降低发酵饮料中的H2S水平的组合物和方法与流程
本申请要求2007年3月16日提交的美国临时专利申请60/918,616，2007年7月12日提交的美国临时专利申请60/959,366的优先权，这两份申请的内容被纳入本文作为参考，用于所有目的。
对于联邦资助下研发所得发明的权利的声明
无。
发明背景
在酒精发酵期间产生挥发性的含硫化合物如硫化氢(H2S)是困扰酿造和酿酒工业的一个问题。硫化氢(H2S)是硫酸盐还原途径中的不良副产品(图1)。在发酵条件下，由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)形成。酿酒酵母菌株的H2S产量为0ug/L至290ug/L，远高于11ng/L的人类察觉阈值(Amoore和Hautala 1983)。它的不良属性是由于它给酒类带来臭鸡蛋气味的特性，并且虽然H2S是挥发性化合物并可通过通气去除，但它可能形成硫醇，因低pH而在酒中长期存在(Thoukis1962)。硫醇产生洋葱或罐装蔬菜的气味，挥发性H2S可控制时，去除其他不良的含硫化合物在技术上很困难，并且会同时去除酒中的其他调味化合物。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)形成硫化氢是葡萄酒、啤酒和清酒工业中熟知的问题(Acree等1972，Eschenbruch等，1978，Giudici和Kunkee 1994，Jiranek等，1995，Rauhut和Kurbel 1994，Walker和Simpson 1993)。营养因素例如氮、维生素和辅因子的水平(Giudici和Kunkee 1994，Jiranek等，1995)以及环境因素如温度、pH、元素硫水平(Rauhut和Kurbel 1994)、存在二氧化硫(Stratford和Rose1985)、含硫有机物的水平(Acree等，1972)均与发酵饮料中挥发性含硫化合物的产量相关联。挥发性含硫化合物产量的差异也可归因于酵母菌株代谢的差异(Acree等，1972，Spiropoulos等，2000)。
在硫化氢形成方面，至少存在六种不同类型的酵母菌株特性：1)在所有条件下水平升高；2)在所有条件下水平低；3)氮阈值水平以下或以上时产量增加；在氮水平‘窗口’中，产量降低，氮水平在该窗口以上或以下时硫化物增加；4)不考虑氮含量，限制微量元素养分水平时产量升高；5)氮和微量元素养分受限时，硫化物产量升高；和6)随着发酵速率升高硫化物产量升高，这可能与发酵速率和二氧化碳发生或者一些其他因素如热产量升高有关(Spiropoulos 2000，Jiranek 1995，Giudici 1994，Linderholm 2006)。
去除酒中硫化物的现有方法是铜澄清。加入铜可导致催化发生有害的组成改变，并增加酿酒厂产生的需要特殊处理的废料量，最终导致酿酒厂成本升高、消费者的酒类消费成本升高。另外，将铜用作澄清剂可导致酒中铜残留水平过高。贸易税务局允许的酒中铜残留水平为0.5mg/L(参见例如，万维网址regulations.justia.com/view/89060/)。因而，使用铜去除硫化氢的酿酒厂必须采取某些方式来降低酒中的铜水平。鉴于与铜摄入过量有关的不良健康影响，特别是诸如阿尔茨海默病等神经疾病，世界卫生组织推荐限制将该化合物用于食品(参见万维网址who.int/water_sanitation_health/dwq/chemicals/copper.pdf)。可获得不产生硫化氢或产生的硫化氢水平较低的市售酵母株就不需要用铜处理酒类。
因此，本领域需要降低发酵饮料中的H2S水平的组合物和方法。本发明满足了这些和其他需要。
发明概述
本发明提供降低发酵饮料中的H2S水平的组合物和方法。
本发明一方面提供降低或消除发酵产品或培养基中的H2S水平的方法。在一些实施方式中，该方法包括使发酵产物或培养基与包含编码修饰的MET10多肽的多核苷酸的酵母株、酵母细胞或酵母培养物相接触，MET10多肽不会催化由亚硫酸盐释放游离的硫化氢(即“硫化物惰性的”MET10多肽)，其中MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:3的MET10多肽，其中662位上的X不是苏氨酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1。
对于硫化物惰性MET10多肽的具体实例，在一些实施方式中，MET10多肽662位上的氨基酸残基不是苏氨酸或丝氨酸。在一些实施方式中，MET10多肽662位上的氨基酸残基是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr(SEQ ID NO:3)。在一些实施方式中，MET10多肽662位上的氨基酸残基是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp或Tyr(SEQ ID NO:5)。在一些实施方式中，662位的氨基酸残基选自：Lys、Arg、His、Gln和Asn(SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，662位上的氨基酸残基是Lys(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方式中，所述硫化物惰性MET10多肽或MET10多核苷酸是酵母MET10。在一些实施方式中，所述硫化物惰性MET10多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的MET10共有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，其中662位上的X如上文和本文所述。在一些实施方式中，编码硫化物惰性MET10多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:1共有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。
在一些实施方式中，该酵母细胞也不表达能够将亚硫酸盐转化成硫化物的硫化物活性MET10多肽。在一些实施方式中，所述发酵产物是葡萄酒、啤酒或香槟。在一些实施方式中，所述发酵培养基可选自下组：果汁(如葡萄汁)和麦芽汁。
对于酵母细胞的实例，在一些实施方式中，所述酵母株可以是酿酒酵母菌株。在一些实施方式中，所述酵母株可以是用于制造啤酒或葡萄酒的任何市售菌株，如本文所述。亲本菌株或原始菌株常常是产生硫化氢的菌株，用编码硫化物惰性MET10多肽的核酸代替编码硫化物活性MET10多肽的核酸后变成不产生硫化氢的菌株。酿酒酵母葡萄酒菌株的例子包括但不限于二次发酵菌株(Prise de Mousse)、一级特酿菌株(Premier Cuveé)、法国红菌株(French Red)、蒙他榭菌株(Montachet)、拉尔孟(Lallemand)K1菌株、波尔多菌株(Bordeaux)、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19和Bb22。酵母细胞的其他实例如本文所述。
本发明另一方面提供分离的多核苷酸，其包含编码不催化亚硫酸盐转化成硫化物的MET10多肽的核酸序列，其中MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸。在一些实施方式中，MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸(SEQ ID NO:5)。该多核苷酸编码的所述硫化物惰性MET10多肽的实例如上文和本文所述。在一些实施方式中，编码硫化物惰性MET10多肽的分离多核苷酸与SEQ ID NO:1共有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性。在一些实施方式中，所述分离多核苷酸包含SEQ ID NO:1提供的核酸序列或其互补序列。
在相关方面，本发明提供包含编码不催化亚硫酸盐转化成硫化物的MET10多肽的多核苷酸的表达盒和表达载体，其中MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸(SEQ ID NO:3)，该多核苷酸操作性连接于表达控制序列。所述硫化物惰性MET10多肽的其他实施方式如上文和本文所述。另外还提供包含所述表达载体或表达盒的宿主细胞。该宿主细胞可以是酵母细胞，例如，酿酒酵母细胞。酵母细胞的其他实例如上文和本文所述。在一些实施方式中，所述表达盒或表达载体包含启动酵母细胞表达的启动子。
在相关方面，本发明提供不产生可检测水平的硫化氢或产生低水平硫化氢的改进酵母细胞，所述改进细胞包含编码不催化亚硫酸盐转化为硫化物的MET10多肽的外源多核苷酸，其中MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸(SEQ ID NO:3)，其中所述改进酵母细胞的亲本细胞产生硫化氢。在一些实施方式中，MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸(SEQ ID NO:5)。所述硫化物惰性MET10多肽和酵母细胞的其他实施方式如上文和本文所述。
另一方面，本发明提供产生低水平硫化氢或不产生可检测的硫化氢的改进酵母细胞培养物，所述改进培养物包含酵母细胞群，所述酵母细胞包含编码不催化亚硫酸盐转化为硫化物的MET10多肽的外源多核苷酸，其中MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸(SEQ ID NO:3)，其中与亲本细胞培养物相比，所述改进酵母细胞培养物不产生或产生低水平的硫化氢。在一些实施方式中，MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸(SEQ ID NO:5)。所述硫化物惰性MET10多肽和酵母细胞的其他实例如上文和本文所述。
在另一方面，本发明提供产生不产生可检测水平的硫化氢的改进酵母细胞的方法，所述方法包括将编码不催化亚硫酸盐转化为硫化物的硫化物惰性MET10多肽的外源性多核苷酸引入改进酵母细胞的亲本细胞，以便用编码硫化物惰性MET10多肽的核酸代替编码硫化物活性MET10多肽的内源性核酸，其中硫化物惰性MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸(SEQ ID NO:3)，改进酵母细胞的亲本细胞产生硫化氢。在一些实施方式中，MET10多肽662位上的氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸(SEQ ID NO:5)。在一些实施方式中，编码所述硫化物惰性MET10多肽的核酸通过重组方式引入。在一些实施方式中，编码所述硫化物惰性MET10多肽的核酸通过回交引入。所述硫化物惰性MET10多肽和酵母细胞的其他实施方式如上文和本文所述。
在另一方面，本发明提供硫化氢水平检测不到或硫化氢，或其残留物水平低的发酵产物，如葡萄酒、啤酒、香槟，其中所述发酵产物按照本文所述方法产生。
本发明的另一个实施方式提供能够区别SEQ ID NO:1提供的序列或其互补序列与编码野生型MET10的核酸的分离多核苷酸、包含操作性连接于表达控制序列的该多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的宿主细胞(如酿酒酵母细胞)。
本发明的另一个实施方式提供在SEQ ID NO:1中包含一个或多个取代(如至少两个、三个、四个或更多个取代)的分离多核苷酸，其中所述一个或多个取代选自：404位上A→C、514位上A→G、1278位上A→G、1532位上C→T、1768位上G→A和1985位上A→C，还提供包含操作性连接于表达控制序列的该多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的宿主细胞(如，酿酒酵母细胞)。
