一种鉴定H5亚型AIV和N6亚型AIV的引物组合及其应用的制作方法

本发明涉及一种鉴定H5亚型AIV和N6亚型AIV的引物组合及其应用。

背景技术：

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是有正黏病毒科A型流感病毒属，根据血凝素(henmagglutinin，HA)和神经氨基酸(neuraminidase，NA)抗原性差异可分为不同亚型，目前已发现有18种HA(H1-H18)亚型和11种NA(N1-N11)。1975年H5N6亚型病毒首次从美国绿头鸭体内分离出来，据报道以往H5N6亚型病毒主要以低致病状态在禽类(主要是鸭类)流行，对养禽业并没有明显的影响。2013年，我国江苏省首次在活禽市场监测中发现H5N6禽流感病毒并对其基因分析发现H5N6禽流感病毒竟由H5N1和H6N6两种亚型禽流感病毒基因重组而来，并且多个基因来源于H5N1高致病禽流感病毒使其具备了高致病的特性。2014年，我国四川省南充市首次从人类中分离了高致病性H5N6禽流感病毒，之后在云南广东相继也有报道，AIV进一步从禽类到人类转变，建立一种能快速检测H5N6的检测方法十分紧迫。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鉴定H5亚型AIV和N6亚型AIV的引物组合及其应用。

本发明提供了一种引物组合，由引物对I和引物对II组成；

所述引物对I由引物H5-F和引物H5-R组成；

所述引物H5-F为如下(a1)或(a2)；

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物H5-R为如下(a3)或(a4)；

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物对II由引物N6-F和引物N6-R组成；

所述引物N6-F为如下(a5)或(a6)；

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物N6-R为如下(a7)或(a8)；

(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合的用途为如下(b1)至(b6)中的任意一种：

(b1)鉴别H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV和N6亚型且非H5亚型的AIV；

(b2)制备用于鉴别H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV和N6亚型且非H5亚型的AIV的试剂盒；

(b3)鉴定待测病毒是否为H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV或N6亚型且非H5亚型的AIV；

(b4)制备用于鉴定待测病毒是否为H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV或N6亚型且非H5亚型的AIV的试剂盒；

(b5)检测待测样本中是否含有H5N6亚型AIV和/或H5亚型且非N6亚型的AIV和/或N6亚型且非H5亚型的AIV；

(b6)制备检测待测样本中是否含有H5N6亚型AIV和/或H5亚型且非N6亚型的AIV和/或N6亚型且非H5亚型的AIV的试剂盒。

本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(b1)至(b6)中的任意一种：

(b1)鉴别H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV和N6亚型且非H5亚型的AIV；

(b2)制备用于鉴别H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV和N6亚型且非H5亚型的AIV的试剂盒；

(b3)鉴定待测病毒是否为H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV或N6亚型且非H5亚型的AIV；

(b4)制备用于鉴定待测病毒是否为H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV或N6亚型且非H5亚型的AIV的试剂盒；

(b5)检测待测样本中是否含有H5N6亚型AIV和/或H5亚型且非N6亚型的AIV和/或N6亚型且非H5亚型的AIV；

(b6)制备检测待测样本中是否含有H5N6亚型AIV和/或H5亚型且非N6亚型的AIV和/或N6亚型且非H5亚型的AIV的试剂盒。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)鉴别H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV和N6亚型且非H5亚型的AIV；

(c2)鉴定待测病毒是否为H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV或N6亚型且非H5亚型的AIV；

(c3)检测待测样本中是否含有H5N6亚型AIV和/或H5亚型且非N6亚型的AIV和/或N6亚型且非H5亚型的AIV。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护一种鉴别H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV和N6亚型且非H5亚型的AIV的方法，包括如下步骤(d1)或(d2)：

(d1)提取待测病毒的RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果扩增产物中含有418bp的DNA片段和251bp的DNA片段、待测病毒为或候选为H5N6亚型AIV，如果扩增产物中含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段、待测病毒为或候选为H5亚型且非N6亚型的AIV，如果扩增产物中含有251bp的DNA片段且不含有418bp的DNA片段、待测病毒为或候选为N6亚型且非H5亚型的AIV；

