一株中等嗜热土壤芽孢杆菌及其在高温条件下产生物表面活性物质的方法与流程

本发明涉及微生物生物技术领域，特别涉及一种利用从石油污染土壤中分离获得的土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agristrain)在高温条件(40～50℃)下产生物表面活性剂的新方法。

背景技术：
：

石油是我国重要的能源之一。目前，我国的油井多处于开采中、后期，多为高黏度原油，增加了开发难度，降低了开采速度。为提高原油开采效率，目前的技术方法之一是向采油井中加入表面活性剂，从而降低石油烃在水溶液的表面张力及界面张力，促进原油的乳化和分散。开采出的原油经三相分离器后产生大量的高温废水(40～50℃)，加入表面活性剂能够促进原油的乳化和分散，将有助于石油烃降解细菌的分解作用。

生物表面活性剂是微生物在一定培养条件下，代谢分泌的具有一定表面活性与界面活性，集亲水基与疏水基结构的两亲性化合物。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外，还具有化学合成表面活性剂所不具备的无毒，生物降解及生物兼容性等特性，在医药、化妆品、洗涤剂和食品等工业领域具有广阔的应用前景。

本发明从石油污染土壤中分离一株土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri)，采用其可在40～50℃的高温下产生表面活性物质。在产表活淀粉培养基中发酵48小时测得EI为0.59，最佳产表活温度为40℃，该菌株的最适生长温度为45℃，利用该方法产的表面活性物质经红外光谱分析鉴定为脂肽。

本发明从土壤中分离获得一株土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)，利用其在高温(40～50℃)下生产生物表面活性剂，该方法及产生的表面活性剂在高温采油污水处理和原油开采领域具有重要应用意义。

技术实现要素：

(1)本发明提供一种利用土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)在高温(40～50℃)下生产生物表面活性剂的新方法，所用培养基为淀粉培养基。

(2)本发明将所述的微生物菌株所产生的48小时发酵液乳化法测得其EI值为59％。

(3)本发明利用土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)所产生物表面活性剂经红外光谱分析为脂肽。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一株土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)，该菌是帅垛油田污染的土壤中分离纯化得到的，以原油为唯一碳源的情况下45℃反复驯化培养半年而获得，命名为S15。

S15的细胞形态特征如下：在LB上培养24h的菌落直径为2-3mm，菌落形态呈圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，浅黄色；生长温度在35～50℃，最适生长温度45℃。

附图说明

图1为本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15的原子力显微镜图；

图2为本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15的16s rDNA鉴定序列；

图3为本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15的系统进化树；

图4本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15的温度生长曲线；

图5为本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15的产表活温度曲线；

图6为本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15乳化法测EI图(左为SDS阳性对照，右为S15菌株发酵液)；

图7本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15所产表面活性物质的红外光谱分析图；

具体实施方式

实施例1土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15菌株的筛选；

1.取样：常州大学研究人员采用无菌容器从帅垛油田处理站采集原油(三相分离器出口管道，先流1min后再取样)、土壤(去除表层覆土0.5cm后取样)，随后放置在4℃保存备用。

2.富集：分别取油污土壤样品，按5％比例接入装有100mL培养基(1mL微量元素溶液加10mL矿物盐溶液，加无菌水至100mL)的250mL三角锥形瓶中，摇床培养7d(45℃，160rpm/min)。取富集液5mL转接至相同新鲜培养基内，与相同条件下培养7d，如此连续富集培养7次。

3.分离：配置LB固体培养基，经高压灭菌(121℃，20min)，取出放置超净台冷却到45℃～50℃时倒入灭菌后的90mm培养皿内(15mL)，待培养基冷却凝固后将培养基倒置搁放，24h后检查无菌污染方可使用。用接种环在LB固体培养基上划线分离培养1～6号瓶中菌体，45℃和55℃培养(培养皿用封口膜密封，倒置培养，防止形成水蒸气滴到培养基中，会将单克隆的菌体转移位置)。培养24h后，选取不同的形态的菌，挑取单克隆于装有10mL的LB液体培养基中富集培养，摇床培养(45℃，160rpm/min)。分离纯化过程历时半年。

4.原子力显微镜观察细菌形态：12000rpm离心5min，弃上清，用纯水重悬后涂布在载玻片表面，用原子力显微镜观察细菌形态和大小(图1)。结果显示细菌为短杆状，尺寸为2×1μm.

4.所用培养基成分

以上培养基经高压灭菌(121℃，20min)。

实施例2土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15菌株的16sDNA鉴定:

1.供试菌株：本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15

2.试验方法：

①获得活性良好的细菌：先将S15的菌株复苏，取100uL冻存液注入10mL LB液体培养基，45℃，160rpm摇床培养12-24h。将摇出来的菌液划线培养，45℃恒温箱培养24h，挑取平板上的单克隆，接种到LB液体培养基的试管里摇床45℃，160rpm培养12-24h。

②细菌DNA提取法(Takara试剂盒)

③细菌16S rDNA扩增

所用引物：Seq forward 5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'

Seq reverse 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'

3.试验结果：见说明书附图2。

实施例3土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15菌株的系统进化树的绘制

1.将土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15菌株的16SrDNA序列导入NCBI BLAST出相近种属，选择10个后，利用clustal对比之后，经MEGA5.1绘制出土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15的系统进化树图(图2)。

实施例4土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15菌株的温度依赖和产表活依赖实验:

1.供试菌株：本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15

2.试验方法：①菌株的复苏；先将S15的菌株复苏，取100uL冻存液注入10mL LB液体培养基，45℃，160rpm摇床培养12-24h。②产生物表面活性剂发酵步骤：取LB培养的菌液100μL，加入含10mL产表活的淀粉培养基的试管内，分别在35℃，40℃，45℃，50℃和55℃下摇床培养48小时，转速160rpm；从中取100μL于96孔板中，测OD₆₂₀的值。③产生物表面活性剂的乳化法检测：将摇床拿出的发酵液进行离心，转速4000rpm，时间20min。取上清液4mL于比色管中，加入4mL正己烷，凡士林封口后再用封口膜封几圈，在漩涡震荡混合仪上混合几分钟直至上下完全混匀，静置24小时后，测量乳白色固体的高度与总高度的比值即为EI值，同样的取4mL SDS，加入4mL正己烷作为对照组。

3.试验结果：经测量土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15菌株最适生长温度在45℃(图4)，耐受温度是35℃～55℃；最佳产表活温度是40℃(图5)。其EI＝3.4/5.8＝0.59(图6)。

实施例5土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15产表面活性物质红外光谱分析：

1.供试菌株：本发明土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15

2.试验方法：①菌株的复苏：先将S15的菌株复苏，取100uL冻存液注入10mL LB液体培养基，45℃，160rpm摇床培养12-24h。②产生物表面活性剂发酵步骤：取LB培养的菌液1mL，加入含100mL产表活淀粉培养基的三角瓶，40℃，160rpm摇床培养48小时后；③产物的粗提：将发酵液4700rpm，离心20min，取上清液于试剂瓶内，加酸调pH至2，4℃冰箱过夜放置，离心取沉淀，常温干燥，产物送去红外光谱分析。

3.试验结果：土壤芽孢杆菌(Brevibacillus agri strain)S15菌株在40℃，160rpm下，发酵48小时，酸沉淀获得产物经红外光谱分析得出是脂肽物质(图7)。