本发明还有另一个实施方式提供在SEQ ID NO:2中包含一个或多个取代(如至少两个、三个、四个或更多个取代)的分离多核苷酸，其中所述一个或多个取代选自：404位上C→A、514位上G→A、1278位上G→A、1532位上T→C、1768位上A→G和1985位上C→A，还提供包含操作性连接于表达控制序列的该多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的宿主细胞(如，酿酒酵母细胞)。
附图简要说明
图1说明硫酸盐还原途径。对基因进行的序列分析用粗体表示，发现的等位基因的数目标在()中，UCD932中发现的等位基因用虚线标出。
图2A-2Z列出各种酵母菌株中MET10等位基因的序列比对(分别是SEQ ID NO：8、9、1、10-14、2、15和16)。导致密码子改变的核酸改变突出显示。
图3说明示范性的基因交换技术。MET10S＝S288C等位基因。MET10W＝葡萄酒菌株等位基因。
图4说明各种酵母菌株中MET10基因的氨基酸序列比对(S288C＝SEQ ID NO:17；UCD932＝SEQ ID NO:18；UCD950＝SEQ ID NO:19)。突出显示不同菌株之间的氨基酸差异。
图5说明MET10蛋白中残基662周围的氨基酸改变。在核苷酸1985附近比对S288C(SEQ ID NO:20)、UCD932(SEQ ID NO:21)和UCD950(SEQ ID NO:20)的MET10等位基因的DNA序列，关键突变用粗体突出显示。框中显示密码子(SEQ ID NO:22和23)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO:24)(用浅灰色突出显示)。由C至A的改变导致该蛋白662位上由苏氨酸残基相应改变为赖氨酸。
图6说明相对于已知和预测的MET10蛋白的功能区，662号氨基酸残基的位置。对MET10蛋白质中已知的基序和结构域作图。用黑色箭头标出662位上改变的碱基的位置。该突变出现在该蛋白的亚硫酸盐还原酶结构域中。数据来自万维网址//db.yeastgenome.org/cgi-bin/protein/domainPage.pl？dbid＝S000001926。
图7说明亚硫酸盐还原酶结构域的结构特征，并说明苏氨酸残基改变为赖氨酸对该蛋白的结构特征的影响。根据结构同源性预测，绘制MET10蛋白的结构带模型。只显示了从赖氨酸633至酪氨酸1035的预测的亚硫酸盐还原酶结构域，其中残基662周围区域在框中放大。UCD932的预测结构(图A)突出显示残基662上的赖氨酸，而UCD950的预测结构(图B)突出显示残基662上的苏氨酸。
图8显示了来自一些工业相关酵母株(UCD 932Met10＝SEQ ID NO:25；S288c Met10＝SEQ ID NO:26；酿酒酵母(carlsbergensis)＝SEQ ID NO:27；乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)＝SEQ ID NO：28；解脂耶氏酵母(Yarowwia lipolytica)＝SEQ ID NO:29；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)＝SEQ ID NO：30)的MET10蛋白子序列的比对，它们的亚硫酸盐还原酶催化区域中的序列已知。在全部比对的菌株中保守的氨基酸残基用粗体显示。在大部分相关菌株中保守的氨基酸残基用阴影表示。在所有比对的酵母株的活性MET10多肽中，662位或(N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L)(SEQ ID NO:31)基序中的苏氨酸保守。
表格简要说明
表1是天然和工业酵母株的列表。
表2列出改进的三M(MMM)培养基的组成。
表3列出在BiGGY平板和MMM上培养的天然酵母分离物的分析结果。
表4列出其他酵母株。
表5列出用于扩增MET10等的PCR引物的序列。
表6列出用于MET10等的测序引物的序列。
表7总结了用MET10转化的酵母株的H2S产量的结果。
表8列出MET10等位基因的氨基酸差异。
表9总结了用MET10转化的其他酵母株的H2S产量的结果。
表10总结了用MET10转化的酵母株的H2S产量的结果。
表11总结了用MET10等位基因转化的酵母株的H2S产量的结果。
发明详述
I.引言
本发明提供降低发酵饮料中的H2S水平的组合物和方法。本发明部分基于以下发现：662位上的氨基酸残基不是苏氨酸的MET10多肽不催化亚硫酸盐转化成游离或释放的硫化氢。例如，在酵母株UCD932中(其中MET10基因的1985位上发生单个核苷酸改变)由MET10等位基因表达硫化物惰性MET10多肽导致MET10蛋白的催化域中662位上的氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸。
II.定义
除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。核酸和肽的合成采用标准技术。通常、按照生产商说明书进行酶反应和纯化步骤。通常按照本领域和各种参考文献中的常规方法进行这些技术和步骤(总地参见，Sambrook和Russell，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press2001))；Ausubel，等编，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰韦利父子出版公司(John Wiley&Sons)1987-2008))，它们可用于本申请的任何地方。本文所用的命名以及下述分析化学和有机合成中的实验室步骤均为本领域熟知且常用的。化学合成和化学分析采用标准技术或其变型。
本文所用术语“发酵培养基”指加入酵母之前的未发酵混合物。发酵培养基包括例如，果汁和麦芽汁。发酵培养基还可包含其他糖源(如蜂蜜、甘蔗糖、甜菜糖、玉米糖、果糖、蔗糖或葡萄糖)；酸(如柠檬酸、苹果酸、酒石酸和它们的混合物)和酵母营养物(如磷酸二铵或另一种氮源，维生素等)。
本文所用术语“果汁”指通过捣碎果实产生的果汁、茎段、果皮、种子和/或果肉的混合物。可使用含有可发酵糖的任何果实，例如，葡萄、苹果、樱桃、桃、油桃、李子、杏、梨、柿、菠萝、芒果、猕猴桃、草莓、树莓、蓝莓、接骨木果、黑莓、越桔、无花果和枇杷。在捣碎之前，果实可以是干燥过、煮沸过、踏成浆或加工过。果汁可包含两种或更多种果实。
本文所用术语“麦芽汁”指捣碎谷粒和/或谷壳产生的未发酵液体。可使用含有可发酵糖的任何谷物，例如，大麦、小麦、黑麦、大麦、水稻、玉米和燕麦。在捣碎之前，谷物可以是焙烤过、晒过或加工过。麦芽汁可由包含两种或更多种谷物的混合物产生。
本文所用的“Met10”和“MET10”指酵母(Saccharomyces)的同化作用亚硫酸盐还原酶的α亚基。MET10多肽的功能是催化亚硫酸盐转化为硫化物。MET10多肽，特别是酵母MET10多肽的结构已被鉴定。MET10多肽的C末端部分含有保守的亚硫酸盐还原酶催化域，还含有FAD和NAD结合域。该多肽的中间部分含有丙酮酸-铁氧化还原蛋白氧化还原酶结构域。在能够催化亚硫酸盐转变为游离或释放的硫化氢的硫化物活性MET10多肽中，662位上的氨基酸残基是保守的，通常是苏氨酸，有时(特别是酵母中)是丝氨酸。图6描述了经鉴定的MET10多肽结构域。
本文所用的“MET10”指核酸和多肽的多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物，它们：(1)具有优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域上或者在全长上，与MET10核酸编码的参比氨基酸序列(酵母MET10核酸序列参见例如SEQ ID NO：1，图2，和以下示范性GenBank登录号)的氨基酸序列相同性高于约80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列；(2)结合抗体，如用包含MET10多肽的氨基酸序列(如SEQ ID NO：1编码)的免疫原产生的多克隆抗体和其保守修饰变体；(3)在严谨条件下与对应于编码MET10蛋白的核酸序列的反义链和其互补修饰变体特异性杂交；(4)具有优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸上或者在全长上，与MET10参比核酸序列的核苷酸序列相同性高于约95％，优选高于约96％、97％、98％、99％或更高的核酸序列。本发明的核酸和蛋白质包括天然产生的或重组的分子。在一些实施方式中，MET10多肽和MET10多核苷酸来自酵母。示范性的MET10氨基酸和核酸序列参见Genbank登录号EF058164、EF058165、EF058166、EF058167、EF058168、EF058169、EF058170、EF058171、EF058172、EF058173。
本文所用的“硫化物活性MET10”多肽能够催化亚硫酸盐转化为硫化氢。在酵母中，硫化物活性MET10多肽可能在氨基酸位置662上具有丝氨酸或苏氨酸残基。在酵母株中，酿酒酵母中662位的氨基酸是保守的，是苏氨酸或丝氨酸，并且存留在亚硫酸盐还原酶催化区的下述基序中。(N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L)(SEQ ID NO:31)。参见图8。
本文所用的“硫化物惰性MET10”多肽不能催化亚硫酸盐转化成游离或释放的硫化氢。在酵母中，硫化物惰性MET10多肽在氨基酸位置662或基序(N/K)(R/K)R(V/L)XP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L)(SEQ ID NO:32)中不具有苏氨酸，即X不是T。在一些实施方式中，硫化物惰性MET10多肽在氨基酸位置662处不具有苏氨酸或丝氨酸残基。在一些实施方式中，所述硫化物惰性MET10多肽在662位上具有Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr(SEQ ID NO:3)。在一些实施方式中，硫化物惰性MET10多肽中662位上的氨基酸残基不具有羟基，例如，不是Thr、Ser或Tyr(SEQ ID NO:33)。在一些实施方式中，硫化物惰性MET10多肽中662位的氨基酸残基是大氨基酸或大型氨基酸，例如Lys、Arg、His、Gln、Asn、Glu、Asp、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr或Trp(SEQ ID NO:34)。在一些实施方式中，硫化物惰性MET10多肽中662位的氨基酸残基是碱性或带正电的氨基酸，例如Lys、Arg、His、Gln或Asn(SEQ ID O:6)。在一些实施方式中，662位上的氨基酸残基是Lys(SEQ ID NO:7)。
将本文所述的“外源性”MET10核酸序列或氨基酸序列人工引入亲本酵母细胞或亲本酵母株。可通过本领域已知的任何方式，包括重组方法和静电的酵母育种方法(例如回交)将外源性核酸序列或外源性氨基酸序列引入酵母细胞。