(d2)检测待测病毒的cDNA中是否含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段或序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段，然后进行如下判断：如果所述cDNA中同时含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段和序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测病毒为或候选为H5N6亚型AIV，如果所述cDNA中含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段且不含有序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测病毒为或候选为H5亚型且非N6亚型的AIV，如果所述cDNA中含有序列表序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段且不含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段、待测病毒为或候选为N6亚型且非H5亚型的AIV。

本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为H5N6亚型AIV、H5亚型且非N6亚型的AIV或N6亚型且非H5亚型的AIV的方法，包括如下步骤(e1)或(e2)：

(e1)提取待测病毒的RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果扩增产物中含有418bp的DNA片段和251bp的DNA片段、待测病毒为或候选为H5N6亚型AIV，如果扩增产物中含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段、待测病毒为或候选为H5亚型且非N6亚型的AIV，如果扩增产物中含有251bp的DNA片段且不含有418bp的DNA片段、待测病毒为或候选为N6亚型且非H5亚型的AIV，如果扩增产物中不含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段、待测病毒为或候选为非N6亚型AIV且非H5亚型AIV的病毒；

(e2)检测待测病毒的cDNA中是否含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段或序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段，然后进行如下判断：如果所述cDNA中同时含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段和序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测病毒为或候选为H５N6亚型AIV，如果所述cDNA中含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段且不含有序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测病毒为或候选为H5亚型且非N6亚型的AIV，如果所述cDNA中含有序列表序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段且不含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段、待测病毒为或候选为N6亚型且非H5亚型的AIV，如果所述cDNA中不含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段且不含有序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测病毒为或候选为非N6亚型AIV且非H5亚型AIV的病毒。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有H５N6亚型AIV和/或H5亚型且非N6亚型的AIV和/或N6亚型且非H5亚型的AIV的方法，包括如下步骤(f1)或(f2)：

(f1)提取待测病毒的RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果扩增产物中含有418的DNA片段和251bp的DNA片段、待测样本为如下(g1)或(g2)：(g1)疑似含有H５N6亚型AIV的待测样本；(g2)疑似含有H5亚型AIV和N6亚型AIV的待测样本，如果扩增产物中含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段、待测样本疑似含有H5亚型且非N6亚型的AIV，如果扩增产物中含有251p的DNA片段且不含有418bp的DNA片段、待测样本疑似含有N6亚型且非H5亚型的AIV，如果扩增产物中含有不含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段、待测样本疑似不含有H5亚型AIV且疑似不含有N6亚型AIV；

(f2)检测待测样本的cDNA中是否含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段和序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段，然后进行如下判断：如果所述cDNA中同时含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段或序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测样本为如下(g1)或(g2)：(g1)疑似含有H5N6亚型AIV的待测样本；(g2)疑似含有H5亚型AIV和N6亚型AIV的待测样本，如果所述cDNA中含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段且不含有序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测样本疑似含有H5亚型且非N6亚型的AIV，如果所述cDNA中含有序列表序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段且不含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段、待测样本疑似含有N6亚型且非H5亚型的AIV，如果所述cDNA中不含有序列表中序列7自5′末端起第924至1341位所示的DNA片段且不含有序列表中序列8自5′末端起第917至1167位所示的DNA片段、待测样本疑似不含有H5亚型AIV且疑似不含有N6亚型AIV。

本发明还保护所述引物对I。

本发明还保护所述引物对I的应用，为如下(h1)或(h2)∶

(h1)鉴定待测病毒是否为H5亚型AIV；

(h2)鉴定待测样本是否感染了H5亚型AIV。

本发明还保护含有所述引物对I的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)∶

(h1)鉴定待测病毒是否为H5亚型AIV；

(h2)鉴定待测样本是否感染了H5亚型AIV。

本发明还保护所述引物对II。

本发明还保护所述引物对II的应用，为如下(h3)或(h4)：

(h3)鉴定待测病毒是否为N6亚型AIV；

(h4)鉴定待测样本是否感染了N6亚型AIV。

本发明还保护含有所述引物对II的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(h3)或(h4)∶

(h3)鉴定待测病毒是否为N6亚型AIV；

(h4)鉴定待测样本是否感染了N6亚型AIV。

以上任一所述待测病毒具体可为H5N6亚型AIV、H5N2亚型AIV、H3N6亚型AIV、H4N6亚型AIV、H1N1亚型AIV、H2N3亚型AIV、H3N2亚型AIV、H4N5亚型AIV、H6N6亚型AIV、H7N9亚型AIV、H8N4亚型AIV、H9N2亚型AIV、H10N3亚型AIV、H11亚型AIV、H12N5亚型AIV、H13N6亚型AIV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)或传染性喉气管炎病毒(ILTV)。

