分裂的海肾荧光素酶和HBC的融合蛋白及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种融合蛋白，具体涉及一种分裂的海肾荧光素酶和HBC的融合蛋白及其应用。
背景技术：
：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，其涉及范围广泛，全球有近4亿慢性感染患者，而慢性HBV感染可以导致肝硬化、肝细胞癌等严重后果，每年因此死亡者近百万。HBV为直径42nm的球形颗粒，呈双层壳结构，外壳主要由三种表面蛋白(HBs)构成，内层核衣壳由核心蛋白(HBC)组成，为正20面体结构，该结构包含90或120个HBC二聚体，每个二聚体由HBC单体通过二硫键连接。HBC有183个氨基酸组成，三维结构上，形成4个α螺旋(aa13－30，aa50－60－78，aa82－93－110，aa112－123－128)。HBC在HBV复制过程中必不可少，它所构成的核衣壳是包装pgRNA和病毒聚合酶的场所，另外，HBC还介导病毒基因组DNA进入细胞核，继而生成cccDNA作为复制的初始模板。HBC二聚体是形成核衣壳的基础，核衣壳的大小约23nm，可以通过电子显微镜直接观察到，也可以通过非变性琼脂糖凝胶电泳结合Westernblot来检测。虽然原核表达的HBC，其二聚体可以通过HPLC检测到，然而，在肝癌细胞系中表达形成的HBV二聚体，由于是一种过渡状态，迄今尚无合适检测手段。这造成两种局面，一是在基础研究方面，有关HBC二聚体形成的条件和机制难以解析，二是在药物开发方面，缺乏靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型。融合蛋白是指利用基因工程技术，将两种或两种以上在自然状态下互相分离的蛋白质融合到一起，被融合的各个部分都处在同一条氨基酸链上，作为一个整体进行表达。融合蛋白在生命科学相关研究领域及生物产业均有广泛用途。将两种蛋白质融合表达，通常的方法是将编码这两种蛋白的DNA序列按顺序连接在一起，形成一个融合的DNA分子，将该DNA分子转入细胞后，在真核启动子的驱动下，即可转录出相应的mRNA，继而以这些mRNA为模板，利用细胞的翻译机器产生融合蛋白。海肾荧光素酶(Rluc)是一种从海洋动物海肾中分离到的蛋白质分子，能催化腔肠荧光素发生化学反应，从而发出绿色荧光。Rluc全长311个氨基酸，重组表达的Rluc常用作报告基因，广泛用于生物医学研究。前人研究证明，将Rluc从第229位氨基酸分成N、C两段以后，各自将失去催化活性，但若通过某种手段将两段复合后，则能部分恢复其酶活性。利用这一特性，这种分裂的Rluc可被用来指示蛋白分子间的相互作用。技术实现要素：本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种分裂的海肾荧光素酶和HBC的融合蛋白以及其在指示HBC二聚体是否形成以及形成量上的应用。本发明一方面提供了一种分裂的海肾荧光素酶和HBC的融合蛋白，该融合蛋白为将海肾荧光素酶从N端的第1至229位氨基酸与乙肝病毒核心蛋白通过接头连接得到，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。本发明的另一方面提供了一种分离的核酸序列，所述核酸序列为编码SEQIDNo:1所示的融合蛋白的核酸序列，其序列如SEQIDNo:2所示。本发明的另一方面提供了一种分裂的海肾荧光素酶和HBC的融合蛋白，该融合蛋白为将海肾荧光素酶从N端的第229至311位氨基酸与乙肝病毒核心蛋白通过接头连接得到，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。本发明的另一方面提供了一种分离的核酸序列，所述核酸序列为编码SEQIDNo:3所示的融合蛋白的核酸序列，其序列如SEQIDNo:4所示。本发明的另一方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有SEQIDNo:2或4所述的核酸序列。本发明的另一方面提供了一种如SEQIDNo:1或3所示的融合蛋白在指示乙肝病毒核心蛋白二聚体是否形成以及形成量中的应用。本发明建立了一种能指示HBC二聚体形成的新方法，本方法的核心策略是：利用两个乙肝病毒核心蛋白单体形成二聚体后，物理距离将非常靠近这一原理，将蛋白单体带上一种距离敏感的信号(分裂的海肾荧光素酶)，使得当两个单体距离较远时不发出信号，仅当其足够靠近时才能发出信号，那么这种信号就可以用来指示蛋白二聚体的形成情况。本发明利用了分裂的海肾荧光素酶。海肾荧光素酶(Rluc)是一种从海洋动物海肾中分离到的蛋白质分子，能催化腔肠荧光素发生化学反应，从而发出绿色荧光。Rluc全长311个氨基酸，重组表达的Rluc常用作报告基因，广泛用于生物医学研究。前人研究证明，将Rluc从第229位氨基酸分成N、C两段以后，各自将失去催化活性，但若通过某种手段将两段复合后，则能部分恢复其酶活性。利用这一特性，这种分裂的Rluc可被用来指示蛋白分子间的相互作用。本发明中，我们将海肾荧光素酶(Rluc)基因分为N(1-229aa)，C(229-311aa)两段，分别与核心蛋白基因通过长片段接头融合，构建了两种分别表达RlucN-HBC，RlucC-HBC的重组质粒。实验证明，RlucN-HBC及RlucC-HBC可形成二聚体，其发光信号可以反映二聚体的形成情况。本发明的有益效果是：建立了一种能指示HBC二聚体是否形成的新方法，为HBC二聚体形成的相关基础研究提供了一种新方式。