一种用于捕获循环肿瘤细胞团簇的微流体芯片及其制备方法与流程

本发明属于稀有细胞检测分离领域，具体涉及一种用于捕获循环肿瘤细胞团簇的微流体芯片及其制备方法，该微流体芯片设计利用特殊自身结构及间隙捕获全血中的肿瘤细胞团簇。

背景技术：

循环肿瘤细胞(CTC)是自肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，具有重要的临床意义但是含量非常稀少的细胞。循环肿瘤细胞以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个的CTC，也有聚成团的CTM(CirculatingTumorMicroemboli)。

研究表明CTM比单个的CTC具有更强的转移潜能，与肿瘤预后关系更为密切，而且可以从CTM中获得纯度较高的肿瘤细胞。与单个CTC相比，CTM中的部分肿瘤细胞也可能避免离巢凋亡，这有利于CTM分离后的肿瘤细胞培养和后续的分子分析。但目前用于捕获CTM的技术手段有限，主要原因在于前期血液处理过程中涉及到红细胞裂解。该裂解液主要成分含有EDTA等物质，有解离细胞团簇的效果。且在裂解过程中，晃动离心等处理，均会破坏CTM。因此迫切需要一种技术避开红细胞裂解过程，而从全血中直接分离出CTM。

微流体芯片以其低成本、易操作、便携式、低损伤、高准确性成为当前各类CTCs检测方式中最热门的一种方式。

相关技术的描述。

关于几种CTC分离检测的方法:

Cell search使用EpCAM抗体包被的铁磁珠进行免疫分离。正常细胞表达相同标志物可致假阳性，由于表型异质性可致假阴性。由于循环肿瘤细胞与抗体结合难以经行洗脱和经行后续的一系列相关究。

使用EpCAM抗体包被的铁磁珠进行免疫分离。CTM中的肿瘤细胞若表达EpCAM，则可以结合到磁珠上，进而被分离出来。交错式混合结构的“鱼骨型”芯片，则是将EpCAM抗体修饰到芯片表面。流体通过芯片时，其鱼骨结构能够产生涡流，能极大增加CTM和芯片表面接触机会，从而增加CTM被捕获的机会。但是正常细胞表达相同标志物可致假阳性，若肿瘤细胞不表达或弱表达EpCAM可致假阴性。且CTM与抗体结合难以经行洗脱和后续的一系列相关究。

利用CD45抗体，通过去除白细胞的方式，负性富集CTM。但很多CTM中也混有白细胞，该方法容易造成假阴性，且需要红细胞裂解，去除血浆，等一系列操作，容易破坏CTM。

ISET联合激光扫描细胞计量仪(lasereanningeytometry，LSC)的原理即是利用肿瘤细胞通常比外周血液中其它细胞大的特性，采用孔径为8μm的滤膜，将肿瘤细胞从血液中分离出来，通过不同荧光标记细胞来进行进一步鉴定，应用LSC对已经过荧光抗体标记的细胞进行扫描并识别，进而可以准确计算出血液中含有的微量肿瘤细胞。常用的荧光抗体有抗CK抗体。经过研究表明，此方法已成功被运用于从乳腺癌、前列腺癌以及肺癌患者的血液中检测出CTCs。此方法较之CellSearch系统而言，其细胞富集过程相对容易，它不依赖抗原抗体反应而是直接过滤外周血进行肿瘤细胞富集，不但不破坏肿瘤细胞的形态学特征而且减小了肿瘤细胞的丢失，同时它能将丢失了上皮细胞特征的肿瘤细胞分离出来，并且应用激光扫描细胞计量仪对所检测到的阳性细胞进行进一步目测确认，确保了CTCs检测的准确性。然而，采用CellSearch技术与采用此方法检测的CTCs数目之间存在一定的不一致性，可能原因是有假阳性结果出现所致。而且此种方法选择的膜孔径为8μm意味着此方法只能分离直径大于8μm的肿瘤细胞，但目前没有研究能证实所有的肿瘤细胞都大于8μm，这导致该方法分离的准确性会受到质疑。

Oncoquick基于细胞密度对CTCs经行分离，优点是保存细胞活性，有利于进行细胞病理、免疫标记及分子研究；缺点是灵敏性低，不稳定，可能遗漏稀有的CTCs。

MACS通过免疫磁珠标记进行上皮性CTCs的分离；优点是基于特异性标记物的分离，保存活性便于后续分析；缺点是正常细胞表达相同标志物可致假阳性，由于表型异质性可致假阴性。

