本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及闭花木酮Cleistanone衍生物、制备方法及其用途。
背景技术：
致病菌的扩散及其耐药性的增强严重威胁着人类的健康和生命，抗菌药物已作为常规用药广泛用于艾滋病、器官移植以及慢性消耗性疾病(如癌症、糖尿病、尿毒症等)的治疗，虽然目前临床上使用的抗菌药剂(如酮康唑、阿米卡星、庆大霉素、活力康唑、伊曲康唑、特比萘芬、二性霉素、氟康唑等)对皮肤及浅表部位感染的疗效较好，但这些抗菌药物的蓄积毒性较强，常常引起肝肾损伤、消化道刺激、头晕、过敏等，所以寻找作用机理独特的新型抗菌药物成为当今药物研发的热点之一。
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是一种革兰氏阴性螺旋状细菌。研究显示，幽门螺杆菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指肠溃疡的主要致病原因,并可能与胃癌和胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤发病有关。最近，世界卫生组织将Hp归为I类致癌物，它在胃癌发展中起主导作用。目前流行的治疗Hp感染的方案是同时服用质子泵抑制剂(PPI)加两种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)的三联疗法。影响三联疗法的最主要因素被认为是Hp对抗菌剂的耐药性；另一严重问题是质子泵抑制剂会诱发消化不良，大量抗菌剂则导致消化道内菌群的严重毁灭。因此，寻找高效、安全的抗Hp活性一类新药物成为一个重要和迫切的任务。
近年来全球结核病的发病呈增高趋势，据世界卫生组织(WHO)估计，目前全球受结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染的人口占世界人口的三分之一，其中5～10％的感染者成为结核病患者。我国每年出现活动性肺结核病人130万例，其中传染性肺结核约60万例，其中传染性肺结核约60万例，是全球结核病高负担国家之一。
自抗结核药物相继问世，使结核病的治疗起到划时代的变化。然而由于结核病患者的治疗管理尚不十分规范，不规则化疗，滥用抗结核药物，使结核病耐药情况日益严重，且耐药性的变化更趋向于多种药物同时耐药，这给结核病的防治工作造成极大困难。因此寻找新的抗结核药物，尤其是抗多药耐药性的抗结核药物对保护人民身体健康，具有重要意义。
从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物最有重要价值。
本发明涉及的化合物闭花木酮Cleistanone是一个2011年发表(VanTrinhThiThanhetal.,2011.Cleistanone:ATriterpenoidfromCleistanthusindochinensiswithaNewCarbonSkeleton.Volume2011,Issue22,pages4108–4111,August2011)的化合物，我们对化合物闭花木酮Cleistanone进行了结构修饰，获得了一个新的闭花木酮Cleistanone衍生物，并对其抗菌活性进行了评价，其具有抗菌活性。
技术实现要素：
本发明公开了一个闭花木酮Cleistanone衍生物，其结构为：
本发明闭花木酮Cleistanone衍生物(III)可通过下面方法制备：
(1)闭花木酮Cleistanone(I)与1,2-二溴乙烷反应得到闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)；
(2)闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)与二甲胺发生取代反应制得闭花木酮Cleistanone衍生物(III)。
进一步的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)的制备方法为：
(1)将440mg化合物闭花木酮Cleistanone(I)溶于10mL苯，向溶液中加入0.04g的四丁基溴化铵，3.760g的1,2-二溴乙烷和6mL的50％氢氧化钠溶液；混合物在25摄氏度搅拌24h；24h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液；然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅胶柱层析纯化，流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集黄色集中洗脱带即得到闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的黄色固体。
(2)将273mg的闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物溶于20mL乙腈当中，向其中加入345mg的无水碳酸钾，84mg的碘化钾和900mg的二甲胺，混合物加热回流16h；反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有机相；依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅胶柱层析纯化，流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集淡黄色集中洗脱带即得到闭花木酮Cleistanone衍生物(III)的淡黄色固体。
本发明公开的化合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
药效学实验表明，本发明的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)具有较好的抗菌作用。本发明的药学上可接受的盐与其化合物具有同样的药效。
进一步的，化合物III的体外实验表明，化学物III具有很强的抗人体真菌活性，因此本发明的化学物III有望被用于制备新型抗人体真菌药物。