在本文中术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，它们指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它们的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成、天然产生的和非天然产生的，它们与参比核酸的结合特性类似，它们与参比核苷酸的代谢方式类似。这类类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有说明，具体核酸序列也包括其保守修饰变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体说，可通过产生一个或多个选择的(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列获得简并密码子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。
本文所用的“能够区别”的核酸指多核苷酸(1)在严谨杂交条件下，特异性杂交于对应于编码MET10蛋白的核酸序列的反义链和其保守修饰变体；或(2)具有优选在至少约25，50，100，200，500，1000或更多核苷酸的区域上，与MET10核酸的核苷酸序列相同性高于约80％、85％、90％、95％、优选高于约96％、97％、98％、99％或更高的核酸序列。
术语“严谨杂交条件”指探针与其目标子序列(通常在核酸的复杂混合物中)杂交，但不与其他序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广泛指南参见Tijssen，《生物化学和分子生物学技术—与核酸探针杂交》(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes)，“核酸测定的杂交原理和方案概览”(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays)(1993)。通常，选择的严谨条件比特定序列在确定离子强度、pH下的解链点I低约5-10℃。Tm是50％靶点互补探针与靶序列杂交平衡时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)(靶序列过量，在Tm时50％探针被平衡地占据)。严谨条件是盐浓度小于约1.0M钠离子，一般约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH 7.0至8.3，对短探针(例如，10-50个核苷酸)而言温度至少约为30℃、对长探针(例如大于50个核苷酸)而言至少约60℃的条件。也可加入去稳定剂，如甲酰胺获得严谨条件。在选择性或特异性杂交中，阳性信号至少是背景杂交信号的两倍，任选10倍。示范性的严谨杂交条件可以如下所述：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，42℃培育，或者5x SSC、1％SDS、65℃培育，用0.2x SSC和0.1％SDS在65℃洗涤。
如果编码的多肽基本相同，那么在严谨条件下不相互杂交的核酸仍然基本相同。例如，用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，可能发生这种情况。在这种情况下，核酸一般在中等严谨的杂交条件下杂交。示范性“中等严谨杂交条件”包括37℃，在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，45℃，1X SSC洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域普通技术人员不难认识到，可利用其他杂交和洗涤条件提供类似严谨性的条件。
术语“分离”、“纯化”或“生物纯”指实质上或基本上不含通常与其天然状态伴随的组分的物质。一般用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定纯度和均一性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本纯的。具体说，分离的MET10核酸由侧接MET10基因并编码MET10以外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“纯化”指核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条条带。具体地，这意味着核酸或蛋白质至少85％纯、更优选至少95％纯，最优选至少99％纯。
提到核酸部分时，术语“异源”指该核酸包含两种或多种互不相同的子序列，它们可能通过自发突变或基因组重排在群体中天然产生，或者可被人工引入。例如，核酸一般是重组产生的，具有两个或多个来自无关基因的序列，它们经排列组成新的功能性核酸，例如启动子来自一个来源和编码区来自另一来源。相似地，异源蛋白说明，该蛋白包含两个或多个性质上相异或未发现相同关系的子序列(如融合蛋白)。
“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建物，其具有一系列专门化的核酸元件以便在宿主细胞中转录特定核酸。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。表达载体一般包含与启动子操作性连接的待转录核酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及以类似于天然产生的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即碳结合于氢、羧基、氨基和R基，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但与天然产生的氨基酸的基本化学结构保持相同。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的普通化学结构，但作用方式类似于天然产生的氨基酸的化学化合物。
在本文中，氨基酸可用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通用三字母代号或单字母代号表示。同样，核苷酸可用其普遍接受的单字母代码表示。
“保守修饰变体”可应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在密码子确定为丙氨酸的每个位置上，可将密码子改变为所述的任何相应密码子而不改变编码多肽。这类核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文所述的编码多肽的每种核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员认识到，可修饰核酸中的各个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此，在所述的各序列中暗示了编码多肽的核酸的各沉默变异。
至于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行单个取代、缺失或加入以在编码序列中改变、加入或删除一个氨基酸或少量氨基酸是“保守修饰变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代某氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。这类保守修饰的变体包括并不排除本发明的多态性变体、种间类似物和等位基因。
以下八组各自含有可互相保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)
(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。
在两种或多种核酸或多肽序列中，术语“相同”或“相同性”百分数指在比较窗口或指定区域上，采用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目测查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列相同或具有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即，在SEQ ID NO：1的某特定区域上60％相同，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同)。然后，可称这些序列“基本相同”。该定义也指测试序列的互补序列。优选在长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上存在相同性，或者更优选在长度50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在相同性。
在序列比较中，一般将一种序列用作与测试序列相比的参比序列。使用序列比较算法时，测试和参比序列均输入计算机，如果必要指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可指定另选的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。为了将核酸和蛋白质与MET10核酸和蛋白质进行比较，使用BLAST和BLAST2.0算法和下面讨论的默认参数。
本文所用的“比较窗”包括参考选自20-600，通常约50-200，更常见约100-150数量的毗连位置的区段，对两个序列进行最优比对后，可将该区段的序列与相同数量的毗连位置的参比序列作比较。比对序列进行比较的方法是本领域熟知的。可通过，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981)，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48:443(1970)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)，通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，575科学Dr.，威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))，或通过手工比对和目测(参见例如，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编，1995增刊))进行最优序列比对以便比较。
适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选例子分别是BLAST和BLAST 2.0算法，参见Altschul等，Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。使用BLAST和BLAST 2.0，设定本文所述的参数，以确定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。进行BLAST分析的软件可从公众渠道国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)获得(参见万维网址ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先通过查询序列中鉴定长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，该短字与数据库序列中相同长度的字比对时，匹配或满足一些正值阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索发现含有它们的更长的HSP的种子。该字命中在沿各序列的两个方向上延伸，直到可增加累积的比对评分。对于核苷酸序列而言，利用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。在以下情况出现时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到各序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)采用的默认值如下：字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。