乙肝病毒的复制必须依赖HBC二聚体的形成，若能阻止HBC二聚体的形成，则能有效地阻止乙肝病毒的复制，那么可以开发阻止HBC二聚体形成的药物来治疗乙肝，而本发明则为抗HBC二聚体形成的药物筛选的细胞模型的建立奠定了重要基础，可以用于构建药物筛选的细胞模型，在乙肝病毒相关科学研究以及抗病毒药物筛选方面有良好的应用价值。附图说明图1是质粒GG1的结构示意图。图2是质粒RlucN-HBC、RlucC-HBC、RlucN-dHBC和RlucC-dHBC的结构示意图。图3是融合蛋白共转染后的荧光素酶活性检测结果图。图4是融合蛋白相互作用的原理示意图。图5是融合蛋白是否能形成核衣壳的检测结果图。图6是不同融合蛋白组合共转染后的荧光素酶活性检测结果图。具体实施方式本发明实施例中所用试剂来源如下：2×PrimeSTARHSMix：Takara公司，日本胶回收试剂盒：QIAGEN公司，德国模板PLR-TK、JM109感受态细菌、荧光素酶检测试剂盒：Promega公司，美国BsmBI、Tangobuffer、DTT：Thermoscientific公司，美国T7ligase：Enzymatics公司，美国ATP：NewEnglandBiolabs公司，美国HEK293细胞：美国模式菌种收集中心3xflag标签抗体：Sigma公司，美国3xHA标签抗体：Abcam公司，美国本发明实施例中所用扩增引物序列如下：实施例一、质粒RlucN-HBC的构建RlucN-HBC表达一个乙肝病毒核心蛋白与海肾荧光素酶N端229个氨基酸的融合蛋白，二者之间由长度为94个氨基酸的G4S接头(命名为94G4S接头)相连，94G4S接头的氨基酸序列为：SSGS(GGGGS)×18。质粒RlucN-HBC的具体构建过程如下：1.过渡载体质粒GG1的构建质粒GG1是一个方便后续克隆操作的过渡载体，其结构如图1所示，GG1含有94G4S接头序列，且94G4S序列的上游带有一段便于PCR扩增94G4S的引物序列。其构建过程为：以质粒GFP-92G4S-HBC(该质粒及其构建方法已在专利申请CN201510076239.1中公开，与该专利申请中的GFP-92G4S-HBc是相同的)为模板，进行PCR扩增，反应体系为：质粒GFP-92G4S-HBC10ng，引物Fg4s1(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃2min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag1。扩增另一个片段，反应体系为：模板GFP-92G4S-HBC10ng，Famp1(10μM)及RBsmb1(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag2。将以上得到的两个片段frag1、frag2做Goldengate连接反应，反应体系为：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag12μl(80ng)frag22μl(100ng)ddH2O补齐至10μl总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。Goldengate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒GG1，其结构如图1所示。2.质粒RlucN-HBC的构建进行PCR扩增，反应体系为：模板PLR-TK10ng，引物FrlucNGG(10μM)及RrlucNGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag3。扩增另一个片段，反应体系为：质粒GG110ng，引物F2nd(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag4。再扩增一个片段，反应体系为：质粒GG110ng，引物Famp1(10μM)及RBsmb1(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag5。将以上得到的3个片段frag3、frag4、frag5做Goldengate连接反应，反应体系为：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag31μl(70ng)frag42μl(90ng)frag52μl(100ng)ddH2O补齐至10μl总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。Goldengate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒RlucN-HBC，其结构如图2中所示。质粒RlucN-HBC中除了骨架结构后，还含有编码海肾荧光素酶从N端的第1至229位氨基酸与乙肝病毒核心蛋白通过94G4S接头连接得到的融合蛋白的核酸序列，该核酸序列如SEQIDNo:2所示，其编码的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。实施例二、质粒RlucC-HBC的构建质粒RlucC-HBC表达一个乙肝病毒核心蛋白与海肾荧光素酶C端83个氨基酸(第229-311位氨基酸)的融合蛋白，二者之间由94G4S接头相连，具体构建过程如下：进行PCR扩增，反应体系：模板PLR-TK10ng，引物FrlucCGG(10μM)及RrlucCGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag6。