本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是一种测定菌群中已知基因组信息物种的种特异性引物的设计方法及应用该引物测定相应菌种在菌群中的含量的方法。
背景技术：
：目前对于微生物群落中物种鉴别的研究集中在两个方向：一是以保守性核糖体基因序列(如：16S，ITS序列)为研究目标，从整体水平上看微生物群落的组成；二是以单个物种微生物为研究目标，涉及通过分离纯化，形态学和分子生物学鉴定，或通过denovo宏基因组测序的手段对物种的基因组信息进行解读。概括来说，前者只通过保守序列而确定物种信息显然是不准确的，而后者的实验操作既繁琐又昂贵，并不适于同时批量研究众多微生物物种。具体从定量来说，现在已经能够以核糖体基因如16SrRNA/ITS为扩增主体的门、纲等特异性引物设计并用于相应分类层面的微生物群落结构的定量。但是，通过设计特异性引物和qPCR定量的方法很难实现纲以下分类层面的微生物群落定量。随着高通量测序成本的降低，高通量测序可以在一定程度上解决这个问题，现在通过16SrRNA高通量测序可以即快速又经济实现微生物群落中各物种组成和含量的定量。不过，受高通量测序读长的限制，高通量测序并不能实现16SrRNA基因全长测序，所以对单条序列也只能定位到属，而不能定位到种，这也是受保守序列本身固有的保守性所限制的。从另外一个角度来看，目前具有全基因组信息的物种逐年增多，很多人尝试使用生物信息学手段分析已有微生物的全基因组信息，找出其物种特异性序列，尝试通过设计探针、特意引物等用于后续物种特异性的解析。但是这些引物需要经常更新，因为随着越来越多微生物的基因组序列被测定，以前认为的物种特异性序列很可能失去其特异性，需要定期重新设计。从微生物群落分子生物学研究角度来说，微生物研究经历了依靠分离纯化培养和形态鉴定的形态学研究时代，到目前以微生物基因为研究目标的分子时代。在分子研究方法上可以分为以核糖体文库克隆(如TA克隆)及Sanger测序为代表的一代测序，以IlluminaMiseq为代表的二代测序，以及最新的第三代高通量测序。TA克隆测序样本量不够大，费用也不算便宜，但其测序长度可以实现核糖体基因的几乎全长，可以比较准确地确定复杂菌群中的一批菌种，继而依据这些比较准确的物种信息对多个物种进行测定。天然菌群样本中微生物种类繁多复杂，对于一些天然的功能微生物群落亦是如此。研究功能微生物群落的功能需要首先了解其基本的微生物组成，以及重点的探究其中几种核心功能微生物的含量随着功能微生物群落周期变化而变化的过程。往往这些核心微生物由于其重要性其(全)基因组序列早已经过测序分析。但是受引物设计及检测方法的限制，目前微生物菌群结构的定量可实现门、纲分类层面的定量，而缺乏有效利用已知的基因组信息，通过设计特异性引物和qPCR定量来实现纲以下分类层面的微生物群落结构定量的方法。技术实现要素：本发明的目的在于结合使用以上几种研究方法，提供一种测定菌群中已知基因组信息物种的种特异性引物的设计方法及应用该引物测定相应菌种在菌群中的含量的方法。本发明提供一种测定微生物群落中已知基因组信息物种的种特异性引物的设计方法，其引物设计按照如下步骤实施：步骤S1，核糖体基因接近全长的文库克隆测序；步骤S2，生物信息学分析(BLAST等)确定菌群中的物种信息以及查询具备基因组序列的物种；步骤S3,使用PRIMER-BLAST在线工具设计物种特异性引物；步骤S4，引物特异性检测。上述方法，步骤S1中，使用核糖体接近全长的通用引物16SrDNA的27F-1492R以微生物群落混合基因组为模板进行PCR扩增并进行文库克隆测序。上述方法，步骤S2中，寻找核糖体基因全长克隆序列能与其≥99％匹配的目标物种，且匹配值(identity)越接近100％越好。上述方法，步骤S3中，以步骤S2中生物信息学分析所得到的具有基因组信息的物种的基因组序列依次以50000bp为模板进行特异性引物设计直到找到合适的种特异性引物，设定扩增产物大小为100～400bp，并最终将所得引物扩增产物的序列进行blast验证，双保险确认引物特异性。进一步优化，使用PRIMER-BLAST在线工具设计物种特异性引物除了需要目标物种的基因组信息序列作为模板序列输入外，还需要菌群中的其余物种的taxid信息输入作为背景物种。