进一步的，化合物III的体外实验表明，化合物III具有很强的抗幽门螺旋杆菌活性，说明对于与幽门螺旋杆菌密切相关的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病来讲，化合物III是一个极具开发潜力的化合物。它可直接用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。
进一步的，化合物III的体外实验表明，化合物III具有很强的抑制大肠杆菌、荧光假单孢菌、金黄色葡萄球、变形杆菌、新生隐球菌的作用，所以化合物III可作为具有抗细菌作用的化合物，并有望在制备抗细菌药物中得到应用。
进一步的，根据初步试验的结果，本发明用固体培养基稀释法测定了该化合物对卡介苗、结核分枝杆菌标准株H37Rv株和耐多药结核分枝杆菌(MDRMTB)三种结核菌的最小抑菌浓度，实验结果证实化合物III具有很强的抗结核菌和抗耐药性结核菌活性，可作为治疗结核菌感染疾病的先导化合物，也可用于制备治疗结核病药物。
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。具体实施方式
实施例1化合物闭花木酮Cleistanone的制备
化合物Cleistanone(I)的制备方法参照VanTrinhThiThanh等人发表的文献(VanTrinhThiThanhetal.,2011.Cleistanone:ATriterpenoidfromCleistanthusindochinensiswithaNewCarbonSkeleton.Volume2011,Issue22,pages4108–4111,August2011)的方法。
实施例2闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的合成
将化合物I(440mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化铵(TBAB)(0.04g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氢氧化钠溶液。混合物在25摄氏度搅拌24h。24h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液。然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集黄色集中洗脱带即得到化合物II的黄色固体(344mg，63％)。
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.04(s,1H),4.82(s,1H),3.94(d,J＝26.5Hz,1H),3.87(d,J＝26.5Hz,2H),3.57(s,2H),2.40(d,J＝14.0Hz,1H),2.39(d,J＝14.0Hz,1H),2.27(s,1H),2.21(s,1H),2.15(s,1H),1.82(s,1H),1.62(s,2H),1.57(d,J＝3.3Hz,1H),1.54(d,J＝3.3Hz,1H),1.50(d,J＝1.2Hz,1H),1.47(d,J＝1.2Hz,1H),1.39(d,J＝15.3Hz,2H),1.34(d,J＝15.3Hz,1H),1.26(dd,J＝32.6,13.7Hz,4H),1.13(d,J＝18.0Hz,2H),1.05(s,6H),0.98(s,1H),0.88(s,12H),0.78(s,3H),0.74(s,1H)。
13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.63(s),69.85(s),59.71(s),52.55(s),51.21(s),47.92(s),44.10(s),42.25(s),41.73(s),40.64(s),40.16(s),38.88(s),38.65(s),37.21(s),36.23(s),33.34(d,J＝1.1Hz),32.96(s),29.91(s),27.18(s),26.03(s),24.23(s),23.96(s),20.77(s),18.48(s),17.98(s),16.93(s)。
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcdforC32H52BrO2:547.3151；found547.3159.
实施例3闭花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)的合成
将化合物II(273mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(345mg，2.5mmol)，碘化钾(84mg，0.5mmol)和二甲胺(900mg，20mmol)，混合物加热回流16h。反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有机相。依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集淡黄色集中洗脱带即得到化合物III的淡黄色固体(160.7mg,61％)。
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.02(s,1H),4.81(s,1H),3.85(s,1H),3.51(s,2H),2.84(s,6H),2.64(s,2H),2.38(d,J＝13.0Hz,2H),2.26(s,1H),2.17(s,1H),2.17(s,1H),1.83(s,1H),1.66(s,2H),1.54(d,J＝6.0Hz,2H),1.46(d,J＝0.9Hz,2H),1.34(d,J＝13.5Hz,3H),1.26(dd,J＝31.1,13.9Hz,4H),1.16(d,J＝13.5Hz,2H),1.07(s,6H),0.98(s,1H),0.85(s,12H),0.76(s,3H),0.73(s,1H).