将frag6和实施例一中得到的frag4、frag5这3个片段做Goldengate连接反应，反应体系：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag61μl(60ng)frag42μl(90ng)frag52μl(100ng)ddH2O补齐至10μl总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。Goldengate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒RlucC-HBC，其结构如图2中所示。质粒RlucC-HBC中除了骨架结构后，还含有编码海肾荧光素酶从N端的第229至311位氨基酸与乙肝病毒核心蛋白通过94G4S接头连接得到的融合蛋白的核酸序列，该核酸序列如SEQIDNo:4所示，其编码的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。实施例三、质粒RlucN-dHBC和RlucC-dHBC构建RlucN-dHBC和RlucC-dHBC是分别在RlucN-HBC和RlucC-HBC的基础上，去除HBC序列，仅保留RlucN-49G4S和RlucC-49G4S，这两个质粒将作阴性对照用。其构建采用单个片段Goldengate连接策略，具体过程如下：片段扩增反应体系：模板RlucN-HBC10ng，引物Fsv4GG2(10μM)及Rg4sGG2(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag7。得到的片段frag7做自身Goldengate连接反应，反应体系：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag72μl(80ng)ddH2O补齐至10μl总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。Goldengate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为RlucN-dHBC。RlucC-dHBC的构建方法除了扩增模板为RlucC-HBC以外，其余均与以上构建RlucN-dHBC的方法相同。RlucN-dHBC和RlucC-dHBC的结构如图2中所示。实施例四、RlucN-HBC与RlucC-HBC共转染可恢复Rluc活性的验证如果RlucN-HBC与RlucC-HBC之间形成了二聚体，我们预期应该可以检测到Rluc酶活性(也就是加底物后发光)，而未形成二聚体的RlucN-HBC或者RlucC-HBC不应有显著Rluc活性。为了验证这些假设，我们将前述构建好的质粒RlucN-HBC与RlucC-HBC共转染HEK293细胞48小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。结果如图3所示：与三种对照组RlucC-dHBC+RlucN-dHBC，RlucC-HBC+RlucN-dHBC，RlucC-dHBC+RlucN-HBC相比，RlucC-HBC+RlucN-HBC所产生的荧光素酶活性高出25倍以上，提示RlucC-HBC与RlucN-HBC的确有相互作用，而对照组中，由于RlucN或者RlucC缺少HBC，因而不能与另一种HBC重组体相互作用形成二聚体，也只有背景水平的Rluc活性。本实验结果符合如图4所示的工作原理模型。实施例五、RlucN-HBC与RlucC-HBC可形成杂合核衣壳的验证RlucN-HBC与RlucC-HBC可形成异源二聚体，并且因此恢复分裂Rluc的酶活性。我们想知道，RlucN-HBC及RlucC-HBC是否保留了核衣壳形成的能力。为此，我们首先构建了质粒3xflag-RlucN-C(RlucN-HBC的N端加上3xflag标签)，3xHA-RlucC-C(RlucC-HBC的C端加上3xHA标签，3xHA-RlucC-GFP(3xHA-RlucC-C中的HBC替换为EGFP)，3xflag-RlucN(3xflag-RlucN-C中的HBC被去除)；然后以合适方式转染或共转染，再检测细胞中核衣壳的形成情况。实验结果显示(如图5所示)，RlucN-HBC与RlucC-HBC各自均能形成核衣壳，而多种阴性对照不能形成核衣壳。实施例六、Rluc活性恢复不依赖于核衣壳的形成的验证前述实验表明，RlucN-HBC与RlucC-HBC共转染时，能恢复Rluc酶活性，这种酶活性依赖于RlucN-HBC与RlucC-HBC间的异源二聚体的形成，但Rluc酶活性是否也可能部分或者完全依赖于核衣壳的形成？是否部分光信号，来自核衣壳上相邻的两种同源二聚体？为了回答这个问题，我们根据文献，构建了几种突变体，即RlucN-HBC127Q，RlucC-HBC127Q，RlucN-HBC132A，RlucC-HBC132A，这几种突变体中，分别带有HBC第127位氨基酸和132位氨基酸突变。前人研究显示，带有127Q或者132A突变的HBC，不能形成核衣壳，但能形成二聚体。如果核衣壳上相邻的两种同源二聚体也能贡献部分光信号的话，那么，这些不能形成核衣壳的突变体共转染时所产生的光信号应该降低。然而，细胞转染实验显示，无论是RlucN-HBC127Q+RlucC-HBC127Q，或者是RlucN-HBC132A+RlucC-HBC132A共转染，其产生的光信号与野生型RlucN-HBC+RlucC-HBC相比，均没有降低(如图6所示)，这表明RlucN-HBC+RlucC-HBC共转染时的光信号，应来源于异源二聚体，而不是核衣壳上的相邻同源二聚体。当前第1页1 2 3