BLAST算法也对两种序列进行相似性的统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小概率和(P(N))，它说明两种核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参比核酸的比较中最小概率和小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸类似于参比序列。
说明两种核酸序列或多肽基本相同的指标是第一种核酸编码的多肽与第二种核酸编码的多肽产生的抗体能发生免疫交叉反应，如下所述。因此，如果(例如)某多肽与第二种多肽的区别仅为保守取代，则该两种肽通常基本相同。两种核酸序列基本相同的另一指标是两种分子或其互补序列在严谨条件下互相杂交，如下所述。两种核酸序列基本相同的另一指标是可利用相同的引物扩增该序列。
术语“选择性(或特异性)杂交”指当某序列出现在复杂混合物(如细胞或文库的总DNA或RNA)中时，该分子在严谨杂交条件下只与某特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。
“宿主细胞”指含有表达载体并且支持该表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是，例如，原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞如酵母。
III.编码MET10的核酸
A.通用重组DNA方法
本发明依赖重组和经典遗传学领域的常规技术。通常，下述重组DNA技术中的术语和实验室步骤均为本领域熟知且常用的。用标准技术进行克隆，DNA和RNA的分离、扩增和纯化。涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶反应通常按照生产商说明书进行。公开本发明所用通用方法的基础教科书包括Sambrook和Russell，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)2001)；Ausubel等编，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)1987-2008)；和Kriegler，《基因转移和表达：实验室手册》(Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual)，(1990))。
对核酸而言，以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出大小。它们是获自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、测序核酸或公开的DNA序列的估计值。对蛋白质而言，以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数目给出大小。由凝胶电泳、测序的蛋白质、衍生的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估计蛋白质大小。
按照固相亚磷酰胺三酯法，用如Van Devanter等，Nucleic Acidss Res.12:6159-6168(1984)所述的自动合成仪化学合成不是从市场上购得的寡核苷酸，该方法首先由Beaucage和Caruthers记载于Tetrahedron Letts.22:1859-1862(1981)。寡核苷酸的纯化通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC进行，如Pearson和Reanier，J.Chrom.255:137-149(1983)所述。
克隆后，可利用，例如Wallace等，Gene 16:21-26(1981)所述的用于对双链模板进行测序的链终止法验证克隆的基因和合成的寡核苷酸的序列。
B.分离编码MET10的核苷酸序列的克隆方法
通常，编码MET10的核酸序列和相关核酸序列同源物由cDNA和基因组DNA文库克隆，或者用寡核苷酸引物的扩增技术分离。例如，MET10序列一般通过与核酸探针杂交由核酸(基因组或cDNA)文库分离，其序列可衍生自SEQ ID NO:1或其子序列。MET10RNA和cDNA可由任何酵母株分离。
与MET10基本相同的MET10多态性变体、等位基因和种间同源物可利用MET10核酸探针和寡核苷酸，通过筛选文库在严谨杂交条件下分离。或者，可用MET10的核心结构域产生的抗血清或纯化抗体，通过免疫方法检测表达的同源物，以便利用表达文库克隆MET10多态性变体、等位基因和种间同源物，所述抗血清或抗体也识别和选择性结合MET10同源物。
为了制备cDNA文库，可由任何酵母株纯化MET10mRNA。然后，可利用逆转录酶将mRNA制成cDNA，连接到重组载体中，并转染到重组宿主中进行增殖、筛选和克隆。制备和筛选cDNA文库的方法是众所周知的(参见例如，Gubler和Hoffman，Gene 25:263-269(1983)；Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
对基因组文库而言，由组织提取DNA，进行机械剪切和酶促消化，以产生约1-8kb的片段。然后，通过梯度离心将所需片段与不想要的大小分离开，并构建到λ噬菌体载体中。这些载体和噬菌体在体外包装。通过空斑杂交分析重组噬菌体，如Benton和Davis，Science 196:180-182(1977)所述。通常按照Grunstein等，PNAS USA.，72:3961-3965(1975)所述进行集落杂交。
分离MET10核酸和其同源物的另一种方法合并使用合成寡核苷酸引物和扩增RNA或DNA模板(参见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)(Innis等编，1990))。可利用诸如聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)等方法直接从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库扩增MET10的核酸序列。可设计简并的寡核苷酸，以便用本文提供的序列扩增MET10同源物。可将限制性核酸内切酶位点掺入引物中。聚合酶链反应或其它体外扩增方法也可用于，例如，克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，制备用作检测生理样品中是否存在编码MET10的mRNA、核酸测序或其它目的的探针的核酸。PCR反应扩增的基因可由琼脂糖凝胶纯化，并克隆到合适载体中。
使用引物的扩增技术可用于扩增和分离MET10DNA或RNA。例如，编码MET10或其片段的核酸可通过扩增酵母cDNA文库获得，或者用具有表5所列序列的分离核酸引物对从酵母RNA逆转录。
例如，可利用这些引物扩增全长序列或一至几百个核苷酸的探针，然后用于筛选cDNA文库中的全长MET10。
MET10的基因表达也可通过本领域已知技术，例如mRNA的逆转录和扩增、总RNA或聚A+RNA的分离、northern印迹、点印迹、原位杂交、RNA酶保护、探测DNA微芯片阵列等进行分析。
合成的寡核苷酸可用于构建重组MET10基因，用作探针或用于表达蛋白质。用长度通常为40-120bp的一系列重叠寡核苷酸进行这种方法，它们代表该基因的正义和反义链。然后，将这些DNA片段退火、连接和克隆。或者，可利用精确引物实施扩增技术，以扩增MET10基因的特定子序列。然后，将特定子序列连接到表达载体中。可制备MET10嵌合物，其合并MET10的一部分与异源MET10的一部分，以产生嵌合的功能性MET10。
一般将编码硫化物惰性MET10多肽的基因克隆到中间载体中，然后转化到原核或真核细胞中进行复制和/或表达。这些中间载体通常是原核载体，例如质粒、或穿梭载体。编码硫化物惰性MET10蛋白的分离核酸包含编码硫化物惰性MET10蛋白的核酸序列和它们的子序列、种间同源物、等位基因和多态性变体。在一些实施方式中，编码硫化物惰性MET10蛋白的分离核酸是SEQ ID NO:1或其互补物。
C.硫化物惰性MET10多肽的表达
为了获得克隆基因，如编码硫化物惰性MET10多肽的cDNA的高水平表达，一般将硫化物惰性MET10的核酸序列亚克隆到含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和(如果是编码蛋白质的核酸)用于启动翻译的核糖体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子是本领域熟知的，参见例如Sambrook等和Ausubel等。用于表达所述硫化物惰性MET10蛋白的细菌表达系统可获自，例如大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门菌(Salmonella)中(Palva等，Gene 22:229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302:543-545(1983)。可购得这类表达系统的试剂盒。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域众所周知的，并且也可从市场上购得。
用于指导异源核酸表达的启动子取决于具体应用。该启动子与异源转录起始位点的距离优选和其在天然状态中与转录起始位点的距离大致相同。然而，本领域知道，该距离允许有一些变化而不损失启动子功能。
除启动子以外，表达载体一般还包含转录单元或表达盒，它们含有在宿主细胞中表达所述硫化物惰性MET10编码核酸所必须的所有其它元件。因此，表达盒一般包含操作性连接于编码硫化物惰性MET10的核酸序列的启动子以及有效聚腺苷酸化所述转录物所需的信号、核糖体结合位点和翻译中止位点。该表达盒的其它元件可包括增强子，如果是基因组DNA用作结构基因的话，还包括具有功能性剪切供体和受体位点的内含子。
除启动子序列外，该表达盒也应含有结构基因下游的转录终止区，以便有效终止。终止区可获自与启动子序列相同的基因，或者可获自不同基因。
具体用哪种表达载体将遗传信息运输到细胞中并不重要。可使用在真核或原核细胞中表达所用的任何常规载体。标准的细菌表达载体包括质粒，如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D和融合表达系统如GST和LacZ。也可将表位标签，如c-myc加入重组蛋白中，以提供方便的分离方法。
一般将含有真核病毒调控元件的表达载体用于真核表达载体，如SV40载体、乳头瘤病毒载体和衍生自EB病毒的载体中。其它示范性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE以及能够在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳房肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或在真核细胞中显示有效表达的启动子的指导下表达蛋白质的任何其它载体。