以上任一所述PCR扩增的退火温度具体为55℃。

以上任一所述PCR扩增的反应体系中，引物组合中的各条引物的浓度如下：H5-F和H5-R的浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的浓度均为0.4pmol/μL。

以上任一所述PCR扩增的反应体系(25μL)具体可为：：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。

以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

本发明建立了H5亚型AIV和N6亚型AIV的二重PCR检测方法。对H5N6亚型AIV只需一管反应就可以快速鉴别，也可以把H5亚型和N6亚型单个感染鉴别出来，为快速诊断H5N6亚型AIV提供有力技术支撑。本研究构建的H5亚型AIV和N6亚型AIV的二重PCR检测方法具有特异性强，灵敏度高，快速便捷的特点，特异性试验和敏感性试验扩增条带与预期结果一致，为早期诊断和临床检测提供参考依据。

附图说明

图1为实施例2中的二重PCR扩增结果图。

图2为实施例4中特异性实验二重PCR结果图。

图3为实施例5中灵敏度实验二重PCR结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

PMD18-T载体：宝生物工程(大连)有限公司。

H1N1亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H1N1亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H2N3亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H2N3亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Mallard/Alberta/77(H2N3)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H3N2亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H3N2亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H3N6亚型AIV毒株：参考文献：刘婷婷，谢芝勋，宋德贵，等.H3亚型禽流感病毒的分离与鉴定[J].中国家禽，2015，37(19)：64-67.H3N6亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Pigeon/Guangxi/020P/2009(H3N6)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H4N５亚型AIV毒株：参考文献：Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al.A multiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus and differentiation of avian H5，H7and H9hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes，2006，20(3-4)：245-249.，H4N5亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“Duck/HK/668/79”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H4N6亚型AIV毒株：参考文献：Luo S，Xie Z，Xie L，et al.Reverse-transcription，loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal，2014，12(12)：1-7.，H4N6亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/070D/2010(H4N6)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H5N2亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H5N2亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Turkey/GA/209092/02(H５N2)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H6N6亚型AIV毒株：参考文献：Luo S，Xie Z，Xie L，et al.Reverse-transcription，loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal，2014，12(12)：1-7.，H6N6亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/duck/Guangxi/GXd-4/2009(H6N6)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H7N9亚型AIV RNA：参考文献：罗思思等；H7亚型和N9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立.畜牧兽医学报2015，46(7)：1176-1183.；H7N9亚型AIV RNA在参考文献中的名称为“H7N9RNA”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H8N4亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H8N4亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Turkey/Ontario/6118/67(H8N4)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H9N2亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H9N2亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/RX/09(H9N2)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H10N3亚型AIV毒株：参考文献：Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al.A multiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus and differentiation of avian H5.H7and H9hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes，2006，20(3-4)：245-249.，H10N3亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“Duck/HK/876/80”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H11亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H11亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Chicken/Guangxi/43C/09(H11)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H12N5亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H12N5亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Duck/Alberta/60/76(H12N5)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得

H13N6亚型AIV毒株：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，H13N6亚型AIV病毒株在参考文献中的名称为“A/Gull/MD/704/77(H13N6)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

新城疫病毒(NDV)：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，新城疫病毒(NDV)在参考文献中的名称为“Newcastle disease virus(Lasota)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

传染性支气管炎病毒(IBV)：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，传染性支气管炎病毒(IBV)在参考文献中的名称为“Infectious bronchitis virus(M41)”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

传染性喉气管炎病毒(ILTV)：参考文献：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal，2011，8(1)：1-10.，传染性喉气管炎病毒(ILTV)在参考文献中的名称为“Infectious Laryngotracheitis virus”；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物设计

进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定H5亚型AIV和N6亚型AIV的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定H5亚型AIV的一对引物和用于鉴定N6亚型AIV的一对引物。

