本发明涉及分子生物学以及基因工程领域。特别是一种存在于白蜡虫中的抗冻蛋白基因ep-afp及其编码的核苷酸序列。
背景技术：
白蜡虫在我国广大地区均有分布，2006年在吉林长春也首次发现了白蜡虫。至此，在最冷月平均气温-10.2℃，极端最低气温-31.0℃的严寒地带仍有白蜡虫自然种群存在，说明该虫对低温具有极不寻常的适应能力。昆虫耐寒性是受多种机制控制，其中抗冻蛋白antifreeze protein AFP的诱导表达在昆虫抗寒中扮演重要作用。AFP通过其热滞活性可以使冰点下降3-6℃，AFP的产生不但可以使昆虫机体长时间地维持亚稳态的过冷却状态，也能够组织体表的冰进一步进入体液中，此外，AFP不仅能提高血淋巴的过冷却能力，对于维持机体内的离子梯度也有重要的功能。
抗冻蛋白的主要功能就是热滞活性，昆虫抗冻蛋白的热滞活性相比于鱼类或植物其抑制冰晶生长的活性更高。一些昆虫抗冻蛋白己被克隆和表达，昆虫抗冻蛋白的活性比鱼类抗冻蛋白活性高3-4倍。目前抗冻蛋白的研究主要集中在为数不多的几个物种，这些物种的抗冻能力远不及白蜡虫。
本研究以东北地区耐极端低温的白蜡虫为研究材料，结合高通量测序技术，发掘具有较高热滞活性的抗冻蛋白，作为提高植物抗寒性转化的首选基因。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗冻性能的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp及其编码的氨基酸序列。
本发明以我国东北地区耐极端低温的白蜡虫为材料，通过PCR扩增得到目的片段，连接到pGEM-T载体上构建重组质粒，获得ep-afp基因的阳性重组克隆；利用同源重组构建原核表达载体pET-22b/afp，重组质粒转入BL21表达菌株中进行原核表达，利用差示扫描量热法分析纯化蛋白的热滞活性为0.91℃。
本发明的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp核苷酸全长序列或其片段采用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得，白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成，SEQ ID NO:1具体如下：
ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATAAGTCTGTTCCACTCGCTCACTTCATTTCTGCTTTCAAGATTTTCGTTACTCACAAGCAAGGGACTCAAGGGATGATGGATACTGCTTCTAAGGCTACTCTCGATAATCAATTCGGGACTTCTGTTGATGAAGAAGTTATTAAGCAAATTCTCGAACAAGGGAACATGCAATCTTCTGAAATGCTCGATCGTCAAGGGCCAAAGAACGATTCTATGTCTTCTATGAATGCTCGTTAG
本发明的用白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp编码的氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，SEQ ID NO:2具体如下：
用于植物转基因时，根据烟草密码子偏好性修改的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成，SEQ ID NO:3具体如下：
ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATAAGTCTGTTCCACTCGCTCACTTCATTTCTGCTTTCAAGATTTTCGTTACTCACAAGCAAGGGACTCAAGGGATGATGGATACTGCTTCTAAGGCTACTCTCGATAATCAATTCGGGACTTCTGTTGATGAAGAAGTTATTAAGCAAATTCTCGAACAAGGGAACATGCAATCTTCTGAAATGCTCGATCGTCAAGGGCCAAAGAACGATTCTATGTCTTCTATGAATGCTCGT
本发明中所用的方法均为同领域技术人员公知的方法。
本发明的有益效果在于：
1、抗冻蛋白的主要功能是热滞效应Thermal hysteresis activity,THA，即降低溶液的冰点，但不改变其熔点，从而产生冰点与熔点之间的温度差值。这种热滞值越大，抗冻蛋白的活性就越高。在所有抗冻蛋白中，昆虫抗冻蛋白具有很高的热滞活性，为鱼类抗冻蛋白热滞活性的3-4倍。因此昆虫抗冻蛋白具有更高的应用价值。
2、本发明在实验中有明显的效果，我国拥有众多昆虫种类，却很少从其体内发现抗冻蛋白，本发明的白蜡虫抗冻蛋白ep-afp正是具备抗冻作用的新的蛋白，该蛋白的热滞活性达到0.91℃，具有很大的应用价值。
具体实施方式
本实施例中所用的方法均为同领域技术人员公知的方法。
本发明的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp核苷酸全长序列或其片段采用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成，SEQ ID NO:1具体如下：
ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATAAGTCTGTTCCACTCGCTCACTTCATTTCTGCTTTCAAGATTTTCGTTACTCACAAGCAAGGGACTCAAGGGATGATGGATACTGCTTCTAAGGCTACTCTCGATAATCAATTCGGGACTTCTGTTGATGAAGAAGTTATTAAGCAAATTCTCGAACAAGGGAACATGCAATCTTCTGAAATGCTCGATCGTCAAGGGCCAAAGAACGATTCTATGTCTTCTATGAATGCTCGTTAG
本发明的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp采用PCR扩增法，根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计特异引物ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTC和CTAACGAGCATTCATAGAAG，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规的cDNA文库作为模板，扩增而得到白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp的核苷酸序列。将该基因克隆至大肠杆菌感受态细胞，一旦获得了该基因的阳性重组克隆，就能够用重组法来大批量地获得该基因。通常是将其克隆入原核表达载体pET-22b，再转入大肠杆菌表达菌株BL21的感受态细胞，然后通过常规的IPTG诱导的方法进行目的基因的原核表达，从增殖后的宿主细胞中分离得到白蜡虫抗冻蛋白。