一些表达系统具有提供基因扩增的标记，如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。
表达载体中一般包含的元件也包括在大肠杆菌中起效的复制子、编码抗生素抗性以便选择携带重组制粒的细菌的基因和质粒非必需区中用于插入真核序列的独特限制性位点。具体的抗生素抗性基因的选择并不重要，本领域已知的许多抗性基因均适用。如果必要，优先选择原核序列，使它们不干扰真核细胞中DNA的复制。
D.宿主细胞和其生产方法
本发明也提供不产生硫化氢或产生低水平硫化氢并且表达本文所述的外源性硫化物惰性MET10多肽的宿主细胞。通过本领域已知方法，例如，用重组或遗传杂交法将编码662位氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸的硫化物惰性MET10多肽的外源性多核苷酸引入亲本宿主细胞中。在一些实施方式中，所述宿主细胞也不表达硫化物活性MET10多肽，即，因为活性MET10多肽的编码序列被敲除或被硫化物惰性MET10多肽的编码序列取代。
与引入编码所述硫化物惰性MET10多肽的核酸之前的亲本株相比，产生低水平或者水平降低或下降的硫化氢的宿主细胞产生50％或更少H2S。在一些实施方式中，与引入编码所述硫化物惰性MET10多肽的核酸之前的亲本株相比，产生低水平或者水平降低或下降的硫化氢的宿主细胞产生40％、30％、25％、20％或更少H2S。
该宿主细胞可以是，例如真核或原核细胞。该宿主细胞可以是细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞。在一些实施方式中，该宿主细胞是酵母细胞，例如，酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母或粟酒裂殖酵母的酵母细胞。用于产生发酵饮料，如葡萄酒、波尔多红葡萄酒、马德拉白葡萄酒、啤酒、香槟等的酵母细胞(如“葡萄酒酵母”、“啤酒酵母”、“香槟酵母”等)可用于引入编码外源性硫化物惰性MET10多肽的核酸。用于制备发酵饮料并且是灭活MET10的候选者的酵母细胞株(即，它们是硫化氢生产者)可购自多种来源，包括但不限于：拉尔孟(Lallemand)(拉尔文(Lalvin))(加州佩塔卢马(Petaluma，CA)；网址为lallemandwine.us/products/yeast_chart.php)红星(Red Star)(网址为www.redstaryeast.net/)、怀特实验室(White Labs)(科罗拉多州玻尔得(Boulder，CO)；网址为whitelabs.com/yeast_search.html)、Wyeast(俄勒冈州欧德尔(Odell，OR)；网址为wyeastlab.com)、Kitzinger’s、J.Laffort、Vierka、Gervin、SB Active、Unican、Siebel Inst.和Fermentis(网址为fermentis.com/FO/EN/00-Home/10-10_home.asp)。参见例如，万维网址winemaking.jackkeller.net/strains.asp中葡萄酒和香槟酵母菌株的代表性列表，以及byo.com/referenceguide/yeaststrains/中啤酒酵母菌株的代表性列表。
在一些实施方式中，酵母细胞株是酿酒酵母菌株。在一些实施方式中，酿酒酵母酵母细胞株是葡萄酒酵母，例如，选自二次发酵菌株、一级特酿菌株、法国红菌株、蒙他榭菌株、拉尔孟K1菌株、波尔多菌株、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19和Bb22。参见例如，美国专利号6,140,108，通过引用将其全文纳入本文用于所有目的。作为灭活MET10，即引入编码硫化物惰性MET10多肽的核酸的候选者的其它酵母菌株列于表1、3和4。
可利用标准的转染方法产生表达大量硫化物惰性MET10蛋白的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后用标准技术纯化(参见例如，Colley等，J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989)；蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification)，刊于《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第182卷(Deutscher编，1990))。按照标准技术转化真核和原核细胞(参见例如，Morrison，J.Bact.132:349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，《酶学方法》(Methods in Enzymology)101:347-362(Wu等编，1983)。
可采用将外来核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合，电穿孔，脂质体，显微注射，原生质载体(plasma vector)，病毒载体和将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传物质引入宿主细胞的任何其它熟知方法(参见例如，Sambrook等，同上)。唯一必要的是，所用的具体遗传工程方法能够将至少一种基因成功引入能够表达硫化物惰性MET10的宿主细胞中。经改良不产生硫化氢的宿主细胞(即非H2S生产者)的活性MET10通常被敲除、取代或突变。例如，亲本菌株中编码硫化物活性MET10的核酸中编码662位氨基酸的密码子(核酸位置1984-1986)可以被突变，以使该密码子不编码苏氨酸(或丝氨酸)。也可采用同源重组技术用编码本文所述的硫化物惰性MET10多肽的核酸序列取代编码硫化物活性MET10多肽的核酸。参见例如，图3和Baudin，等，Nucleic Acids Res(1993)21(14):3329。
将表达载体引入细胞后，在有利于硫化物惰性MET10表达的条件下培养转染的细胞，然后用下述标准技术从培养物中回收。
也可用经典酵母遗传技术，例如芽孢分离、接合型相反的芽孢杂交和分离得到的二倍体菌株，将编码惰性酶的外源性MET10核酸转染到新遗传背景中。可利用数轮遗传杂交分离不同菌株背景中的新MET10等位基因。不一定用重组工具产生修饰菌株。利用经典酵母遗传技术将编码硫化物惰性MET10多肽的核酸引入酵母宿主细胞中的示范性方法参见例如，美国专利号6,140,108。
E.纯化MET10蛋白
可纯化天然产生或重组的MET10蛋白，以用于功能实验。天然产生的MET10蛋白是从(例如)酵母和任何其它MET10同源物来源纯化的。重组MET10是由任何合适的表达系统纯化的。
可通过标准技术将MET10纯化至基本纯，所述技术包括用诸如硫酸铵等物质选择性沉淀；柱色谱，免疫纯化法等(参见例如，Scopes，蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification:Principles and Practice)(1982)；美国专利号4,673,641；Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。
纯化重组MET10蛋白时，可使用许多方法。例如，可将具有已确定分子粘附性质的蛋白质与MET10可逆地融合。可利用合适的配体使MET10选择性吸附于纯化柱，然后以相对纯的形式由柱释放。然后，通过酶活性去除融合的蛋白质。最后，可利用免疫亲和柱纯化MET10。
IV.通过检测MET10核酸序列测定酵母株是否产生H2S
在本发明的一个实施方式中，提供测定特定的酵母株是否是H2S生产者的方法。按照本发明方法，分析酵母菌株的MET10等位基因并与本文所述的MET10等位基因作比较，以确定酵母株是高H2S生产者、低H2S生产者或非H2S生产者。通常通过分析由待分析酵母(如酵母属(Saccharomyces))获得的核酸样品确定是否存在特定的MET10等位基因。核酸样品常常包含基因组DNA。也可能分析RNA样品中是否存在MET10等位基因。
评价核酸中是否存在单碱基改变的检测技术包括分子遗传学领域熟知的方法。另外，许多方法包括扩增核酸。本领域提供了实施该方法的详尽的指南。示范性参考文献包括许多手册，诸如PCR技术：在DNA扩增中的原理和应用(PCR Technology:PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION)(H.A.ERLICH编，弗里曼出版社(FREEMAN PRESS)，纽约州纽约市，1992)；PCR方案：方法和应用指南(PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODS AND APPLICAION)(Innis等编辑，学术出版社(Academic Press)，加州圣地亚哥，1990)；新编分子生物学实验指南(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，Ausubel，1994-2008，韦利科学出版社(Wiley Interscience)，包括2004年4月更新的增刊；Sambrook和Russell，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)。
检测单碱基改变的方法是本领域熟知的，常常包括以下几种通用方案之一：用序列特异性寡核苷酸杂交、引物延伸、序列特异性连接、测序或电泳分离技术、如单链构象多态性(SSCP)和异源双链体分析。示范性的实验包括5'核酸酶测定、模板指导的染料终止子掺入、分子信标等位基因特异性寡核苷酸测定、单碱基延伸测定和通过实时焦磷酸序列进行SNP评分。可利用各种技术对扩增序列进行分析，例如微芯片、荧光偏振实验和衬质辅助的激光解吸电离(MALDI)质谱。除了用这些频繁使用的方法分析核酸样品以检测单碱基改变外，可使用本领域已知的任何方法检测是否存在本文所述的MET10突变。
虽然该方法一般包括采用PCR步骤，但也可使用其它扩增方法。合适的扩增方法包括连接酶链反应(参见例如，Wu和Wallace，Genomics 4:560-569，1988)；链置换实验(参见例如，Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396，1992；美国专利5,455,166)；和几种基于转录的扩增体系，包括美国专利5,437,990；5,409,818；和5,399,491所述的方法；转录扩增体系(TAS)(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177，1989)；和自动维持序列复制(3SR)(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878，1990；WO 92/08800)。或者，可采用将探针扩增至可检测水平的方法，如Qβ-复制酶扩增(Kramer和Lizardi，Nature339:401-402，1989；Lomeli等，Clin.Chem.35:1826-1831，1989)。已知扩增方法的综述参见例如Abramson和Myers，Current Opinion in Biotechnology4:41-47，1993。
在一些实施方式中，用寡核苷酸引物和/或探针检测MET10等位基因。可通过任何合适方法，包括化学合成制备寡核苷酸。可利用市售试剂和设备合成寡核苷酸。或者，它们可通过商业渠道购得。合成寡核苷酸的方法是本领域熟知的(参见例如Narang等，Meth.Enzymol.68:90-99，1979；Brown等，Meth.Enzymol.68:109-151，1979；Beaucage等，Tetrahedron Lett.22:1859-1862，1981；和美国专利4,458,066的固相支持法)。