Ifish-CTC免疫荧光染色结合FISH技术经行非血源性细胞染色体异常检测，优点是不限于上皮来源的肿瘤细胞，可通用于更多类型肿瘤的CTC分离；富集到的CTC处于生存状态，可用于后续一系列相关研究，缺点是操作复杂、成本略高。

RT-PCR基于肿瘤特异性基因的表达分析，优点是高灵敏性；缺点是正常细胞表达相同标志物可致假阳性，由于表型异质性可致假阴性。

AdnaTest通过特定抗原表达和肿瘤相关标记物分离，提取RNA进行RT-PCR分析；优点是高灵敏性于特异性，有助于区别CTCs的干细胞属性与表型变化；缺点是非肿瘤细胞表达相关分子可致假阳性，表型异质性可致假阴性。

关于几种CTC-chip的分析：

微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片的基本结构是比较简单的，就是在基板上加工出微通道，然后将盖片和基片键合到一起，以形成封闭的微流体通道。基于微流控芯片的循环肿瘤细胞富集检测方法是近年来出现的新技术，通过将识别循环肿瘤细胞的抗体修饰在盖片的表面，并通过一定的几何设计使流过芯片的细胞与负载抗体的表面有充分的接触，因此来确保循环肿瘤细胞能够被捕获，达到较高的捕获效率。已报道的用于捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片包括微柱阵列型芯片、具有交错式混合结构的“鱼骨型”芯片；HTMSU芯片以及Nano-Velcro芯片等。

总结：

(1)红细胞裂解液可能破坏CTM。

(2)利用EpCAM抗体正性分离，CTM却可能不表达EpCAM,导致无法收集。

(3)利用CD45抗体负性富集，CTM可能和白细胞粘连而被去除掉。

(4)利用大小分离，传统的过滤孔膜，如ISET这些产品，很容易因为过滤孔两端压力大，破坏CTM。

总之现有的分离手段，效率低，不能保持活性等等缺点。在分离血液中循环肿瘤团簇细胞方面，在血液样本有限的情况下，捕获循环肿瘤团簇细胞的效率非常低下。因此，需要具有针对性的循环肿瘤团簇细胞微流体芯片及实验技术。

该发明是基于微流控芯片，利用CTM体积大易被阻隔的特点，通过优化设计芯片自身结构及间隙，来分离CTM。

微流控芯片的相应方法的成功实现及运用，不仅将对肿瘤早期检测和预后的判断有重大意义，而且对临床治疗的指导也有很大价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种用于捕获循环肿瘤细胞团簇的微流体芯片及其制备方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，一种用于捕获循环肿瘤细胞团簇的微流体芯片，其特征在于：

采用负性光刻胶制成设计模板，其上设置三角形矩阵，设计模板厚度为50mm～100um，三角形之间间距为10um-20um。

其中，三角形形状为等边三角形，三角形的边长为92mm，三角形之间间距为12um。

其中，所述负性光刻胶采用SU8胶制成设计模板。

进一步，所述负性光刻胶为50um，厚度均匀，避免造成尺寸大小不均匀。

用trichloro(1,1,2,2-perfluoocytl)silane真空环境下处理下模具。

作为本发明的第二方面，一种用于捕获循环肿瘤细胞团簇的微流体芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取出PDMS材料，按重量百分比10:1混合搅拌；