13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.60(s),154.51(s),105.19(s),74.62(s),65.68(s),59.75(s),57.63(s),52.57(s),51.18(s),47.87(s),45.54(s),44.12(s),42.29(s),41.79(s),40.62(s),40.12(s),38.82(s),38.67(s),37.25(s),36.29(s),33.32(s),32.92(s),29.85(s),27.20(s),26.07(s),24.29(s),23.94(s),20.73(s),18.42(s),18.00(s),16.97(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcdforC34H58NO2:512.4468；found:512.4463。
实施例4本发明所涉及化合物II和III片剂的制备
取20克化合物II或者III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。
实施例5本发明所涉及化合物II和III胶囊的制备：
取20克化合物II或者III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000粒。
实施例6闭花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)抗人体真菌活性
抗人体真菌活性实验是采用浓度稀释的方法，每次测定重复三次，测试的病原菌有红色毛癣菌、羊毛状小孢子菌和断发癣菌，菌液浓度为105个/mL。闭花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)起始浓度为50.00μg/mL(5％二甲基亚砜DMSO)，梯度稀释至0.10μg/mL，等量体积的菌液和测试样品混合培养在96孔板中(形成的最终浓度有：25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10和0.05μg/mL)，人体真菌培养温度分别为28℃，培养时间24h后观察，若发现没有菌落形成的处理孔中最低的那个浓度为样品最低抗菌浓度，即MIC值。该实验阳性对照为酮康唑，化学物III抗人体真菌结果见表1。
表1化学物III抗人体真菌MIC值(μg/mL)
结论：化学物III具有很强的抗人体真菌活性，因此本发明的化学物III有望被用于制备新型抗人体真菌药物。
实施例7化合物III抗幽门螺杆菌活性
1)供试菌株
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)标准菌株ATCC43504购于美国菌种保存中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)。13株Hp临床菌株采自南京市鼓楼医院胃镜室接受胃镜检查的患者；在连续胃镜检查中对消化性溃疡、十二指肠球炎或疣状胃炎的患者，先经快速尿素酶实验确定为Hp阳性者，再取胃窦黏膜1-2块，切碎后接种于含8％马血清、三甲氧苄氨嘧啶(trimethropin,TMP)1.25g/L、多粘菌素(polymyxin)B2500U/L、万古霉素(vancomycin)10mg/L的Columbia选择性琼脂培养基中，于37℃在微氧环境下(5％O2,10％CO2和85％N2)培养72小时。收集细菌，经涂片革兰氏染色，氧化酶、触酶和尿素酶鉴定为阳性后，传代纯培养，所得菌株作为实验菌株。
2)菌株培养
我们采用微需氧袋(购自上海医科大学)进行HP的菌株培养，它可通过化学反应产生Hp所需要的微需氧环境。
3)生物活性测定
采用纸片法(Microbiologicalpapermethod)测定化合物对幽门螺杆菌的抑制作用，用琼脂稀释法来测定供试样品的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)。
I.纸片法实验
(A)准备培养基将配制好的Columbia培养基经高压蒸汽灭菌后，冷却至50-60℃，加8％马血清或绵羊血，混匀倾注于已经灭菌的培养皿中，每皿7-10ml，培养基厚度为1.5mm(无菌操作)。
(B)转接实验菌(涂菌)用微量取样器取稀释好的108CFU/ml(1OD660＝108CFU/ml)Hp的菌悬液0.1ml均匀地涂抹在适宜的培养皿表面。倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使琼脂表面干燥，备用。
(C)贴样品纸片用微量取样器取6μl待测样品(质量浓度2mg/ml)注入已经灭菌的圆滤纸片上。用无菌镊子镊取含样品的纸片和对照空白纸片，按无菌操作分别纸片紧贴于含菌琼脂表面，每隔一定距离贴一张纸片。每种菌做3皿，所得结果求其平均值。
(D)培养将各平皿置于微需氧袋中，封口，打开气体发生器，再置于37℃培养箱中培养72h。
(E)测抑菌圈直径取出平板后，分别测量各纸片周围抑菌圈直径的大小。参照对照组的结果，可得出待测样品敏感实验的结果。重复三次。
II.琼脂稀释法测定MIC
(A)药物平板的制备首先将测试的化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶液配制成0.5mg/ml的母液，再用无菌水稀释，最终配成100.0，80.0，60.0，45.0，40.0，35.0，30.0，25.0，20.0，15.0，10.0，5.0和2.5μg/ml的浓度系列，DMSO在介质中的浓度小于1％。将1ml配制好的测试化合物溶液与保温于50℃的8ml哥伦比亚培养基，另加1ml保温于50℃的马血清充分混匀，浇制入培养皿中冷却即成(培养皿中化学物的终浓度为10.0，8.0，6.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5和0.25μg/ml，如果有抑菌作用，则MIC值即这些值当中的一个)。
(B)转接实验菌(涂菌)用微量取样器吸取稀释好的1×108CFU/mlHp的菌悬液0.1ml均匀地涂抹在培养皿表面，倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使琼脂表面干燥，备用。
(C)确定MIC将待测培养皿在微需氧袋(含：85％N2,10％CO2和5％O2)中，保温37℃貈籣:g遱鴵培养72小时，观察Hp生长情况，与空白组相对照，以完全没有菌生长的样品最低浓度为最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)值。阳性对照为氨苄西林(Ampicillin)。
