选择性培养法，分子生物学方法等，且其多为针对食品中大肠杆菌的检测方法。对于近岸海水中大肠杆菌的检测，仅有关杰等提出的基于选择性培养的检测方法。但该方法耗时长，且无法测定不可培养的大肠杆菌数量。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种近岸海水中大肠杆菌的检测方法，解决现有技术中基于选择性培养基方法检测大肠杆菌耗时长，人力物力消耗大、无法定量海水中不可培养的大肠杆菌的问题。

本发明的技术方案为：一种近岸海水中大肠杆菌的检测方法，包括如下步骤：

(1)大肠杆菌DNA提取

采用抽滤系统将海水中细菌截留在微孔滤膜上，并提取膜上DNA。

(2)扩增目的片段

查阅相关文献，获得针对大肠杆菌特有的大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)基因设计的引物，目的片段大小约622bp，引物信息如下：

上游引物：TACAGGTGACTGCGGGCTTATC

下游引物：CTTACCGGGCAATACACTCACTA

利用菌种(阳性对照)以及海水环境样品进行PCR扩增实验。反应体系：2×PCR Master Mix 13μL、ddH₂O 9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL。PCR程序：90-95℃预变性5或10min；90-95℃变性20-60s，55--60℃退火50-60s，65-75℃延伸40-50s，30-40个循环；65-75℃终延伸10-15min。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的条带中的DNA片段。

(3)构建标准质粒模板

DNA片段经纯化后与T载体恒温连接过夜。连接结束后，利用热击法将连接获得的标准质粒导入大肠杆菌感受态中。挑取阳性克隆，提取质粒并测序检验。测序正确的质粒用于标准质粒模板使用。

(4)建立Q-PCR定量标准曲线

提取完成后测定质粒浓度，并计算质粒模板的准确拷贝数。

根据估计的海水样品病原菌浓度，选择合适的质粒模板浓度，对质粒提取液进梯度稀释并建立定量标准曲线。反应体系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH₂O 7μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、样品DNA 1μL。Q-PCR程序：90-95℃预变性3-5min；90-95℃变性10-20s，55-60℃退火30-40s，64-75℃延伸30-40s，30-40个循环。反应完成后以Ct值和log拷贝数建立标准曲线。

(5)环境样品大肠杆菌数测定

采用Q-PCR技术测定大肠杆菌DNA浓度。反应体系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH₂O 7μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、样品DNA 1μL。Q-PCR程序：90-95℃预变性3-5min；90-95℃变性10-20s，55-60℃退火30-40s，64-75℃延伸30-40s，30-40个循环。然后按照定量标准曲线将Ct值转换成拷贝数，从而定量环境样品中大肠杆菌的浓度。

本发明的有益效果是：与当下基于选择性培养法检测相比，本发明方法有以下优点：首先，缩短了检测时间，由原方法的10-12天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需3-4个小时。其次，克服了原方法无法测定不可培养大肠杆菌的问题，提高了鉴别的准确度。

附图说明

图1.琼脂糖凝胶电泳图，从左到右依次是Marker d1、d2都是大肠杆菌的菌种(阳性对照)海水样品x1南浴场东浴场西浴场空白；

图2.5.63×10⁰～5.63×10⁴copies/μL范围内Q-PCR定量曲线图；

图3.Q-PCR溶解曲线图，其中溶解曲线呈现单峰，表明模板中扩增产物特异是单一产物；

图4.Q-PCR所得Ct值与log拷贝数之间的线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

采用抽滤系统将海水中细菌截留在孔径为0.22μm的微孔滤膜上，用E.N.Z.A.TM Water DNA Kit试剂盒(Omega,USA)提取膜上DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。

采用针对大肠杆菌特有的大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)基因设计的引物，目的片段大小约622bp，引物信息如下：

上游引物：TACAGGTGACTGCGGGCTTATC

下游引物：CTTACCGGGCAATACACTCACTA

利用菌种(阳性对照)以及海水环境样品进行PCR扩增实验。反应体系：2×PCR Master Mix 13μL、ddH₂O 9μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、DNA 1μL。PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃终延伸10min。

使用PCR仪将切胶回收的DNA片段经纯化后与PGM-18载体在16℃下恒温连接。连接结束后，全量(10μL)加入含100μL大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的1.5mL离心管中，混匀后冰浴30分钟，42℃水浴热激180s，冰浴1min后加入约1mL LB液体培养基在37℃，180转，振荡培养2h左右；10000rpm离心2min，去除上清液，将沉淀吸打混匀，取约100μL涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体选择培养基上，封口后37℃倒置培养过夜。

用无菌牙签随机挑取单菌落约15个，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体选择培养基中震荡培养2h。以上述菌液为模板，采用载体专用引物RV-M+M13-47进行PCR扩增筛选阳性克隆，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆。将阳性克隆对应的菌液，在5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养。提取质粒并测序检验。

提取完成后测定质粒浓度，并计算质粒模板的准确拷贝数。对质粒提取液进梯度稀释，在5.63×10⁰～5.63×10⁴copies/μL范围内建立定量标准曲线。反应体系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH₂O 7μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、样品DNA 1μL。Q-PCR程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。反应完成后以Ct值和log拷贝数建立标准曲线。

采用Q-PCR技术测定大肠杆菌DNA浓度。反应体系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μl、ddH₂O 7μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、DNA 1μL；Q-PCR程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。然后按照定量标准曲线将Ct值转换成拷贝数，从而定量环境样品中大肠杆菌的浓度。

本发明为涉及近海大肠杆菌的定量检测提供了技术支持。为能快速准确的测定近岸海水浴场，海洋排污口，海水养殖区中大肠杆菌数量，评估其公共卫生风险，发明人所在课题组运用该检测方法分别测定2015年7月和10月份、秦皇岛养殖区固定站位及2016年1、3、5月份海水浴场，海洋排污口大肠杆菌数量，并取得良好效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。