(2)将混合好的PDMS放入真空干燥器中抽真空去除因搅拌产生的气泡；

(3)放置30分钟，待气泡完全消失，取出PDMS准备浇注，将PDMS倒入芯片模子上；

(4)将浇注的模子放入真空干燥器中抽真空；

(5)放置至气泡消除；

(6)将模子取出，平放于70度烘箱硬化45m分钟；

(7)将硬化后的模子放置超净工作台面，用手术刀沿着硅片周边切开，用镊子夹起；

(8)切开后的PDMS，将内侧翻过来，用打孔器在头尾两处分别打孔；

(9)将PDMS内侧面朝上，然后将微流体基板与玻璃板置于氧等离子清洗机内，用最大功率纯氧处理表面1分钟；

(10)把PDMS微流体基板与玻璃板从等离子机里取出，放置于超净工作台，用镊子夹取PDMS微流体基板处理面与玻璃板迅速封合；

(11)将封合好的PDMS放置于80℃烘箱20分钟，使其充分结合；

(12)插入导管，完成。

进一步，还包括血样处理步骤，使用加入抗凝剂的FPBS稀释血样，血样浓度过高会堵塞一些芯片通道，导致收集效率降低。

进一步，步骤(9)中，使用效果稳定的微量注射泵控制样品的流速，经过反复实验，确定流速为2.5ml/hr时捕获效率达到最高。

进一步，在4℃时更利于肿瘤团簇细胞的捕获和洗脱。

洗脱处理：用专用的洗脱液可以便于后续的研究。

本发明的有益效果：

本发明所采用的技术方案是，利用微流体芯片的特殊(群集)设计以及(特殊的孔径)相对应的实验技术对肿瘤团簇细胞进行捕获。

微流体芯片捕获肿瘤细胞技术，解决了现有技术中捕获肿瘤细胞准确性及效率低下的问题。

提高了肿瘤团簇细胞捕获的捕获率，及捕获的肿瘤细胞活性。

附图说明

图1是群集型微流体芯片设计图，该设计图中确定了芯片中群集三角形为等边三角形。三角形之间的间距为10um-20um，例如12um，通过计算机模拟该形状以及该间距下可以高效的捕捉到CTM而不致微流体芯片堵塞。实验表明该孔径大小不会造成循环肿瘤团簇细胞损伤。

图2是群集型微流体芯片阵列设计图，该图中确定了单入样口与微流体阵列之间的间距以及位置关系。

图3是组装完成后的芯片外观。群集型微流体芯片结构图，该结构有效提高血样通过率从而提高了流速，可加快实验进度减少样本负担。

图4是样本通过群集型微流体芯片示意图。

图5是样品流速示意图。

图6是循环肿瘤团簇细胞在固定流速下的受力分析图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1

第一部分：设计微流体芯片模板

如图1-3所示，采用三角形矩阵设计(通过计算机仿真，决定是三角形而不是其他形状)

设计上，优化了以下因素：矩阵设计，三角形大小，三角形形状，三角形之间间距。

使用负性光刻胶是SU8胶为原始模板。

设计模板厚度为50um～100um，光刻胶厚度均匀，避免造成尺寸大小不均匀。

三角形为等边三角形，其边长为92um，三角形之间间距为10um-20um，优选为12um。

用trichloro(1,1,2,2-perfluoocytl)silane真空环境下处理下模具。

第二部分：制作微流体芯片

(1)取出PDMS材料，按重量百分比10:1混合搅拌；

(2)将混合好的PDMS放入真空干燥器中抽真空去除因搅拌产生的气泡；

(3)放置30分钟，待气泡完全消失，取出PDMS准备浇注，将PDMS倒入芯片模子上；

(4)将浇注的模子放入真空干燥器中抽真空；

(5)放置至气泡消除；

(6)将模子取出，平放于70度烘箱硬化45m分钟；

(7)将硬化后的模子放置超净工作台面，用手术刀沿着硅片周边切开，用镊子夹起；

(8)切开后的PDMS，将内侧翻过来，用打孔器在头尾两处分别打孔；

(9)将PDMS内侧面朝上，然后将微流体基板与玻璃板置于氧等离子清洗机内，用最大功率纯氧处理表面1分钟；

(10)把PDMS微流体基板与玻璃板从等离子机里取出，放置于超净工作台，用镊子夹取PDMS微流体基板处理面与玻璃板迅速封合；

(11)将封合好的PDMS放置于80℃烘箱20分钟，使其充分结合；

(12)插入导管，完成。

实验技术改进

血样处理，使用加入抗凝剂的FPBS稀释血样，血样浓度过高会堵塞一些芯片通道，导致收集效率降低。

如图4-6所示，使用效果稳定的微量注射泵控制样品的流速，经过反复实验，确定流速为2.5ml/hr时捕获效率达到最高。在4℃时更利于肿瘤团簇细胞的捕获和洗脱。洗脱处理：用专用的洗脱液可以便于后续的研究。

分离效率效率

利用MCF7的CTM，分离效率为96％。从肺癌病人外周血中分离出CTM为84％。

以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。