A.用PCR鉴定MET10等位基因
在一些实施方式中，用PCR扩增编码MET10等位基因的核酸。适用技术的总概述可参见《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)(Innis等编(1990))和《PCR技术：在DNA扩增中的原理和应用》(PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification)(Erlich编(1992))。此外，美国专利4,683,195和4,683,202中描述了扩增技术。
PCR能够进行拷贝，导致扩增靶核酸，例如编码MET10的核酸。简要说，将靶核酸，例如来自包含感兴趣酵母菌株的样品的DNA与正义和反义引物、dNTP、DNA聚合酶和其它反应组分混合。(参见Innis等，同上)正义引物可与感兴趣DNA序列的反义链退火。反义引物可与DNA序列的正义链退火，在正义引物与靶DNA退火的位置的下游。在第一轮扩增中，DNA聚合酶延伸与靶核酸退火的反义和正义引物。合成的第一条链是长度不特定的长链。在第二轮扩增中，反义和正义引物与亲本靶核酸以及该长链上的互补序列退火。然后，DNA聚合酶延伸退火的引物，形成特定长度的互相互补的链。后续循环主要用于扩增特定长度的DNA分子。
通常，PCR和其它扩增技术使用能与感兴趣DNA的任一端退火的引物。例如，可利用具有表5所列序列的分离的核酸引物对扩增编码MET10等位基因的核酸或其片段。
B.检测扩增的产物
可利用本领域已知的任何方法检测扩增的产物，这些方法包括例如，限制性片段长度多态性(RFLP)分析；变性凝胶电泳(参见例如，Erlich编，PCR技术,在DNA扩增中的原理和应用(PCR TECHNOLOGY,PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION)，WHF公司(W.H.Freeman and Co)，纽约，1992，第7章)，直接测序和基于HPLC的分析。合适的测序方法包括例如，基于双脱氧测序的方法和MG测序(Maxam and Gilbert sequence)(参见例如，Sambrook和Russell，同上)。合适的基于HPLC的分析包括例如，变性HPLC(dHPLC)，如Premstaller和Oefner，LC-GC Europe 1-9(July 2002)；Bennet等，BMC Genetics 2:17(2001)；Schrimi等，Biotechniques 28(4):740(2000)；和Nairz等，PNAS USA99(16):10575-10580(2002)所述；和离子对反相HPLC-电喷雾电离质谱法(ICEMS)，如Oberacher等；Hum.Mutat.21(1):86(2003)所述。鉴定MET10等位基因中单碱基改变的其它方法包括例如，单碱基延伸(参见例如，Kobayashi等，Mol.Cell.Probes，9:175-182，1995)；单链构象多态性分析，如Orita等，Proc.Nat.Acad.Sci.86，2766-2770(1989)所述，等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)(如，Stoneking等，Am.J.Hum.Genet.48:70–382，1991；Saiki等，Nature 324，163-166，1986；EP 235,726；和WO 89/11548所述)；和序列特异性扩增或引物延伸法，如WO 93/22456；美国专利5,137,806、5,595,890、5,639,611和美国专利4,851,331所述；5'-核酸酶试验，如美国专利5,210,015、5,487,972和5,804,375；以及Holland等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280所述。
V.降低发酵饮料中的H2S水平的方法
包含本文所述MET10核酸序列的酵母菌株可用于降低发酵饮料(如葡萄酒和啤酒)中的H2S水平。
按照本发明方法，将编码本文所述硫化物惰性MET10多肽的外源性核酸序列转化的酵母细胞与发酵培养基(如，果汁或麦芽汁)相接触，在合适的第一发酵容器(如槽、筒、坛、罐、桶或聚乙烯容器)中，在适合发酵进行的温度(如约70-75°F)下将该混合物培育适当时间(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。然后，可将液体转移到第二个发酵容器中。第二个容器可以密封或不密封，在适合无氧发酵和陈化进行的温度(如约60-65°F)下，将其内容物培育合适时间(如2、3、4、5、6、7或8周)。然后将液体转移到第三个容器中静置(即澄清)。密封第三个容器，使沉淀物沉降合适时间(如2、3、4、5、6、7或8周)。静置可重复进行一次、两次、三次或更多次，然后将发酵饮料装瓶。天然MET10等位基因可利用重组DNA技术取代，或通过经典育种方案杂交。UCD932MET10等位基因在BiGGY琼脂上产生白色菌落，使得能够在遗传杂交中追踪这个等位基因，并且在生产过程中易于筛选以显示成功植入的菌株。
酒澄清且所有发酵和装瓶前陈化过程终止时，用虹吸管吸入酒瓶中并用软木塞紧密地封瓶。将软木塞封口的酒瓶竖直静置3-5天，然后侧放着储存在55华氏度的环境中6个月(白葡萄酒)至一年(红葡萄酒)，然后采样。如果未达预期，再陈化1年或更长时间。
可利用本领域已知的任何方法转化酵母，这些方法包括例如，Gietz和Woods《酶学方法》(Methods in Enzymology)350：87-96(2002)；Agatep等，在线技术提示(Technical Tips Online)乙酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇(LiAc/ss-DNA/PEG)转化酿酒酵母的方案(1998)所述的Liac/SS载体DNA/PEG法；和Gietz等，Mol Cell Biochem 172:67-79(1997)所述的酵母双杂交法。制备能够转化的酵母细胞的方法参见例如Dohmen等，(1991)Yeast 7:691-692。
VI.试剂盒
MET10和其同源物是更特异和更灵敏地鉴定低H2S生产者酵母菌株的有用工具。例如，可利用特异性杂交MET10核酸的核酸，如MET10探针和引物(如表5所列)、MET10核酸(如图2所列)鉴定低H2S生产者酵母菌株。
本发明还提供检测本文所述的MET10等位基因的试剂盒和解决方案。例如，本发明提供包括一个或多个反应容器的试剂盒，这些容器中包含等份的一些或所有本发明反应组分。这些等份可以是液体或干燥形式。反应容器可包括能够在同一容器中保持、加工和/或扩增样品的样品加工筒或其它容器。这类试剂盒能够迅速检测标准或便携式扩增装置中产生的本发明扩增产物。该试剂盒也可包含有关如何使用该试剂盒扩增靶样品和控制靶样品扩增的书面使用说明。
该试剂盒可包括例如，含有足以扩增至少一种MET10等位基因的引物的扩增试剂，和至少一种用于扩增和检测多核苷酸序列的探针。此外，该试剂盒可包括核苷酸(如A、C、G和T)、DNA聚合酶和合适的缓冲液、盐和有利于扩增反应进行的其他试剂。
在一些实施方式中，该试剂盒包括用于快速扩增样品的容器如样品加工筒，如Belgrader等，Biosensors and Bioelectronics 14:849-852(2000)；Belgrader，等，Science，284:449-450(1999)；和Northrup，M.A.等，新一代的PCR设备和核酸浓缩系统(A New Generation of PCR Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems)，刊于《PCR方案》(PCR PROTOCOLS)(Sninsky，J.J.等(编))学术出版社(Academic)，圣地亚哥，第8章(1998))所述。
实施例
提供以下实施例，以说明，而非限制要求保护的本发明。
实施例1：鉴定影响H2S产量的基因
为了更好地理解形成H2S的机制和途径和开发未来的预防和控制方案，筛选由4,827个突变体组成的酵母缺失菌株组，以鉴定影响H2S产量的基因。筛选用于酒类发酵的天然分离物集合(Mortimer 1994)，以确定菌落颜色偏差与实际H2S产量的基础。此外，筛选其亲本菌株是非H2S生产者的酵母空突变体集合中突变导致H2S产量上升的基因。也评估这些突变对H2S形成的可能的相加效应。
材料和方法
酵母菌株和培养条件。本研究使用且提交结果的酵母菌株见表1。在含2％葡萄糖的酵母提取物蛋白胨右旋糖培养基(YPD)上维持和培养酵母菌株(Sherman等,1974)。含遗传霉素(G418，0.2mg/ml)的相同培养基(YPD)用于维持携带G418R标记的缺失菌株。
DNA和遗传操作。利用标准步骤进行遗传操作，包括杂交、孢子形成和四分子分析(Gunthrie 1991)。用KanMX破坏标记-JKKanRE的上游正向引物和内部反向引物进行PCR，以验证基因缺失。扩增条件如下：30个下述循环：94℃2分钟，92℃45秒，56℃30秒，72℃1分钟，最后在72℃延伸7分钟。引物序列列于表5。
缺失组和天然菌株的筛选。在BiGGY琼脂、葡萄糖甘氨酸铋酵母琼脂(Nickerson 1953)上筛选缺失组(阿拉巴马州亨茨维尔的奥本生物系统公司(Open Biosystems,Huntsville,AL))和天然分离物集合。也在起初含有123mg氮当量/升的合成葡萄汁培养基“极限果汁培养基”(MMM)(Spiropoulos等，2000)中筛选它们。用0.2g L-精氨酸/升和0.5g磷酸铵/升产生氮水平。
分析硫化氢的形成。用乙酸铅法(Spiropoulos等，2000；Giudici，P.和R.E.Kunkee，1994)评估硫化氢产量。最初用50μL 5％乙酸铅溶液预处理并在室温下干燥的纸条(2x 10cm，3mm沃特曼(Whatman)滤纸)检测硫化氢形成。把乙酸铅条对折，并插入50mL培养管中，该纸条的一端固定在培养管盖上，使乙酸铅条的中部保持在液体培养基上方的气体环境中。通过乙酸铅条变黑的程度定性测定硫化氢的形成。Carrie Findleton进行了这种筛选，作为其MS学位论文的一部分。
用更灵敏的半定量方法验证所有阳性结果。将沃特曼滤纸条(1.5x 8.0cm，3mm)卷起并放入1ml无泡(bulb-less)塑料移液管中，用250μl 3％乙酸铅溶液处理。使滤纸在室温下干燥，然后将塑料乙酸铅柱连接于具有硅胶塞的50mL培养管。通过滤纸上变暗的毫米数测定硫化氢形成。
在后续实验中，为了定量测定H2S的产生，使用包装的乙酸铅柱，柱上每变暗1毫米表明4μg/L H2S。乙酸铅柱购自菲戈萨国际公司(Figasa International Inc.)(韩国首尔(Seoul，Korea))。
发酵条件。为了鉴定酵母菌株和影响硫化氢形成的营养条件，25℃，120rpm振荡器，在50mL培养管中以5mL改良三M培养基培养酵母培养物。使用合成的葡萄汁培养基“极限麦芽汁培养基”(MMM)(Giudici等，1993)，对最初的配方进行改良以获得七种不同的氮和微量元素养分组成。操纵精氨酸、磷酸铵和酪蛋白氨基酸的添加，以调节氮浓度，调节YNB(不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮基料)的添加以控制营养物和维生素的浓度。三M改良见表2。