本发明的用白蜡虫抗冻蛋白Ep-AFP编码的氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，SEQ ID NO:2具体如下：
用于植物转基因时，根据烟草密码子偏好性对白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp进行修改，得到核苷酸序列SEQ ID NO:3，具体如下：
ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATAAGTCTGTTCCACTCGCTCACTTCATTTCTGCTTTCAAGATTTTCGTTACTCACAAGCAAGGGACTCAAGGGATGATGGATACTGCTTCTAAGGCTACTCTCGATAATCAATTCGGGACTTCTGTTGATGAAGAAGTTATTAAGCAAATTCTCGAACAAGGGAACATGCAATCTTCTGAAATGCTCGATCGTCAAGGGCCAAAGAACGATTCTATGTCTTCTATGAATGCTCGT
本发明的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp编码的核苷酸序列，按照以下方法获得：
(1)总RNA提取、文库构建与高通量测序：于12月-次年1月采集东北地区越冬白蜡虫雌成虫，立刻加入Trizol研磨匀浆，提取总RNA。
(2)cDNA合成：提取RNA后，利用氯仿、异丙醇抽提，最后将提取的RNA溶解于无RNA酶的水中。用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外/可见分光光度计(NanoDrop ND1000 Spectrophotometer)测定总RNA的浓度和纯度。以1.0μg总RNA为模板，用Oligo(dT)作反转录下游引物，70℃温育10min后迅速在冰上冷却2min以上。用MLV反转录酶进行反转录反应，42℃温育1h，70℃温育15min后冰上冷却，将反转录产物cDNA置于-20℃冰箱保存备用。
(3)抗冻蛋白基因的克隆：为构建抗冻蛋白基因，以cDNA为模板，设计引物扩增白蜡虫afp基因的cDNA片段。反应条件:94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，用切胶回收试剂盒回收。然后连接到pGEM-T载体上构建重组质粒pGEM-T-afp，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。对制备的重组质粒溶液，用紫外分光光度计测OD值，计算OD260/OD280分析质粒纯度，并记录原始浓度。将此溶液作为标准品原液储存于-20℃冰箱备用。
(4)原核表达载体构建：设计带有和载体同源序列的上游引物和下游引物，以获得的重组质粒pGEM-T-afp为模板，进行PCR扩增，PCR产物纯化后，和表达载体pET-22b混合，在重组酶的作用下发生同源重组，重组产物转化克隆菌株DH5α，采用T7引物筛选阳性重组克隆，送交生物公司测序。重组质粒命名为pET-22b/afp。对于确定序列正确的菌株，摇菌后抽提质粒，质粒转化BL21表达菌株，T7引物检测阳性克隆，测序确认后，加入甘油-70℃保存。
(5)原核表达：经IPTG(0.5M)诱导表达后，SDS-PAGE检测蛋白表达，发现一条明显的表达条带，接近理论分子量15kDa。
(6)热滞活性检测：利用低压层析系统进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化，蛋白纯化后，采用差示扫描量热仪测定熔点和冰点之间的差值，以牛血清蛋白为对照，分析白蜡虫抗冻蛋白的热滞活性，获得热滞活性较高的白蜡虫抗冻蛋白基因。
白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp，根据上述SEQ ID NO:2序列直接在生物公司合成；修改后的用于植物转基因的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp，也能根据上述SEQ ID NO:3序列直接在生物公司合成。
SEQUENCE LISTING 1
<110> 中国林业科学研究院资源昆虫研究所
<120> 白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp及其编码的氨基酸序列
<130> PatentIn version 3.5
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<400> 1
atgactcgtg gggaagcttc tcaaattaag gttcactata aggggaagga tgaagatttc 60
attgttctcg ttgatgatga agcttcttat aagaagtggc tcgctgataa gtctgttcca 120
ctcgctcact tcatttctgc tttcaagatt ttcgttactc acaagcaagg gactcaaggg 180
atgatggata ctgcttctaa ggctactctc gataatcaat tcgggacttc tgttgatgaa 240
gaagttatta agcaaattct cgaacaaggg aacatgcaat cttctgaaat gctcgatcgt 300
caagggccaa agaacgattc tatgtcttct atgaatgctc gttag 345
SEQUENCE LISTING 2
<110> 中国林业科学研究院资源昆虫研究所
<120> 白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp及其编码的氨基酸序列
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<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
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Met Asn Ala Arg 114
SEQUENCE LISTING 3
<110> 中国林业科学研究院资源昆虫研究所
<120> 白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp及其编码的氨基酸序列
<130> PatentIn version 3.5
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<170> PatentIn version 3.5
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