用于鉴定H5亚型AIV的特异性引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

H5-F(序列表的序列1)：GGGCGATAAACTCTAGTATGCCA；

H5-R(序列表的序列2)：GTCCAGACATCTAGGAATCCGTC；

用于鉴定N6亚型AIV的特异性引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

N6-F(序列表的序列3)：CAATTGGAAGGGGGCAAATAGAC；

N6-R(序列表的序列4)：ACATTTCGTAGCCTGATCTGGAG；

用于鉴定H5亚型AIV的引物对命名为引物对I。

用于鉴定N6亚型AIV的引物对命名为引物对II。

引物组合由引物对I和引物对II组成。

实施例2、二重PCR反应条件优化

一、模板制备

1、提取H5N2亚型AIV的总RNA，反转录为cDNA。

2、提取H13N6亚型AIV的总RNA，反转录为cDNA。

3、以步骤1得到的cDNA为模板，采用引物HA-1和引物HA-2进行PCR扩增，得到扩增产物(序列表的序列7)，产物回收纯化后与PMD18-T载体连接，得到重组质粒PMD18-T-H5，浓度为10.9×10¹⁵拷贝/μL。

HA-1：5’-AGCAAAAGCAGGGG-3’；

HA-2：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；

4、以步骤2得到的cDNA为模板，采用引物NA-1和引物NA-2进行PCR扩增，得到扩增产物(序列表的序列8)，产物回收纯化后与PMD18-T载体连接，得到重组质粒PMD18-T-N6，浓度为10.1×10¹⁵拷贝/μL。

NA-1：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTGAAAATG-3’；

NA-2：5’-ATATCGTCTGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；

5、将重组质粒pMD18-T-H5和重组质粒pMD18-T-N6稀释成1.67×10¹⁰copy/μL，按照拷贝数1∶1比例混合，得到混合质粒DNA。

二、引物浓度优化

取步骤一得到的混合质粒DNA作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL(重组质粒PMD18-T-H5和重组质粒PMD18-T-N6均为1.67×10¹⁰copy/μL)，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。

设置不同的引物浓度，设置方法如表1所示，按照表1所示的2个因素设置36个处理组。

表1引物在反应体系中的浓度

二重PCR的反应程序：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

将二重PCR的扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

根据电泳结果，选择扩增效果最佳的引物浓度：H5-F和H5-R的优选浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的优选浓度均为0.4pmol/μL。

三、退火温度优化

取步骤一得到的模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL(重组质粒PMD18-T-H5和重组质粒PMD18-T-N6均为1.67×10¹⁰copy/μL)，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，H5-F和H5-R的浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的浓度均为0.4pmol/μL。

二重PCR的反应程序：94℃预变性3min；94℃30s、退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

分别设置如下退火温度：

退火温度I：52℃；

退火温度II：53℃；

退火温度IⅡ：54℃；

退火温度Ⅳ：55℃；

退火温度V：56℃；

退火温度VI：57℃；

退火温度VII：58℃；

将二重PCR的扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

根据电泳结果，选择扩增效果最佳的退火温度为55℃。

综合步骤二和步骤三，得到如下结论：二重PCR反应体系中，H5-F和H5-R的优选浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的优选浓度均为0.4pmol/μL；二重PCR的优选反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

四、优化条件验证

待测样本为：步骤一制备的重组质粒PMD18-T-H5和步骤一制备的重组质粒PMD18-T-N6。

1、将重组质粒PMD18-T-H5和重组质粒PMD18-T-N6分别稀释成1.67×10¹⁰拷贝/μL。

2、将重组质粒PMD18-T-H5和重组质粒PMD18-T-N6按照拷贝数1∶1比例混合，得到混合质粒DNA。

3、分别以步骤1的两个重组质粒DNA和步骤2的混合质粒DNA作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，H5-F和H5-R的浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的浓度均为0.4pmol/μL。设置用等体积水代替待测样本的阴性对照。