上述方法，步骤S4中，是以目标菌种和非目标菌种的基因组为模板进行PCR扩增，特异性引物只能在以目标菌种基因组为模板的情况下产生目标扩增，在以非目标菌种基因组为模板进行PCR扩增不产生任何目标条带或只有引物二聚体。上述方法是基于基因组序列，得到物种特异性引物，即根据物种特异性序列(物种特异性引物对的扩增产物)在微生物宏基因组样本中的拷贝数进行定量的方法，而并不是定量微生物群落中特定微生物的细胞的详细个数。利用所述方法的通用性和使用该方法所设计的物种特异性引物的局限性，针对任何微生物群落，使用该方法都可以针对菌群中有基因组信息的物种设计出物种特异性引物，这些物种特异性引物是针对该菌群的物种特异性引物。本发明提供一种测定菌种含量的方法，该方法是应用qPCR进行定量测定，qPCR定量测定中使用的引物为上述步骤S1-S4设计并特异性验证过的种特异性引物。所述qPCR定量测定是使用含有目标扩增产物的质粒作为标准品进行标准曲线的制作，以特异性引物进行扩增未知样品基因组，通过未知样品在标准曲线上的位置得到未知样品中目标微生物中对应特异性扩增序列的拷贝数。本发明引物设计方法是基于微生物群落中某些已知基因组信息的物种的种特异性引物的设计方法。通过近全长的核糖体基因文库克隆测序、生物信息学分析(BLAST等)确定菌群中的物种及其相对丰度、查询已经具备基因组序列的物种、依据PRIMER-BLAST工具设计物种特异性引物、并对引物特异性检测，从而得到种特异性的引物。实现对微生物群落中的各种微生物物种有一个准确认识并能够做到对核心微生物物种的准确定量。目前随着测序技术的改进和测序成本的降低，越来越多微生物的基因组序列得以解读，相信本发明的实用性会越来越广泛。本发明的实施所涉及的耗材都是常见的分子生物学试剂，方便易得。所应用的qPCR体系配置可以使用任何常见的试剂盒。附图说明图1为实施例2中的引物扩增电泳图。图2为实施例2中使用纯培养菌的基因组进行PCR验证结果。a-g代表7株菌依次为：Pseudomonasputida(CICC10368),Staphylococcussaprophyticus(CICC22941),Bacilluslicheniformis(ATCC14580),Lactobacillusplantarum(CICC20265),Enterobacterasburiae(CICC20804),Bacillussubtilis(CICC10033)和Lactobacillusfermentum(CICC22808)。图3为土壤样品中的含量检测结果。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的描述。一种测定菌群组成结构的方法，包括以下步骤：1.核糖体基因接近全长的文库克隆测序首先提取目标微生物群落的宏基因组。以宏基因组为模板，核糖体基因通用引物对比如27F-1492R为引物进行普通PCR扩增(退火58℃，35个循环以内)，将PCR产物电泳后切胶纯化做文库克隆如TA克隆，连接到pMD-19T载体上，然后将连接有PCR产物的pMD-19载体转化到感受态DH5α大肠杆菌细胞中。然后进行铺板进行蓝白斑筛选，随机挑取白斑菌落使用pMD-19载体上的通过引物(M13F-47/M13F-48)进行sanger双向测序。等测完序后，通过双向拼接去载体，得到载体中插入的近乎全长的16SrRNA基因序列。并进行比对优化，删除其中的嵌合体序列，测序偏短的序列(可能来自于断裂的PCR产物片段)。2.生物信息学分析(BLAST等)确定菌群中的物种信息以及查询具备基因组序列的物种将(1)中得到的所有的核糖体rRNA基因序列在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov))上进行Blast确定其归属。确定只有相似度≥99％的才能够确定其菌种身份。随后将微生物群落中确定有的微生物物种名字输入到EBI基因组网站(www.ebi.ac.uk/genomes/)检查其是否有(全)基因组序列，并将其(全)基因组序列下载下来用于后续的物种特异性引物设计。3.