本发明涉及梳唇石斛的分子特异性标记引物，以及利用该引物对梳唇石斛进行鉴别和检测的方法。
(二)
背景技术：
石斛(D.orchids)，又名石斛兰，是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物，广泛分布于亚州和大洋州的中国、日本、菲律宾、泰国、印度、马来西亚、澳大利亚和新西兰等国，约有1000多个种，我国有74种和2个变种。石斛作为一种优良的药用植物，具有较高的药用及保健价值，最早见于《山海经》，药用始载于《神农本草经》，其后被《本草纲目》等历代本草录述，具有“主伤和，除痹，下气，补五藏虚劳赢瘦，强阴，厚肠胃，轻身，延年”等功效。
药用植物种质资源是中药生产的源头，是进行中药材品种改良、新品种培育及遗传工程的物质基础，尤其是野生近缘植物和古老的地方种是长期自然选择和人工选择的产物，具有独特的优良性状和抵御自然灾害的特性。随着石斛的传统功效不断被人们通过现代药理研究和临床疗效所肯定，石斛产品越来越受到消费者推崇，以石斛为原料的药品和保健品也逐步开发并进入市场，据浙江省中药材产业协会铁皮石斛分会统计，2013年全省石斛相关产业总产值达30亿元，2015年达到40亿元。为保障石斛产业又好又快发展，要充分认识石斛品种对发展石斛产业的重要性，必须加快石斛优良种苗发展和强化质量管理。对石斛种苗质量的监督管理要着力解决目前生产上石斛种苗的混乱局面，并首先从技术层面上对石斛品种进行鉴别保护。
对石斛品种的鉴别主要依据表观特征，但由于许多形态性状鉴定的周期长、受环境影响大，并且品种数量不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。自本世纪以来，一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repea，简单序列重复区间扩增多态性)和SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)相继用于石斛的种质资源遗传多样性、遗传距离研究，但对于分子标记与石斛性状的连锁、石斛品种间的分子鉴别研究很少，况且这些分子标记所采用的或为通用随机引物或为成套设计引物的随机组合，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴定。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region，特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，迄今为止，尚未有SCAR标记应用于石斛品种鉴别的研究报道。
(三)
技术实现要素：
本发明目的提供梳唇石斛(Dendrobium strongylanthum Rchb.f.)的分子特异性标记引物，以及一种能对梳唇石斛进行快速鉴定的方法。
本发明采用的技术方案是：
梳唇石斛的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：
上游引物：5′-AGCGGCCGCGTGGTACAC-3′
下游引物：5′-GTGTACCACGCGGCCGCT-3′。
该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，获得梳唇石斛的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对梳唇石斛进行PCR扩增，可获得300bp多大小的特异性片段。
本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对梳唇石斛进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测石斛品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果仅出现约300bp大小的特异DNA条带，则待测石斛品种为梳唇石斛，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物：5′-AGCGGCCGCGTGGTACAC-3′
下游引物：5′-GTGTACCACGCGGCCGCT-3′。
所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
本发明所述PCR反应体系组成如下：
Master Mix PCR Buffer 终浓度为1×
上、下游引物 各0.4μM
模板DNA 60ng
余量为ddH2O；
Master Mix PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/2的2×Master Mix PCR Buffer。2×Master Mix PCR Buffer试剂选用Bioteke corporation(PR1702)。
所述PCR扩增条件如下：95℃预变性4min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后于72℃补平5min，终止温度为4℃。
具体的，所述方法如下：
(1)取待测石斛叶片，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测石斛叶片的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系每25μl组成如下：
2×Master Mix PCR Buffer 12.5μl
10μM上、下游引物 各1μl
20ng/μl模板DNA 3μl
ddH2O补足至25μl；
PCR反应条件如下：
95℃预变性4min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后于72℃补平5min，终止温度为4℃；
(3)取步骤(2)扩增产物5μl，与1μl 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，EB染色通常在含0.5μg/m1EB的水溶液中染色30分钟后，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现300bp的DNA条带，则待测样品为梳唇石斛。
本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对梳唇石斛进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别石斛品种所不能替代的分子手段。
(四)附图说明
图1为对石斛品种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；箭头所指为从编号为13的石斛品种扩增出的分子量为300bp多大小的特殊DNA条带；其余编号为其它的石斛品种。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)石斛品种基因组DNA的提取：取待测石斛品种幼嫩叶片0.01g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得石斛的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer，杭州，中国)后，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro，GE Healthcare)来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：上游引物5′-AGCGGCCGCGTGGTACAC-3′和下游引物5′-GTGTACCACGCGGCCGCT-3′，由杭州擎科工程技术有限公司合成。
(3)SCAR分子标记的PCR扩增：
PCR反应体系每25μl组成如下：
2×Master Mix PCR Buffer 12.5μl
10mM特异引物对各1μl
20ng/μl模板DNA3μl
ddH2O补足至25μl。
扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。PCR扩增条件如下：95℃预变性4min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后于72℃补平5min，终止温度为4℃。
(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5ul，与1ul 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/m1EB的水溶液中染色30分钟，然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。
按照上述方法，(编号1～10代表石斛品种依次为：1：长苏石斛(Dendrobium brymerianum Rchb.f.)；2：翅萼石斛(Dendrobium cariniferum Rchb.f.)；3：鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)；4：晶帽石斛(Dendrobium crystallinum Rchb.f.)；5：齿瓣石斛；6：串珠石斛(Dendrobium devonianum Paxt.)；7：尖刀唇石斛(Dendrobium heterocarpum Lindl.)；8：喇叭唇石斛(Dendrobium lituiflorum Lindl.)；9：杓唇石斛(Dendrobium moschatum(Buch.-Ham.)Sw.)；10：束花石斛(Dendrobium chrysanthum Lindl.)；11：肿节石斛(Dendrobium pendulum Roxb.)；12：报春石斛(Dendrobium primulinum Lindl.)；13：梳唇石斛(Dendrobium strongylanthum Rchb.f.)；14：球花石斛(Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f.)；15：长距石斛(Dendrobium longicornu Lindl.)；16：紫菀石斛(Dendrobium transparens)；17：假竹石斛(购自云南德宏热带农业科学研究所)；18：金钗石斛(Dendrobium nobileLindl)；19：黑毛石斛(Dendrobium williamsonii Day et Rchb.f.))进行检测，电泳结果见图1。
其中编号为13的梳唇石斛，扩增出了分子量为300bp多大小的特殊DNA条带，其余编号为其他石斛品种，未见有300bp多大小的特殊DNA条带产生，可见本发明特异性引物用于检测梳唇石斛，特异性好、灵敏度高。