模板为步骤1的重组质粒PMD18-T-H5或重组质粒PMD18-T-N6时，1μL模板中重组质粒DNA的浓度为1.67×10¹⁰拷贝/μL。

模板为步骤2的混合质粒DNA时，1μL模板中混合质粒DNA的浓度为1.67×10¹⁰拷贝/μL。

二重PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

将二重PCR的扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

结果如图1所示。图1中，M为DL1000 DNA Maker，泳道1为阴性对照，泳道2为重组质粒PMD18-T-H5DNA的二重PCR的扩增产物，泳道3为重组质粒PMD18-T-N6DNA的二重PCR的扩增产物，泳道4为混合质粒DNA的二重PCR的扩增产物。使用二重PCR对H5N6亚型AIV扩增结果出现2条特异性条带(条带A：418bp和条带B：251bp)；对重组质粒PMD18-T-H5扩增结果出现1条特异性条带(条带A：418bp)；对重组质粒PMD18-T-N6扩增结果出现1条特异性条带(条带B：251bp)。将扩增产物测序，条带A对应的测序结果序列如序列5所示，条带B对应的测序结果序列如序列6所示。

实施例3、二重PCR检测方法建立

一、根据实施例2的条件优化结果，确立如下检测待测病毒的方法：

1、提取待测病毒的总RNA，并反转录成cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1的引物组合进行二重PCR扩增。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，H5-F和H5-R的浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的浓度均为0.4pmol/μL。

二重PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

3、将二重PCR的扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行判断，判断方法如下：

如果扩增产物中含有418bp的DNA片段和251bp的DNA片段，待测病毒为或候选为H5N6亚型AIV；

如果扩增产物中含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段，待测病毒为或候选为H5亚型且非N6亚型的AIV；

如果扩增产物中含有251bp的DNA片段且不含有418bp的DNA片段，待测病毒为或候选为N6亚型且非H5亚型的AIV；

如果扩增产物中不含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段，待测病毒为或候选为非N6亚型AIV且非H5亚型AIV的病毒。

二、根据实施例2的条件优化结果，确立如下检测待测样本的方法：

1、提取待测样本的总RNA，并反转录成cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1的引物组合进行二重PCR扩增。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，H5-F和H5-R的浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的浓度均为0.4pmol/μL。

二重PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

3、将二重PCR的扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行判断，判断方法如下：

如果扩增产物中含有418的DNA片段和251bp的DNA片段，待测样本为如下(1)或(2)：(1)疑似含有H5N6亚型AIV的待测样本；(2)疑似含有H5亚型AIV和N6亚型AIV的待测样本；

如果扩增产物中含有418bp的DNA片段且不含有251bp的DNA片段，待测样本疑似含有H5亚型且非N6亚型的AIV；

如果扩增产物中含有251bp的DNA片段且不含有418bp的DNA片段，待测样本疑似含有N6亚型且非H5亚型的AIV；

如果扩增产物中含有不含有418bp的DNA片段和251bp的DNA片段，待测样本疑似不含有H5亚型AIV且疑似不含有N6亚型AIV。

实施例4、特异性

待测样本为：H5N2亚型AIV毒株、H3N6亚型AIV毒株、H4N6亚型AIV毒株、H1N1亚型AIV毒株、H2N3亚型AIV毒株、H3N2亚型AIV毒株、H4N5亚型AIV毒株、H6N6亚型AIV毒株、H7N9亚型AIV RNA、H8N4亚型AIV毒株、H9N2亚型AIV毒株、H10N3亚型AIV毒株、H11亚型AIV毒株、H12N5亚型AIV毒株、H13N6亚型AIV毒株、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)。

1、提取待测样本的基因组DNA。待测样本分别为：传染性喉气管炎病毒(ILTV)。

2、提取待测样本的总RNA，并反转录成eDNA。待测样本分别为：H5N2亚型AIV毒株、H3N6亚型AIV毒株、H4N6亚型AIV毒株、H1N1亚型AIV毒株、H2N3亚型AIV毒株、H3N2亚型AIV毒株、H4N5亚型AIV毒株、H6N6亚型AIV毒株、H8N4亚型AIV毒株、H9N2亚型AIV毒株、H10N3亚型AIV毒株、H11亚型AIV毒株、H12N5亚型AIV毒株、H13N6亚型AIV毒株、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)。

3、将H7N9亚型AIV RNA反转录成cDNA。

4、分别将步骤1得到的基因组DNA样本、步骤2得到的各个cDNA样本和步骤3得到的cDNA作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，H5-F和H5-R的浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的浓度均为0.4pmol/μL。设置用H5N2亚型AIV毒株cDNA和H13N6亚型AIV毒株cDNA按照拷贝数1∶1比例混合的混合物代替待测样本的阳性对照A，设置用重组质粒PMD18-T-H5和重组质粒PMD18-T-N6按照拷贝数1∶1比例混合的混合物代替待测样本的阳性对照B。设置用等体积水代替待测样本的阴性对照。