使用PRIMER-BLAST在线工具设计物种特异性引物以(2)中得到的(全)基因组序列为模板在Primer-Blast网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行物种特异性引物设计。在PCRTemplate框中输入目标菌种的基因组序列。Primer-Blast在线工具限制此处输入的序列长度最大50000bp，所以每次只能输入50kb；同时在“PrimerPairSpecificityCheckingParameters”框中依次选择：Automatic，nr，通过“Addmoreorganisms”将微生物群落中的所有非目标菌种名字或者taxonomyid输入，一切输入完毕后点击“GetPrimers”进行引物设计。如果得不到理想的引物对，依次输入目标Template的下一个50kb基因序列。扩增长度不长于400bp。4.引物特异性检测引物特异性的检测包括以下三步：a)PCR目标产物的网上筛选；b)以宏基因组为模板进行扩增并进行PCR产物测序；c)纯培养菌的PCR筛选试验。首先，将待测引物的目标产物序列在NCBI网站上进行Blast，根据Blast结果初步检测引物的特异性，Blast结果中只出现目标菌或者90％相似度以上的都是目标菌，则该引物对可以用于引物合成。其次，使用微生物群落样本宏基因组为模板，进行PCR扩增并跑电泳，根据PCR产物在电泳图上的序列大小初步确定目标序列是否正确，如果位置正确将PCR产物进行纯化和测序，并将测序所得序列再次进行Blast，用于确认引物的特异性。最后，如果以上两步都证明该引物特异性足够好，使用一些目标或者非目标纯培养菌基因组进行验证，最终认定只能扩增目标基因组并得到正确条带而不能扩增非目标菌种的引物为目标物种的物种特异性引物。5.QPCR定量测定；通过以上四步确认物种特异性引物的特异性后，使用物种特异性引物，进行qPCR定量检测该物种在未知样品中的含量。QPCR定量实验分为以下三部分：a)标准品的制备；b)qPCR体系的配置以及预实验；c)qPCR定量实验。首先，做qPCR实验之前需要准备qPCR定量实验的标准品用于标准曲线的绘制。本研究使用含有目标扩增产物序列的质粒作为标准品。质粒标准品的制备即是通过TA克隆将纯化的目标PCR产物连接到pMD-19T载体上，并转化入DH5α感受态大肠杆菌体内扩增，扩增后液体培养大肠杆菌提取质粒。使用分光光度计(Nanodrop1000)对提取的质粒进行浓度和质量检测，务必保证使用合格的质粒(1.7＜OD260nm/280nm＜1.9)用于qPCR实验的标准品。最终将质粒的浓度单位换算为copy浓度用于qPCR实验。其次，qPCR体系的配置可以使用任何qPCR试剂盒及qPCR仪器。qPCR仪器要求可以检测对应试剂盒包含的荧光物质，如EvaGreen,SYBRgreen等。在正式进行qPCR检测之前，一定要进行一次梯度退火PCR选择一个最适合目标引物的退火温度，并且进行一次模拟qPCR实验检查一下PCR产物的溶解曲线是不是与标准品的产物的溶解曲线的Tm值是否一致。最后进行qPCR检测的时候，需要做至少5个梯度的标准曲线，并保证未知样品的浓度在标准曲线的线性范围内。包括空白对照和标准品在内的每个样品做三次重复。最终，根据未知样品在标准曲线上的位置计算出未知样品中目标物种的物种特异性序列(物种特异性引物的扩增产物)的copy浓度。用这个浓度除以物种特异性序列在其全基因组序列中的拷贝数就可得到该物种在未知样品中拷贝浓度。以下通过对土壤中的菌群组成结构测定，并用qPCR方法定量几种微生物组成为例对本发明进一步详述，但本发明不局限于下述实施例。实施例一16SrRNA基因TA克隆测序及生物信息学分析首先将某土壤样本样品新鲜称取200毫克，采用Solarbio土壤基因组试剂盒或上海生工EZUP柱式土壤基因组抽提试剂盒方法提取基因组，最后洗脱体积为100μL。基因组模板样品(10-50ng/ul)-80℃冷藏备用。土壤土样可以塑料袋密封在-80度冰箱保存1-2年。通过某土壤样本中16SrDNA的扩增，其扩增引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，扩增模板为从土壤样本中提取的宏基因组。