本发明属于生物
技术领域：
，筛选到一株能够抑制罗非鱼链球菌的枯草芽孢杆菌，并进行了发酵优化，制备成水剂产品和粉剂产品，并且能在水产饲料中应用。
背景技术：
：罗非鱼(tilapia)作为世界水产行业最主要的养殖品种之一，具有生长速度快、食性杂、肉质好、营养价值高、繁殖能力强等优点广泛分布于热带亚热带的淡咸水域中。我国沿海地区特别是海南、广东、福建、云南、广西等省份养殖的罗非鱼产量占世界一半以上。但是近些年来伴随着罗非鱼养殖面积和养殖密度越来越高由无乳链球菌(streptococcusagalactiae)感染引起的罗非鱼链球菌病已经成为阻碍我国罗非鱼养殖业健康持续发展的主要因素。近年罗非鱼“链球菌病”呈现出全国爆发的趋势，在每年的高温季节尤其是7-9月份，发病率在50％以上，死亡率最高可达90％以上。目前多采用抗生素来控制罗非鱼链球菌的发生和传染，这一养殖模式导致了养殖过程中抗生素滥用和残留超标的问题，严重制约了罗非鱼成品的出口和销售，成为限制罗非鱼产业发展的瓶颈问题。技术实现要素：本发明从罗非鱼的养殖环境中筛选到一株枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌能够抑制导致罗非鱼链球菌病的无乳链球菌生长，能够显著的控制罗非鱼链球菌病的发生和传染，减少抗生素使用，降低罗非鱼养殖风险，提高罗非鱼的养殖效益。首先，本发明提供一株能够抑制罗非鱼链球菌病的枯草芽孢杆菌 新菌株。本发明从罗非鱼养殖水域中分离、经定向初筛和复筛得到一株枯草芽孢杆菌。其营养细胞细杆状，其芽孢为椭圆或长杆形，孢子中生，孢囊稍膨大，后期孢子可完全脱落。在lb培养基固体平板上，12～16h内能形成菌落，菌落为圆形，或不规则，边缘毛发状，菌落土黄色，不透明，无褶皱。革兰氏阳性。利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行pcr鉴定：按细菌dna提取试剂盒操作说明书提取模板dna。使用16srrna保守序列的上游引物5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno.2)和下游引物5’-ggttaccttgttacgactt-3’(seqidno.3)扩增细菌16srrna基因片段。经过测序得到该菌属于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，扩增片段的测序结果见seqidno.1。利用lb培养基:胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，对得到的枯草芽孢杆菌cd10进行了抑菌性、耐温性能、发酵特性实验。在平板测试过程中，发现cd10能够显著抑制无乳链球菌的生长，形成显著透明抑制圈。cd10芽孢耐温性能良好，芽孢在85℃水浴10min，芽孢存活率80％以上。将筛选到的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)命名为cd10，于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmccno.12195。本发明还提供该枯草芽孢杆菌的高密度发酵培养基，其含有kh2po40.8～1.5g/l，蔗糖2～4g/l，豆饼粉8～12g/l，feso40.25～0.5g/l，caco31～3g/l，mgso42.5～3.5g/l，玉米面3～5g/l，鱼粉6～10g/l，消泡剂0.05～0.1％，初始ph7.0～7.5。优选的，所述的高密度发酵培养基含有kh2po41.0g/l，蔗糖3g/l，豆饼粉10g/l，feso40.30g/l，caco31.5g/l，mgso43.0g/l， 玉米面4g/l鱼粉8g/l，消泡剂0.05％，初始ph7.5。本发明还提供所述枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，其包括如下步骤：种子液按1-3％的接种量接种到所述的发酵培养基中，温度30～37℃，转速200～400r/min，罐压0.05mpa，通气比1：0.5～0.7，发酵时间12～16h，得芽孢生成率90％以上，活菌数为109～1010cfu/ml的枯草芽孢杆菌发酵液。