本发明属于医药技术领域，具体是涉及一种含有色酮结构的吡唑类D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物及其制备方法与应用。
背景技术：
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D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素，化学结构式如下：
D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素R＝(R)‐CH(CH3)2；
1,3-偶极环加成反应以其良好的区域和主体选择性而成为合成五元杂环化合物最主要的方法,也是杂环药物化学研究中较为活跃的一类反应。近几年来,由于色酮广泛的生物活性,诸如抗癌、抗菌、抑制血小板凝聚等而倍受关注。所以,无论是从药理学还是从合成角度考虑,这类杂环化合物都有很高的合成价值。
技术实现要素：
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本发明的第一方面目的是提供一种D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物。
本发明采取的技术方案如下：
一种D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物，其结构式如下：
式中：R＝(R)-CH(CH3)2.
该化合物相关实验数据如下：
申请人经研究发现：在D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素引入五元吡唑环的基础上导入了色酮的结构可以改变药理活性。通过进一步实验确定：使用色酮衍生物在吡唑的结构上进行取代，对D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素进行结构改造，制备的含色酮结构吡唑类D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物，具有非常好的药物活性。
本发明的第二方面目的是提供一种D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、去甲去氢斑蝥素的合成：将顺丁烯二酸酐研细，加入乙醚，室温条件下搅拌至溶解，滴入呋喃，室温搅拌24～48小时，呋喃与顺丁烯二酸酐发生Diels-Alder反应，制得去甲去氢斑蝥素(化合物1)；
(2)、D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素的合成：
将去甲去氢斑蝥素4.2克(25mmol)和D-缬氨酸2.93克(25mmol)加入经过分子筛干燥的DMF溶剂15毫升中，搅拌回流12小时，冷却至室温后加入乙酸乙酯60毫升稀释，饱和氯化铵溶液洗涤6次，每次30毫升，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤后的有机相减压蒸馏旋干，用乙酸乙酯重结晶得白色固体产物(化合物3)；
(3)、6-溴代色酮苯腙的合成:
采用6-溴代色酮与苯肼脱水反应生成席夫碱的方法，具体操作：取2mmol的苯肼加入盛有10mL四氢呋喃的烧瓶中，沸水浴回流搅拌至溶解，然后缓慢滴加入20mL溶有2mmol6-溴代色酮的无水乙醇溶液，继续沸水浴回流搅拌1h，滴加10滴盐酸，有淡黄色沉淀出现。连续沸水浴回流搅拌5h，停止水浴，加人20mL蒸馏水搅拌，淡黄色沉淀颜色变深，抽滤得黄红色针状产物。用无水乙醚冲洗多次，真空干燥得产物6-溴代色酮苯腙(化合物4)；
(4)、导入色酮结构：
将1mmol D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素和1.1mmol6-溴代色酮苯腙于20mL乙醇中，再加入1.2mL氯胺T，回流9小时，TLC检测反应完成后，得到淡黄色沉淀，减压过滤出沉淀，沉淀用甲醇重结晶，真空干燥后得到产物(化合物5)。
本发明涉及的反应如下：
本发明的第三方面目的是提供一种D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物在制备抗肿瘤药物方面的应用。通过实验验证：上述化合物，对于不同瘤株如人肝癌细胞、口腔癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、白血病细胞、肠癌细胞等，具有抑制作用，其中对于Bel7402(人肝癌细胞)具有更佳的抑制率和选择性，可单独制备抗肿瘤药物、也可以作为活性成分与其他抗肿瘤药物制备抗肿瘤组合物，具有非常好的工业应用前景。
本发明的有益效果如下：