酵母接种物获自平板培养的酵母菌落。这个步骤可导致接种时细胞数目发生一些变化，但由于初步筛选过程中涉及大量酵母菌株，所以这个步骤是必需的。4天后，通过乙酸铅条变黑的程度评价硫化氢的形成。在4天中没有生长的菌株重复检测，以保证没有其他变量导致不生长。
对于感兴趣的所选菌株而言，用乙酸铅柱定量测定硫化氢形成。出于此种目的，在含有300mL MMM的500-mL锥形瓶中进行发酵，乙酸铅柱固定在烧瓶顶端的橡胶塞中。出于此种目的，使用123mg/L氮MMM更精确地模仿低氮葡萄汁条件。以1.33x 105细胞/毫升的密度接种组成相同的三M培养基中预培养的培养物的静止期细胞，开始发酵。一式三份地进行发酵，在25℃和120rpm培育，在7天中监测重量损失和乙酸铅柱的变暗。
在BiGGY琼脂上筛选缺失组和天然分离物。为了评估缺失菌株和天然分离物的H2S产量，首先将它们接种于BiGGY琼脂平板并评价菌落的颜色。菌落颜色为：白色、淡棕色，棕色(缺失组亲本菌株颜色)、淡褐色、褐色或黑色(Linderholm等，2006)。在缺失组中，由淡至深来看，4个菌落为白色，258个为淡棕色，4478个为棕色，59个为淡褐色，28个为褐色，1个集落是黑色。
在合成果汁中筛选天然和市售分离物。在含有123mg/L氮的合成果汁MMM中筛选三十种天然分离物，以评价H2S产量与集落颜色。非-H2S生产者(即UCD932、UCD713、UCD819、UCD938、UCD942、UCD954和UCD956)的菌落颜色为白色至淡褐色。产生H2S的菌株的颜色范围是淡棕色(3)至棕色(10)至淡褐色(5)至棕色(5)。颜色最深的菌落(棕色)产生2-6mm H2S，其产量在中等范围。三个产量最高的生产者(超过10mm)在BiGGY上的颜色是淡棕色、棕色和淡褐色。BiGGY上和MMM中的天然分离物见表3。
表3.BiGGY上和MMM中的天然分离物
实施例2:鉴定UCD932的MET10等位基因中的突变
如上述实施例1所述，UCD932被鉴定为在各种环境条件下产生少量至检测不到的硫化氢的酵母株。该菌株在BiGGY琼脂上也产生白色菌落，与亚硫酸盐还原酶活性低相关联。对酿酒酵母菌株的缺失组筛选产生四种导致白色菌落的可能突变，它们均编码亚硫酸盐还原酶的组分。遗传杂交揭示出UCD932中的白色菌落BiGGY表型源于MET10基因的改变。MET10缺失菌株是甲硫氨酸营养缺陷型，但UCD932不是甲硫氨酸营养缺陷型，这表明该细胞仍然保持了亚硫酸盐还原酶活性。为了确定这种低硫化物生产能力的遗传基础，对鉴定到可能在抑制酿酒酵母产生H2S方面起一定作用的MET10和硫酸盐还原途径中的几种其他基因(Linderholm等，2006)进行测序这能够鉴定到在生产H2S的葡萄酒菌株中可被替代而消除不良硫化物特性的等位基因。
材料和方法
酵母菌株和培养条件。本研究所用酵母菌株见表4。在含2％葡萄糖的酵母提取物蛋白胨右旋糖培养基(YPD)上维持和培养酵母菌株(Sherman等,1974)。含遗传霉素(G418，0.2mg/ml)或潮霉素(Hph,0.3mg/ml)的相同培养基(YPD)用于维持携带G418R或HphMX标记的缺失菌株。制备的极限培养基(YNB)含有0.67％酵母氮基料，不含氨基酸并按照推荐(Sherman)补充有酪蛋白氨基酸。制备类似于不含甲硫氨酸的YNB的选择性-met脱除培养基。
筛选缺失组。在补充有酪蛋白氨基酸的BiGGY琼脂(Sherman 1974)，一种葡萄糖甘氨酸铋酵母琼脂(Nickerson 1953)上筛选酵母缺失组(阿拉巴马州亨茨维尔的奥本生物系统公司)。将各菌株接种到BiGGY琼脂上，30℃培育48小时。评价得到的菌落的颜色。
序列分析。在169个天然和工业用酵母菌株中，对MET10、HOM2、HOM6、SER33、MET1、MET5和MET8进行序列分析。用粉碎和抓取方案从细胞沉淀中提取染色体DNA(Hoffman和Winston 1987)，并用高保真白金Taq酶(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))和MET10的引物PCR-MET10-F/PCR-MET10-R、HOM2的HOM2-F/HOM2-R、HOM6的HOM6-F/HOM6-R，SER33的SER33-F/SER33-R，MET1的MET1-F/MET1-R、MET5的MET5-F/MET5-R和MET8的MET8-F/MET9-R(表5)进行基因扩增。扩增条件如下：30个下述循环：94℃1分钟，94℃30秒，50℃30秒，68℃4分钟，最后在68℃延伸7分钟。
表5.PCR引物
所有测序均在加州大学，戴维斯分校生物科学学院测序机构(Biological Sciences Sequencing Facility at the University of California，Davis)进行，其使用ABI3730毛细管电泳遗传分析器和ABI BigDye终止子3.1版循环测序化学(加州福斯特城(Foster City，CA))，所用引物列于表6。编辑序列数据，并用BioEdit序列比对编辑器(5.0.9版；Nucleic Acids Symp.41:95-98)分析。
表6MET测序引物
这些序列的GenBank登录号是：UCD932MET10(EF058164)、UCD938MET10(EF058165)、UCD939MET10(EF058166)、UCD940MET10(EF058167)、UCD942MET10(EF058168)、UCD956(EF058169)、UCD522MET10(EF058170)、UCD957MET10(EF058171)、UCD934MET10(EF058172)、UCD950MET10(EF058173)、UCD932SER33(EF058174)、UCD939SER33(EF058175)、UCD940SER33(EF058176)、UCD956SER33(EF058177)、UCD950SER33(EF058178)、UCD932HOM6(EF058179)、UCD932MET1(EF058180)、UCD939MET1(EF058181)、UCD940MET1(EF058182)、UCD950MET1(EF058183)、UCD956MET1(EF058184)、UCD956MET5(EF058185)、UCD932MET5(EF058186)、UCD940MET5(EF058187)、UCD939MET5(EF058188)、UCD932MET8(EF058189)、UCD939MET8(EF058190)、UCD940MET8(EF058191)、UCD950MET8(EF058192)、UCD956MET8(EF058193)。
遗传操作.利用标准步骤进行遗传操作，包括杂交、孢子形成和四分子分析(Guthrie 1991)。
质粒、DNA操作和转化方法.本研究中使用质粒pAL51(MET10S288C)、pAL52(MET10UCD932)。设计携带限制性位点BamHI和SacII的引物PCR-MET10-F/PCR-MET10-R(表5)，用于由酵母菌株UCD932和S288C的染色体DNA(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)扩增MET10。质粒pYC130(Olesen等，2000)是携带选择性标记G418R的着丝粒载体，用BamHI和SacII(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Ipswich，MA))消化以便连接MET10。将得到的质粒pAL51(MET10S288C)、pAL52(MET10UCD932)用于转化。
利用基于PCR的技术产生MET10基因缺失，图3(Baudin 1993)。用引物MET10-F-KO/MET10-R-KO对具有MET10两侧的非编码区突出端的含KanMX的缺失盒(酵母缺失集合)进行PCR扩增，将线性PCR片段转化到酵母双倍体菌株UCD522、UCD932、UCD939、UCD940和UCD950中。通过同源重组，用敲除盒替代一个拷贝的完整MET10，从而产生携带一个拷贝的完整MET10拷贝和KanMX标记的菌株。除UCD522MET10/KanMX外，所有菌株随后均形成孢子，与G418R同源的那些用于进行进一步实验。用KanMX破坏标记-JKKanRE的上游正向引物和内部反向引物进行PCR，以验证基因缺失。
为了敲除UCD522MET10/KanMX中剩余的MET10完整拷贝，用引物MET10-hphMX-F/MET10-hphMX-R由BamHI线性化的pYC140扩增HphMX盒(Hansen等，2003)，将线性PCR片段转化到ALY29中。选择显示G418R和HphR的甲硫氨酸营养缺陷型菌落，用HphMX破坏标记–HYGROB CHK_R的上游正向引物和内部反向引物进行PCR，以验证HphMX缺失。
也利用基于PCR的技术产生MET10的等位基因交换(图3)(Baudin 1993)。利用引物MET10-F-KO/MET10-R-KO由S288C、UCD932、UCD939、UCD940、UCD950和UCD522扩增MET10的等位基因。然后，将由S288C和UCD932扩增的线性PCR片段转化到甲硫氨酸营养缺陷型菌株中。将其他片段转化到单个菌株中，产生相应的对照菌株。
选择能够在甲硫氨酸营养缺陷型平板上生长的菌株，形成孢子以产生MET10同源的菌株，进行进一步实验。
用根据Schiestl和Gietz(1989)所述改良的乙酸锂法转化酿酒酵母，用Inoue等(Inoue等，1990)所述的方法转化大肠杆菌。用大肠杆菌INVαF’(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)制备质粒。用含有氨苄青霉素的LB培养基(Miller 1972)选择转化的大肠杆菌细胞。
发酵条件.在发酵实验中，使用含有208mg氮当量/升的合成葡萄汁培养基“极限果汁培养基”(MMM)(Spiropoulos等，2000)。用0.2g L-精氨酸/升和0.5g磷酸铵/升产生氮水平。以1.33x 105细胞/毫升的密度接种MMM初始培养基中预培养的培养物的静止期细胞，以开始发酵。在含有300ml培养基的500-ml锥形瓶中进行发酵。各烧瓶上装有硅胶塞，塞上连有乙酸铅管。25℃，120rpm振荡培育该烧瓶。用重量损失作为CO2产量的估计值，检测发酵7天。
结果
鉴定缺失菌株的硫化氢产量为了评价全组缺失株的硫化氢产量，首先将它们接种于BiGGY琼脂并评估菌落的颜色。菌落是白色、淡棕色、棕色(亲本株颜色)、淡褐色、褐色或黑色。4个菌落是白色、258个是淡棕色、4478个是棕色、59个是淡褐色、28个是褐色、1个菌落是黑色。产生白色菌落的4个缺失体是MET10、MET8、MET5或MET1。我们还鉴定到HOM2、HOM6和SER33可能在抑制硫化氢形成中起一定作用(Linderholm等，2006)。
鉴定导致天然菌株成白色的基因.UCD932是由意大利分离的天然菌株(Mortimer等，1994)，它在BiGGY琼脂上是白色的非H2S生产者。为了鉴定导致其白色表型的基因，将其与各种白色缺失菌株杂交。只有一个菌株无法补充UCD932、YFR030W BY4742的白色表型。
当携带MET10野生型拷贝的载体pAL51(MET10S288C)转化到UCD932中时，得到产生棕色菌落但不形成硫化物的UCD932菌株(表7)。这说明，一种以上基因可能与MET10一起导致UCD932的低H2S产量表型。
表7
用MET10转化的发酵物的硫化氢生产特性