实验结果
体外实验表明，化学物III具有很强的抗幽门螺旋杆菌活性，纸片法显示其抑菌圈直径为18mm(ATCC43504)。用琼脂稀释法显示它能完全抑制5个随机的临床菌株和1个标准菌株(ATCC43504)的生长，最小抑菌浓度(MIC)均为2.5μg/ml。用氨苄西林作阳性对照，其对6株测试菌完全抑制的最小浓度(MIC)为1.5μg/ml。
结论：化学物III具有较强的抑制幽门螺旋杆菌活性，说明对于与幽门螺旋杆菌密切相关的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病来讲，化学物III是一个极具开发潜力的化合物。它可直接用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。
实施例8化学物III抗细菌活性
抗菌活性实验是采用浓度稀释的方法，每次测定重复三次，测试病原菌有大肠杆菌、荧光假单孢菌、金黄色葡萄球、变形杆菌、新生隐球菌，菌液浓度为105个/mL。化合物III起始浓度为50.00μg/mL(5％二甲基亚砜DMSO)，梯度稀释至0.10μg/mL，等量体积的菌液和测试样品混合培养在96孔板中(形成的最终浓度有：25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10和0.05μg/mL)，细菌培养温度分别为37℃，培养时间24h后观察，若发现没有菌落形成的处理孔中最低的那个浓度为样品最低抗菌浓度，即MIC值。化合物III抗菌结果见表2。
表2化合物III抗细菌MIC值(μg/mL)
结论：化合物III具有很强的抗细菌活性，因此本发明的化合物III有望被用于制备新型抗细菌药物。
实施例9化合物III抗结核菌活性
(1)固体培养基稀释法测定化合物III抗卡介苗(BCG)绝对浓度
从斜面上刮取卡介苗培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于漩涡振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.1)比浊，即配成1mg/ml的卡介苗(BCG)菌悬液。
将化合物III用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的化合物III按所需剂量加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟、冷却至50～55℃)，混匀，制成含化合物III，浓度分别为6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等浓度的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的卡介苗(BCG)菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含化合物III系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表3所示。
本实施例中所用Middlebrook7H9肉汤培养基和Middlebrook7H11琼脂培养基为本领域技术人员进行结核菌培养时的常用培养基，其配方采用常规配方即可。
(2)固体培养基稀释法测定化合物III抗结核分枝杆菌标准株H37Rv株绝对浓度
从斜面上刮取结核分枝杆菌标准株H37Rv株培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于漩涡振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.1)比浊，即配成1mg/ml的H37Rv株菌悬液。
将化合物III分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的化合物III按所需剂量加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟、冷却至50～55℃)，混匀，制成含化合物III，浓度分别为6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等浓度的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的H37Rv株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含化合物III系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表3所示。
(3)固体培养基稀释法测定化合物III抗结核分支杆菌临床分离耐ISREMTB株绝对浓度
从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株(耐异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇结核分枝杆菌临床分离柱)培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于漩涡振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.1)比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。
将化合物III分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的化合物III按所需剂量加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟、冷却至50～55℃)，混匀，制成含化合物III，浓度分别为6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等浓度的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含化合物III系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表3所示。
表3固体培养基稀释法测定化合物III抗结核菌绝对浓度结果
结论：化合物III具有很强的抗结核菌和抗耐药性结核菌活性，可作为治疗结核菌感染疾病的先导化合物，也可用于制备治疗结核病药物。