本发明还提供一种抑制罗非鱼链球病的微生态制剂，其含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmccno.12195的菌粉，其活菌数为1010～1011cfu/g。其中，所述的菌粉制备方式如下：将所述枯草芽孢杆菌的高密度发酵液加入cacl2和na2hpo3沉降后加入10％(质量分数)硅藻土，通过隔膜压滤机，过滤掉发酵液，进行闪蒸干燥，干燥条件为：进风温度115～125℃，出口温度70～85℃，菌粉细度200目通过率80％。将本发明开发粉剂产品添加到罗非鱼颗粒料中，提高罗非鱼对链球菌病的抵抗能力。因此，本发明还提供含有所述的枯草芽孢杆菌菌粉的罗非鱼饲料，所述枯草芽孢杆菌菌粉的添加量为0.5～5‰，其中，所述的枯草芽孢杆菌的活菌数为1010～1011cfu/g。本产品制备的菌粉可做为饲料添加剂制备罗非鱼颗粒料，能够提高罗非鱼对无乳链球菌病的抵抗力。本发明的微生态制剂产品能够作为饲料添加剂成分，添加到饲料加工过程中，具有应用方便的特性。使用本发明开发的罗非鱼微生态饲料不仅能够提高罗非鱼对无乳链球菌的抗病能力，使罗非鱼的死亡率降低，而且能够提高鱼体对饲料的转换利用率，降低料肉比，提升养殖经济效益。具体实施方式通过以下实施例对本发明的筛选方法、制备工艺和应用进行详述，所述说明是描述性的，并不限制本发明的保护范围。实施例1枯草芽孢杆菌cd10的抑制无乳链球菌实验方法1)无乳链球菌的培养方法液体培养基：蛋白胨10.0g/l，脱水小牛脑浸粉12.5g/l，脱水牛心浸粉5.0g/l，氯化钠5.0g/l，葡萄糖2.0g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，ph7.5。固体培养基：蛋白胨10.0g/l，脱水小牛脑浸粉12.5g/l，脱水牛心浸粉5.0g/l，氯化钠5.0g/l，葡萄糖2.0g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，ph7.5，琼脂粉1.5％。2)筛选平板制作将平板上的无乳链球菌单菌落接种于液体培养基，25℃培养16h。将培养好的发酵液在无菌条件下按照10％的比例倒入灭菌后冷却到40～45℃固体培养基中，混匀，倒于无菌平板中，30ml/平板，冷却凝固待用。3)牛津杯法筛选枯草芽孢杆菌将无菌的牛津杯置于方法2)制备的平板上，将cd10lb培养基发酵液200μl添加到牛津杯中，37℃培养16h，观察抑菌圈情况。通过以上方法，可以看到在含有cd10的牛津杯周围具有显著的透明抑制圈，抑菌圈直径10～18mm。实施例2枯草芽孢杆菌cd10发酵上清液最低抑菌浓度的测定1)枯草芽孢杆菌cd10发酵液上清液的制备方法将cd10接种于含有25mllb培养基的100ml三角样品中，37℃培养24h，取10ml发酵液，5000r/min离心机，离心15min，收集不含有菌体的上清液。2)不同浓度cd10发酵液上清液的制备取5支玻璃试管，分别标记为0，1，2，3，4，每支试管中，加入1ml离心后不含菌体的上清液，1号试管加入纯净水1ml，2号试 管加水2ml，3号试管加入纯净水3ml，4号试管加水4ml。1，2，3，4号试管上清液浓度分别被稀释2倍，3倍，4倍，5倍。3)枯草芽孢杆菌cd10发酵上清液最低抑制浓度的测定按照实施例1的方法，测定不同稀释浓度下对无乳链球菌的抑制，实验结果如下。表1cd10发酵上清液最低浓度的测定从表1可以看出，cd10的发酵上清液具有优异的抑制无乳链球菌的效果，稀释3倍仍然具有抑菌效果。实施例3枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌菌种接种于lb平板培养基上，于37℃培养24h，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，37℃培养24h；2)一级种子的制备：将步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌种转接茄子瓶lb斜面培养基上，37℃培养24h，使处于对数后期，得一级种子；3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有60llb种子培养基的100l种子罐中，温度37℃，转速200r/min，罐压0.05mpa，通风比：1：0.6培养14h,得二级种子液。