模板为传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因组DNA时，1μL模板中的DNA含量为1078μg；

模板为H5N2亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1078μg；

模板为H3N6亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1067μg；

模板为H4N6亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1046μg；

模板为H1N1亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1055μg；

模板为H2N3亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1060μg；

模板为H3N2亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1054μg；

模板为H4N5亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1048μg；

模板为H6N6亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1068μg；

模板为H7N9亚型AIV的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1070μg；

模板为H8N4亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1056μg；

模板为H9N2亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1069μg；

模板为H10N3亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1060μg；

模板为H11亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1053μg；

模板为H12N5亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1063μg；

模板为H13N6亚型AIV毒株的cDNA时，1μL模板中的DNA含量为1065μg；

模板为新城疫病毒(NDV)的eDNA时，1μL模板中的DNA含量为1080μg；

模板为传染性支气管炎病毒(IBV)的cDNA时，1μL模板中的DNA含量1083μg。

二重PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

将二重PCR的扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳并拍照。

结果见图2。图2中，M为DL1000 DNA Maker，泳道1为阳性对照A二重PCR的扩增产物，泳道2为阳性对照B二重PCR的扩增产物，泳道3为H5N2亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道4为H3N6亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道5为H4N6亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道6为H1N1亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道7为H2N3亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道8为H3N2亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道9为H4N5亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道10为H6N6亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道11为H7N9亚型AIV cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道12为H8N4亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道13为H9N2亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道14为H10N3亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道15为H11型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道16为H12N5亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道17为H13N6亚型AIV毒株cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道18为新城疫病毒cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道19为传染性支气管炎病毒cDNA的二重PCR的扩增产物，泳道20为传染性喉气管炎病毒基因组DNA的二重PCR的扩增产物，泳道21为阴性对照结果表明，使用二重PCR对阳性对照A和阳性对照B扩增结果出现条特异性条带(418bp和251bp)；对H5N2亚型AIV扩增结果出现1条特异性条带(418bp)；对H3N6、H4N6、H6N6、H13N6亚型AIV扩增结果出现条特异性条带(251bp)，对其他亚型AIV和其他病毒及支原体扩增均未出现条带。

实施例5、灵敏度

1、按照实施例2的步骤一的方法制备混合质粒DNA。

2、用ddH₂O 10倍梯度稀释步骤1得到的混合质粒DNA，得到各个稀释液。

3、以步骤2得到的各稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

由于采用的稀释液不同，形成如下不同的反应体系：

反应体系1中，混合质粒DNA中每种质粒DNA的初始浓度为：2×10⁶拷贝/μL；

反应体系2中，混合质粒DNA中每种质粒DNA的初始浓度为：2×10⁵拷贝/μL；

反应体系3中，混合质粒DNA中每种质粒DNA的初始浓度为：2×10⁴拷贝/μL；

反应体系4中，混合质粒DNA中每种质粒DNA的初始浓度为：2×10³拷贝/μL；

反应体系5中，混合质粒DNA中每种质粒DNA的初始浓度为：2×10²拷贝/μL；

反应体系6中，混合质粒DNA中每种质粒DNA的初始浓度为：20拷贝/μL；

二重PCR的反应体系(25.0μL)：2×Easy Taq PCR 12.5μL，模板1μL，H5-F、H5-R各0.2μL，N6-F、N6-R各0.4μL，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，H5-F和H5-R的浓度均为0.2pmol/μL，N6-F和N6-R的浓度均为0.4pmol/μL。设置用等体积水代替待测样本的阴性对照。

二重PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃退火30s、72℃40s，进行35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。

将二重PCR的扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳并拍照。

结果见图3。图3中，M为DL1000 DNA Maker，泳道1-6依次对应采用反应体系1-7时二重PCR的扩增产物，泳道7为阴性对照。结果表明，使用二重PCR检测H5亚型的AIV和N6亚型的AIV时，检测所需的最低模板含量为2×10²个拷贝。