申请人通过研究发现：在D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素引入五元吡唑环的基础上导入了色酮的结构，产生的衍生物，具有良好的药物活性，经进一步实验及分析，研究不同杂环在同一分子中聚集而对药理活性所产生的影响,用1,3‐偶极环加成方法在D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素结构中C5和C6位引入吡唑环，与色酮衍生物反应导入色酮结构，合成含有色酮结构的吡唑类D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物，该衍生物在制备抗肿瘤药物方面，具有非常好的工业应用前景。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但实施例不应解释为限定本发明的范围。
实施例1：
(1)、去甲去氢斑蝥素的合成：
将顺丁烯二酸酐研细，加入乙醚，室温条件下搅拌至溶解，滴入呋喃，室温搅拌24～48小时，呋喃与顺丁烯二酸酐发生Diels-Alder反应，制得去甲去氢斑蝥素(化合物1)；
(2)、D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素的合成：
将去甲去氢斑蝥素4.2克(25mmol)和D-缬氨酸2.93克(25mmol)加入经过分子筛干燥的DMF溶剂15毫升中，搅拌回流12小时，冷却至室温后加入乙酸乙酯60毫升稀释，饱和氯化铵溶液洗涤6次，每次30毫升，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤后的有机相减压蒸馏旋干，用乙酸乙酯重结晶得白色固体产物(化合物3)；
(3)、6-溴代色酮苯腙的合成：
取2mmol的苯肼加入盛有10mL四氢呋喃的烧瓶中，沸水浴回流搅拌至溶解，然后缓慢滴加入20mL溶有2mmol 6-溴代色酮的无水乙醇溶液，继续沸水浴回流搅拌1h，滴加10滴盐酸，有淡黄色沉淀出现。连续沸水浴回流搅拌5h，停止水浴，加人20mL蒸馏水搅拌，淡黄色沉淀颜色变深，抽滤得苯腙，黄红色针状产物。用无水乙醚冲洗多次，真空干燥得产物6-溴代色酮苯腙(化合物4)。
(4)、导入色酮结构：
将1mmol D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素和1.1mmol6-溴代色酮苯腙于20mL乙醇中，再加入1.2mL氯胺T，回流9小时，TLC检测反应完成后，得到淡黄色沉淀，减压过滤出沉淀，沉淀用甲醇重结晶，真空干燥后得到产物(化合物5)。
化合物5名称：D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物；
化学式：C29H23BrN3O7；
物化参数：黄色结晶，产率53.5％，m.p.115‐116℃；
结构确认：
1H NMR(CD3OD)δ:7.32‐7.16(m,8H,Ar‐H),6.46(s,1H,C＝C‐H),5.16(d,J＝9.60Hz,1H,H5),4.74(d,J＝17.60Hz,1H,H4),4.56(d,J＝17.60Hz,1H,H1),4.02(d,J＝9.60Hz,1H,H6),3.42(d,J＝7.20Hz,1H,H3),3.28(d,J＝7.20Hz,1H,H2),2.63‐2.75(m,1H,CH),0.72(d,3H,J＝6.4Hz,CH3),0.94(d,3H,J＝6.4Hz,CH3)；
IR 3428(N‐C＝O),3085(ArH),1703(C＝O),1541(C＝N),1310(C‐O‐C)cm‐1；
m/e:604(100.0％),606(97.5％)；
Anal.calcd.for C29H23BrN3O7：C,57.52；H,3.88；N,6.90。
应用实施例：采用MTT法检测受试化合物对不同瘤株的的抗肿瘤活性。
将上述实施例制备的化合物(5)，分别以不同瘤株(肿瘤细胞Bel-7402、KB、SGC7901、HO8901、HL-60、ECA109)为实验对象，测试化合物(5)对于不同瘤株的体外抑制作用：实验采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)，活性用半数抑制浓度表示(IC50)。
具体实验步骤如下：
将化合物5用DMSO溶解，稀释，肿瘤细胞Bel-7402(人肝癌细胞)、KB(口腔癌细胞)、SGC7901(胃癌细胞)、HO8901(卵巢癌细胞)、HL-60(白血病细胞)、ECA109(肠癌细胞)在96孔板上种入4000个/200μL/孔，每孔加入化合物2μL，终浓度为12.0μM，6.0μM，3.0μM，1.5μM，共同于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育72小时，以DMSO(1％)为空白对照。72小时后，加入终浓度为0.25mg/mL的MTT，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中4小时，之后吸干溶剂，每孔加入100μl DMSO，用酶联免疫仪于570nm处测定吸光度(OD值)，所得数据用于计算IC50值。不同浓度的受试化合物用96孔板进行粗筛，根据所得的抑制率，计算IC50值，结果见下表。
表1、D‐缬氨酸取代去甲斑蝥素衍生物对六种肿瘤细胞株的IC50值。
通过上表数据可以看出：本发明制备的化合物，对于多种肿瘤细胞株具有抑制作用，其中对于Bel7402(人肝癌细胞)具有更好的抑制率和选择性，可以单独制备抗肿瘤药物、也可以作为活性成分与其他抗肿瘤药物制备抗肿瘤组合物，具有非常好的工业应用前景。