4)枯草芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按1％的接种量接种到600l发酵培养基的1m3发酵罐中，温度30℃，转速200r/min，罐压0.05mpa，通风比1：0.6，培养16h，得芽孢生成率90％以上，活菌数为8×109cfu/ml的枯草芽孢杆菌发酵液；所述的发酵培养基为(质量百分比)：kh2po41.0g/l，蔗糖3g/l， 豆饼粉10g/l，feso40.30g/l，caco31.5g/l，mgso43.0g/l，玉米面4g/l鱼粉8g/l，消泡剂0.05％，初始ph7.5。实施例4粉剂微生态的制备1)发酵菌体浓缩：生产的发酵液添加1％(质量分数)氯化钙和1％(质量分数)磷酸氢二钠，混合均匀后，沉降10～15min，添加10％硅藻土，搅拌均匀。利用隔膜泵将搅拌液打入隔膜压滤机，进行板框压滤操作。制得含水量50％～60％滤饼。2)闪蒸干燥条件：进风温度115～125℃，出风温度70～80℃，，通过控制进料速度来实现出风温度的稳定，菌粉细度：200目筛子通过率80％以上。3)菌粉制备：将方法1)制备的混合液按照方法2)闪蒸干燥条件，制备成含水量4～6％的菌粉，活菌数含量1010cfu/g。实施案例5添加cd10罗非鱼饲料中活菌检测方法及结果1)含有cd10饲料制备方法：将cd10菌粉按照0.1％的添加量，添加到饲料中进行混合制粒。取调制和饲料成品样品进行活菌数量检测。2)活菌检测方法：取1g样品加入装有99ml无菌水的三角瓶中，将所述三角瓶置于37℃摇床上震荡30min得到样品悬液，将悬浮液样品至于85℃水浴中15min，然后将样品悬液用无菌水进行10倍梯度稀释，选取合适的稀释梯度涂布到lb营养琼脂培养基上，放入37℃恒温箱中倒置培养16小时后平板上长出可见菌落，计算获得该样品中的活菌数量。3)活菌检测结果表2.饲料中活菌检测结果从表2检测结果可以看出，在加工过的饲料中能够检测到添加的cd10，并且活菌在106cfu/g以上。在检测过程，通过80℃水浴15min的处理，仍能检测到活菌数量，说明添加到饲料中的cd10主要是以耐热芽孢的形式存在。芽孢是微生态一种特殊存在状态，具有耐热、抗逆性强的特点，这有利于提高饲料品质的稳定性，延长饲料保质期。实施例6含有cd10粉剂的罗非鱼饲料在养殖中的应用对照塘和试验塘各两口，面积20亩，水深1.5米。罗非鱼品种吉富，2000尾/亩，实验周期45天。对照塘饲喂基础日粮。试验塘为含有cd10菌粉的饲料，按照实例4制得的粉剂产品按照0.1％的比例添加到罗非鱼基础日粮当中。按照上述方法制得的罗非鱼颗粒饲料中cd10活菌数>106cfu/g。罗非鱼饲喂方法：每日早晚饲喂一次，对照塘和试验塘投喂饲料量相同。打样测定方法：每口池塘打样20条，测定重量，每15天测定一次，并统计鱼类死亡情况。表3罗非鱼增重统计由表3可知，用含有cd10粉剂的饲料饲喂罗非鱼，可以提高养殖过程中鱼体增重量，降低料肉比，提高饲料转化率。实施例7无乳链球菌感染攻毒试验1)无乳链球菌悬浮液的制备：按照实施例1无乳链球菌液体培养方法制备无乳链球菌的培养液，用无菌生理盐水稀释活菌数到1.0～3.0×109cfu/ml。2)从开展试验之前的实施例6中提及的对照塘1、对照塘2和试验塘1、试验塘2各捞取50条饲喂45天的罗非鱼，将对照塘和试验塘各自混合，分开喂养在5立方的水泥池中。3)感染攻毒试验：在两个水泥池中分别加入50ml步骤1)制备的无乳链球菌悬浮液，使水泥池中无乳链球菌的浓度达到1.0～3.0×107/l，水温控制在28～30℃，饲喂10天，统计罗非鱼死亡情况。表4感染攻毒试验统计表序号组别死亡数量(条)死亡率1对照组99％2试验组7878％由表4可知，通过饲喂含有添加cd10饲料的罗非鱼能够有效预防无乳链球菌感染，减少链球菌病发病，降低死亡率。由此可见，本发明的微生态制剂产品不但安全而且能够显著促进水产动物的个体增重，提高单位面积产量和总量，从而增加水产养殖的收入，提高效益。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12