将PCR扩增产物进行纯化后通过TA克隆连接到pMD-19T载体上并转化入感受态DH5α大肠杆菌中，然后通过LBA培养筛选蓝白斑，并挑取白斑进行测序，获得1299个有效克隆。这些克隆通过Blast分析其详细的种属归属，得到其微生物群落组成如表1所示。表格1实施例1中的微生物群落结构实施例二特异性引物设计及筛选根据施例1中得到的微生物种类，将各微生物物种名字输入到EBI基因组网站(www.ebi.ac.uk/genomes/)检查其是否有(全)基因组信息(表格1)，并将其(全)基因组序列信息下载下来用于后续的物种特异性引物设计。得到的(全)基因组序列信息为模板在Primer-Blast网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行物种特异性引物设计。在PCRTemplate框中输入目标菌种的(全)基因组信息，由于此处序列长度最大50000bp，所以每次只能输入50kb；退火温度选择60±3℃，引物长度为100～400bp，同时在“PrimerPairSpecificityCheckingParameters”框中依次选择：Automatic，nr，通过“Addmoreorganisms”将微生物群落中的所有非目标菌种名字或者taxonomyid输入，一切输入完毕后点击“GetPrimers”进行引物设计。设计完的引物信息见表格2所示。表格2实施例2设计的种特异性引物信息用以上引物首先进行PCR扩增，电泳，然后将大小符合目标大小的PCR产物切胶纯化测序，并将测序成功的PCR产物与目标产物进行两序列比对并进行Blast验证。电泳图如图1所示。其中*号标注的是测序匹配的引物对。最后用纯培养菌基因组进一步验证16对引物的扩增特异性。实验室使用以下七株菌Pseudomonasputida(CICC10368),Staphylococcussaprophyticus(CICC22941),Bacilluslicheniformis(ATCC14580),Lactobacillusplantarum(CICC20265),Enterobacterasburiae(CICC20804),Bacillussubtilis(CICC10033)和Lactobacillusfermentum(CICC22808)验证了对应的7对特异性引物的特异性。结果如图2所示。实施例3qPCR体系的配置与qPCR定量测定1.所述的qPCR体系可以使用一般性qPCR试剂盒。以GREDBIO的NPK62试剂盒(含2×buffer)为例，qPCR体系的组成参见表格3。表格2NPK62试剂盒(GREDBIO)qPCR体系组成2×PCR缓冲液(含荧光染料和PCR增效剂)6μL引物1(2μM)1μL引物2(2μM)1μL模板+H2O3.8μLTaq酶(5U/μL)0.2μL总体积为12μL2.标准品的制备：本实验中qPCR使用含有目标PCR产物的质粒作为标准品。其制备方法为：将7个PCR产物经过切胶纯化通过TA克隆连接到pMD-19T载体中，然后转化到感受态DH5α大肠杆菌细胞中。然后将大肠杆菌工程菌经过液体培养摇菌，使用质粒提取试剂盒提取质粒。将提取的质粒使用NanoDrop分光光度计检测质粒质量和浓度。将质量合格的质粒用做标准品进行下一步的qPCR绝对定量。质粒标准品在用作qPCR标准品之前需要将其浓度换算为copy浓度。换算公式为：DNA(copy/mL)=6.02×1023(copy/mol)×DNA(ng/μL)DNAlength(bp)×660(daltons/bp)]]>上述公式中6.02×1023：阿伏伽德罗常数，每摩尔的分子个数。DNAlength：标准品DNA的长度，在本实验中标准品是质粒的长度。即质粒DNA的全长加上插入的PCR产物的长度。pMD-19T质粒的长度为2692bp再加上PCR产物的长度就是此处标准品的总分子量。3.使用上述7对物种特异性引物检测了两个土壤样品中的含量。检测结果如图3所示当前第1页1 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