本发明涉及一种具有生物活性功能的大豆糖肽及其制备方法，特别是涉及具有抗氧化活性和抑菌活性的大豆糖肽及其制备方法。
背景技术：
大豆蛋白是一种优质的蛋白质资源，来源广泛，价格低廉，是亚洲的传统食品，尤其在保障我国膳食蛋白质供给方面发挥着重要的作用。蛋白质的糖基化修饰是将亲水性的糖类物质以共价键连接的方式连接到蛋白质分子之中，使其既具有蛋白质的大分子特性，又具有糖类物质的亲水特性。美拉德反应途径的糖基化，可以改善蛋白质的功能性质，但存在反应周期长、产品褐变、营养损失和安全隐患等缺陷。
采用转谷氨酰胺酶不仅能够催化蛋白质分子的赖氨酸残基的-NH2与谷氨酰胺残基之间发生交联反应，制得交联蛋白质，还能催化伯胺物质的-NH2与蛋白质分子谷氨酰胺残基之间发生交联反应。利用转谷氨酰胺酶将壳寡糖（基本单位是D-氨基葡萄糖，伯胺类物质）与大豆蛋白分子连接，实现了大豆蛋白的糖基化修饰，即可以制备大豆糖蛋白。相比之下，该反应具有专一性强、无副反应、食品安全性高的优点。
目前，利用该酶制备糖蛋白的研究仅局限于几个课题组在研究。多数为改善蛋白质的功能性质，提高其作为功能性配料的可行性,如Zhao教授带领的课题组和Betti教授带领的课题组利用该酶的催化作用，将氨基葡萄糖导入到多种蛋白质中制备糖蛋白，如有动物蛋白（酪蛋白、肌动球蛋白），植物蛋白（大豆分离蛋白）；一些也旨在增强蛋白质的生物活性，Betti教授带领的课题组分别将鱼明胶蛋白水解物和小麦面筋蛋白水解物与氨基葡萄糖发生交联，增强明胶肽及小麦肽的抗氧化及抑菌活性。可以看出，除了食源性糖肽，利用酶法定向制备糖肽，可为改善人类的膳食结构，调整提供新的基础理论依据，通过它们的有益作用来维护人类的健康和生活幸福。
转谷氨酰胺酶是一种微生物蛋白酶，通过分子插入、交联反应、脱氨作用，使蛋白质分子结构发生变化。Alcalase碱性蛋白酶是由选育出的地衣芽孢杆菌生产而得，是一种高效的细菌蛋白酶，属于内切蛋白酶，主要作用于含疏水性羧基的肽键。Protamex复合蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶，属于内切蛋白酶。这三种酶均已工业化生产，价格便宜，适合大豆糖肽的工业化生产的要求。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有生物活性功能的大豆糖肽及其制备方法，该方法利用糖基化大豆蛋白制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽。
本发明所采用的技术方案是：
首先，制备糖基化大豆蛋白：
第一步：取大豆分离蛋白粉1kg，按固液比为0.4~0.6:10将其分散于水中，得到蛋白质分散液；所述的固液比中固体用量为千克，液体用量单位为升；
第二步：所得蛋白质分散液在90℃水浴加热10分钟，之后冷却至40℃；对加热处理的大豆蛋白分散液加入等体积的pH 7.5壳寡糖溶液，其中壳寡糖与大豆蛋白以质量比1: 0.50；
第三步：搅拌均匀后，加入转谷氨酰胺酶，每公斤蛋白质加入10g转谷氨酰胺酶，酶活力为1000U/g，搅拌均匀后，37℃振荡3小时后，85℃加热处理5分钟，冷却。
第四步：调节溶液pH至4.5，4000 r/min离心10 min，收集沉淀，水洗两次。
利用糖基化大豆蛋白分别制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽：
制备具有抗氧化活性的糖肽：
第一种：
将糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至8.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入Alcalase碱性蛋白酶，按每公斤蛋白质加入1g Alcalase碱性蛋白酶，搅拌均匀后，60℃条件下振荡2小时；大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二种：
将沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至7.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入Protamex复合蛋白酶，每公斤蛋白质加入10g Protamex复合蛋白酶，搅拌均匀后，55℃振荡2小时。大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。
经Alcalase碱性蛋白酶水解所得的糖肽，水解度为4%，2mg/mL的抗氧化活性：DPPH自由基清除率为59.5%；羟基自由基清除率为38.4%；
经Protamax复合蛋白酶水解所得的糖肽的抗氧化活性：DPPH自由基清除率大于50%；羟基自由基清除率大于35%。
制备具有抑菌活性的糖肽：
第一种：
将糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至2.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入胃蛋白酶，每公斤蛋白质加入2g胃蛋白酶，搅拌均匀后，37℃振荡2小时；大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二种：
将沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至8.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入胰蛋白酶，每公斤蛋白质加入10g胰蛋白酶，搅拌均匀后，37℃振荡2小时。大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。
本发明的有益效果是：采用一种专一性强、无副反应、安全性高的酶（转谷氨酰胺酶）催化的方法将亲水性的壳寡糖分子共价交联到大豆蛋白分子中，制备糖蛋白。并通过食品级蛋白酶（碱性蛋白酶蛋白酶/复合蛋白酶）。这些反应都有利于提供更多的电子供体和氢供体，而增强大豆蛋白的氧化性质。胃蛋白酶/胰蛋白酶降解糖基化大豆蛋白后，所得糖肽能够起到抑菌作用，尤其对革兰氏阳性菌更加有效,浓度为2 mg/mL（水解度为4%）时，抑制大肠杆菌的能力达到90%以上。这将丰富食源性糖肽的来源，对开发食源性糖肽具有推动作用。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种具有生物活性功能的大豆糖肽及其制备方法，该具有生物活性功能的大豆糖肽及其制备方法利用糖基化大豆蛋白制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽。
本发明所采用的技术方案是：
首先，制备糖基化大豆蛋白：
第一步：取大豆分离蛋白粉1kg，按固液比为0.6:10将其分散于水中，得到蛋白质分散液；所述的固液比中固体用量为千克，液体用量单位为升；
第二步：所得蛋白质分散液在90℃水浴加热10分钟，之后冷却至40℃；对加热处理的大豆蛋白分散液加入等体积的pH 7.5壳寡糖溶液，其中壳寡糖与大豆蛋白以质量比1: 0.50；
第三步：搅拌均匀后，加入转谷氨酰胺酶，每公斤蛋白质加入10g转谷氨酰胺酶，酶活力为1000U/g，搅拌均匀后，37℃振荡3小时后，85℃加热处理5分钟，冷却。
第四步：调节溶液pH至4.5，4000 r/min离心10 min，收集沉淀，水洗两次。
利用糖基化大豆蛋白分别制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽：
实施例1
制备具有抗氧化活性的糖肽：
第一种：
将糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至8.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入Alcalase碱性蛋白酶，按每公斤蛋白质加入1g Alcalase碱性蛋白酶，搅拌均匀后，60℃条件下振荡2小时；大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二种：
将沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至7.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入Protamex复合蛋白酶，每公斤蛋白质加入10g Protamex复合蛋白酶，搅拌均匀后，55℃振荡2小时。大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。
经Alcalase碱性蛋白酶水解所得的糖肽，水解度为4%，2mg/mL的抗氧化活性：DPPH自由基清除率为59.5%；羟基自由基清除率为38.4%；
经Protamax复合蛋白酶水解所得的糖肽的抗氧化活性：DPPH自由基清除率为50.4%；羟基自由基清除率为37.7%。
实施例2
制备具有抑菌活性的糖肽：
第一种：
将糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至2.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入胃蛋白酶，每公斤蛋白质加入2g胃蛋白酶，搅拌均匀后，37℃振荡2小时；大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二种：
将沉淀物分散于水中，得到蛋白质分散液，调节分散液pH 至8.0，固液比为0.4:10；所述的固液比中固体用量为大豆蛋白重量，千克，液体用量单位为升；搅拌均匀后，加入胰蛋白酶，每公斤蛋白质加入10g胰蛋白酶，搅拌均匀后，37℃振荡2小时。大豆蛋白酶解反应结束后，85 ℃灭酶5 min，冷却。调整溶液的pH至7.0。
浓缩：将上述滤液用蒸发器浓缩至固形物25-55%。喷雾干燥：入口温度为110℃，入料流速为15%，抽气量为80%，在此条件下，大豆肽的回收率≧50%。