硫酸盐还原途径中基因的序列分析.以前证明，UCD932的CYS4和MET6中含有突变，这两种基因编码硫酸盐还原途径中重要的酶(Linderholm等，2006)。然而，将野生型等位基因引入该背景中不会改变产生低水平H2S的特性。因此，对鉴定该菌株在该通路的其他基因中还携带那些突变很感兴趣。测序UCD932以及在BiGGY琼脂上颜色不同和在合成果汁中H2S产量不同的几种其他天然和工业用菌株的硫酸盐还原途径的几种基因MET10、HOM2、HOM6、SER33、MET1、MET5和MET8进行测序(Spiropoulos等，2000)，以评价硫酸盐还原途径的遗传多样性(来自各种酵母菌株的MET10的序列比对见图2)。MET10p氨基酸差异见表8。
MET10(亚硫酸盐还原酶的组分)的序列分析证明，它在酵母菌株中不保守(表9)。在测序的十个菌株中发现不同于S288C的六种等位基因。通过BiGGY上的颜色和H2S产量对其进行粗略分组。UCD934、UCD957和UCD950是棕色H2S生产者，携带相同的等位基因。UCD938和UCD942是棕色非H2S生产者，携带相同的等位基因。UCD522和UCD940是杂合的褐色H2S生产者，但两个等位基因与其他菌株中发现的相同。UCD932和UCD956是白色非H2S生产者，UCD939是棕色H2S生产者，各自携带不同的等位基因。
表9
具有不同MET10的发酵物的硫化氢生产特性
已证明硫酸盐还原途径中的其他基因更保守。HOM2(编码天冬氨酸β半醛脱氢酶)的氨基酸或DNA序列中无差异，UCD932的HOM6(编码高丝氨酸脱氢酶)中一个氨基酸不同，S288C和所有其他葡萄酒菌株之间在SER33(编码3-磷酸甘油酸脱氢酶)中有一个氨基酸不同，MET1、MET5和MET8(亚硫酸盐还原酶的所有组分)中数个氨基酸不同。
MET10等位基因的交换。MET10等位基因的遗传多样性以及与H2S产量和菌落颜色的明显关联性支持以下假设：硫酸盐还原途径中的基因可能导致葡萄酒菌株中产生H2S表型，因为通过检测亚硫酸盐还原酶活性可知BiGGY琼脂上的颜色与H2S产量大致相关。因此，在产生H2S的菌株中，评估MET10对H2S产量的影响。用等位基因MET10UCD932替换产生H2S的酵母菌株的MET10等位基因(图3)。用KanMX或HphMX盒使UCD950、UCD940、UCD939、UCD522和UCD932中的天然MET10基因缺失，然后用UCD932、S288C的MET10等位基因或其自身的等位基因(作为对照)代替KanMX或HphMX盒。所有携带MET10UCD932的菌株的发酵速率与亲代和对照菌株相同，但变为非H2S生产者，并且在BiGGY琼脂上的颜色更淡。携带来自S288C的等位基因或其自身等位基因的菌株保持其生产H2S的表型(表9)。
携带MET10UCD932等位基因的UCD939菌株不恢复成甲硫氨酸原养型，与其他葡萄酒和市售分离物不同。这可解释为：该菌株在硫酸盐还原途径中携带其他突变。UCD939在编码亚硫酸盐还原酶的其他亚基的基因中存在两个突变。加入第三个突变可能显著降低亚硫酸盐还原酶的活性，因此可用于掺入含硫氨基酸，如甲硫氨酸或半胱氨酸的硫化物减少。因此，该菌株不能在没有甲硫氨酸的平板上生长。也可能存在亚硫酸盐还原酶上游毒性中间体累积的效应，因为不存在含硫氨基酸如S腺苷甲硫氨酸，对硫酸盐途径的抑制得到缓解。然而，用MET10S288C等位基因替代其自身的等位基因时，该菌株能存活，该菌株在BiGGY上的颜色由棕色改变为白色，其H2S产量显著降低。
市售葡萄酒菌株UCD522已被鉴定为非整倍体(Bakalinsky和Snow 1990)，染色体数目的失衡导致孢子形成时细胞死亡。因此，这两个等位基因需要单独破坏(图3)，与之相对的是其他菌株敲除一个等位基因，然后使该菌株形成孢子以获得同源敲除体。将MET10等位基因转化到敲除菌株中，然后使其形成孢子，以获得两种G418R/hphNT1R菌株和两种携带MET10等位基因的菌株。将各菌株用于实验，以观察是否出现遗传操作引起的任何不一致性(表10)。将这些菌株发酵至完成，在H2S生产方面的行为正如所料。携带药物抗性标记的各菌株是甲硫氨酸营养缺陷型且不产生H2S。携带MET10S288C或MET10UCD522等位基因的菌株产生H2S，携带MET10UCD932的菌株不产生H2S。
表10
异源菌株UCD522的发酵物的硫化氢生产特性
我们也用来自UCD950的MET10等位基因代替YFR030W BY4742和UCD932中的KanMX盒，它们在BiGGY琼脂上都呈棕色，但都不是H2S生产者。BY4742或UCD932与UCD950杂交表明，对于H2S生产，至少分离(segregating)4-5个等位基因。
讨论：
在酿酒酵母中观察到硫化物产量天然差异的一种可能性是硫酸盐还原途径中的酶的表达或活性发生遗传改变。硫酸盐还原途径显示出复杂的调节作用(Mountain等，1991)，一种酶的活性增加可能被该途径中其他蛋白的活性改变缓冲。
以前我们实验室的研究在天然非H2S生产者UCD932中鉴定到几种属于硫酸盐还原途径的等位基因。然而，我们证明，这些具体的等位基因并不单独导致H2S表型(Linderholm等，2006)。在我们对H2S形成抑制物的缺失集合的筛选中，我们鉴定到硫酸盐还原途径中起该种作用的几种其他基因，HOM2、HOM6、SER33、MET1、MET5、MET8和MET10(Linderholm等，2006)。对UCD932以及H2S产量不同的其他天然和工业用酵母菌株中的这些基因测序时，揭示出UCD932在所述九种基因中的五种基因中携带不同等位基因，包括CYS4和MET6(Linderholm等，2006)。在测序的菌株集合中发现存在许多MET10的等位基因。
本研究证明MET10在H2S形成中起重要作用，但它在UCD932中不单独导致非-H2S形成表型；在其他H2S生产菌株中，它显著改变H2S表型。在上述实验中，在三种H2S生产菌株中，MET10UCD932成功交换了天然等位基因，将其改变为非H2S生产者。这些结果对酿酒工业产生许多正面意义提示，因为能够通过转移合适等位基因而在任何遗传背景中构建硫产量降低的市售菌株，或预测任何酿酒酵母菌株的H2S产量特征。两种技术都相当简单，并且可用于酿酒厂。
在UCD939中交换MET10UCD932的实验不成功；UCD939MET10UCD932在缺乏甲硫氨酸的平板上不能存活。然而，这可解释为它的硫酸盐还原途径中出现其他突变。UCD939在编码亚硫酸盐还原酶的其他亚基的基因中携带两个突变，尽管它不是甲硫氨酸营养缺陷型，但加入第三个突变可能显著降低其活性，因此由于下游酶无法将其活性提高到足够补偿的水平，它变为甲硫氨酸营养缺陷型。通过含硫氨基酸调节硫酸盐还原也可能不成功，因为该菌株不再产生甲硫氨酸，并且毒性中间体可能累积到亚硫酸盐还原酶之上，也使得该菌株无法存活。
UCD522被鉴定为非整倍体菌株(Bakalinsky和Snow 1990)。对UCD522中的MET10基因进行测序时，观察到UCD522是杂合菌株，它携带两种MET10等位基因。在导致无法像其他菌株那样进行遗传操作的组分之间可能存在某种关联。MET10等位基因或其编码的蛋白质之间可能形成某种类型的复合物，如果只缺失一个等位基因，这种复合物使得它在孢子形成过程中不能适当地隔离(segregrate)。然而，当每个等位基因被单独替代时，该菌株可适当地形成孢子。UCD522MET10UCD932形成孢子，产生作为G418R/hphNT1R和甲硫氨酸营养缺陷型的两种菌株，以及对药物敏感和携带MET10等位基因的两种菌株。使每种菌株发酵至完成，其H2S特性正如所料。
实施例3：进一步鉴定UCD 932的MET10p等位基因
正如上述实施例所述，酵母菌株UCD932中存在的MET10等位基因能够将高硫化氢(H2S)生产菌株转化为不产生可检测的H2S的菌株。这一点在高产菌株UCD522和UCD950中得到明确证实，这两种菌株携带来自UCD932的MET10等位基因时不产生可检测的H2S。能将一种菌株转变为低H2S生产者对包括葡萄酒、酿造和染料乙醇工业在内的任何使用酵母的工业都有意义。除了因产生强烈的臭鸡蛋气味给最终产品带来问题以外，发酵中产生的CO2也常常是有用的副产物，其本身可作为气体出售或用作移动产物的动力气体(酿造)。因此，防止气体产生臭鸡蛋气味有明确的好处。
以前的工作确定，来自UCD932和UCD950的MET10等位基因中6个核苷酸不同，其中五个改变导致一级蛋白质序列改变(见图2)。为了进一步鉴定UCD932MET10等位基因，将MET10的天然等位基因克隆到穿梭载体pUG6中。利用快速改变PCR诱变技术制备单核苷酸改变(参见例如Cormack,B.和Castano,I.(2002)将点突变引入克隆的基因中(Introduction of Point Mutations into Cloned Genes).Methods in Enzymology(350)199-218)。在不同的反应中，利用该技术将一个核苷酸差异转变为其他等位基因的相似核苷酸。例如，UCD932MET10在404位上具有腺嘌呤，而UCD950具有胞嘧啶。发现UCD9501985位上的胞嘧啶改变为腺嘌呤对于UCD950背景中不产生硫化物是必要且充分的。(表11)UCD932等位基因中的腺嘌呤转变为950的胞嘧啶将消除UCD932蛋白消除硫化物生产的能力(表11)。因此，662位上苏氨酸单独改变为赖氨酸残基导致产生修饰的Met10蛋白，从而降低硫化物的释放。
表11
不同MET10等位基因的H2S产量
*932菌株背景具有其他H2S产量决定因素，在任何测试条件下均不产生H2S。
实施例4：MET10基因1985位上的等位基因差异决定酿酒酵母的硫化氢产量
用于等位基因置换方案以替代市售和天然的葡萄酒酵母分离物中的天然等位基因时，菌株UCD932的MET10等位基因导致无法产生硫化氢(H2S)。发现该等位基因含有导致编码蛋白氨基酸序列发生变化的几个碱基对改变。评估这些氨基酸改变，以确定哪个(些)影响产生H2S的能力。
为了鉴定导致H2S产量显著改变的准确突变或突变组合，我们克隆了UCD932和UCD950的MET10等位基因，并用定点诱变将各个单碱基差异系统地转变为相对等位基因的碱基。除了单个交换的碱基改变以外，得到的等位基因与亲本等位基因相同。然后将修饰的等位基因插回两种菌株中，并将BiGGY琼脂用作亚硫酸盐还原改变和H2S产量改变的指标。通过这种筛选，将1985位上的单碱基改变鉴定为导致菌落颜色改变的突变。在合成葡萄酒原汁中进行小规模发酵时，一式两份地检测这些菌株的H2S产量。用各个菌株接种10mL合成的葡萄酒培养基，发酵4天后用乙酸铅柱检测H2S。未改变的UCD950MET10等位基因和1985位突变为UCD950等位基因的UCD932等位基因(932MET10 1985A-C)导致产生H2S，而未改变的等位基因UCD932MET10和1985位改变为UCD932的UCD950等位基因(950MET10 1985C-A)导致产生的H2S无法检测到。这些结果说明，1985位上的单碱基改变是这些等位基因的H2S产量不同的关键决定因素。然后，通过将单突变的等位基因放入两种市售的H2S高产菌株UCD522和UCD940中检测H2S产量，证实了这些结果。这两种菌株含有932MET10 1985A-C等位基因时都产生H2S，而含有950MET10 1985C-A等位基因时检测不到H2S。结果小结于上表11。
本研究证明，MET10等位基因1985位的单碱基对改变决定硫化氢的产生。1985位的核苷酸差异改变了编码的氨基酸，因此改变编码氨基酸的周围核苷酸序列的任何改变也很可能消除H2S的产生。高产等位基因中存在的苏氨酸可用作改变该途径的信号流(the flux of the pathway)的调节点，因为含有磷酸基团的氨基酸残基可通过磷酸化调节。预计氨基酸残基662位于亚硫酸盐还原酶催化域中(图6)。对具有此种改变的蛋白质的推定结构(图7)的分析表明，该蛋白的总体结构未改变，但该残基改变周围的活性位点的局部区域受到影响。因此，这种改变仅仅略微改变了蛋白质的结构。
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