本发明涉及一种一种光-基因质粒及其应用，属于光-基因
技术领域：
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背景技术：
：“光-基因技术体系”技术(optogenetictechnology)是最近十年在美国和德国首先开展起来的，其是一种整合了基因工程学、电生理学、光学和电子工程技术的全新生物技术。该技术基于基因治疗的方法，利用病毒载体(通常用慢病毒或腺相关病毒)将一种从绿藻chlamydomonasreinhardtii克隆出来的可以编码光敏感型阳离子通道蛋白的基因(chr2)导入某一特定的细胞亚群中表达，此通道蛋白受到蓝光(472nm)刺激时，会使na+离子进入细胞内引起胞膜去极化而兴奋细胞。此外，另有一种从natruonobacteriumpharaonis提取出来的光调控的氯离子泵蛋白基因nphr，其对黄光(593nm波长)敏感，将其克隆到某一细胞中表达后，在黄光刺激下该氯离子通道蛋白会使cl-进入细胞而使胞膜复极化，从而使细胞回复静息，这样利用交替的蓝光或黄光就可以在特定细胞亚群水平上控制细胞活性。这项技术具有空间上的细胞特异性(应用特定启动子诱导相应基因在特定细胞群中表达)和时间上毫秒水平上的精确性，因此无论在科学研究，还是临床药物研发方面都具有很大的应用潜力。现有的光-基因技术体系光感受体表达在细胞表面，无论是在体外培养的细胞还是生物体内的细胞或组织，光受体的表达范围并不是都在光照射范围内，在光-基因技术中，精准调控某一空间的组织或细胞是公知的难题，目前没有办法确定光刺激到了哪些表达光感受体的细胞。因此光-基因技术体系在研究确切细胞功能时不够准确，研究对象只是一个大概的光-基因表达区域细胞群。技术实现要素：为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种光-基因质粒，使其可应用于观察确切被光调控的细胞或组织的功能。本发明的另一目的在于提供以病毒载体包装本发明所述光-基因质粒的重组病毒。本发明的另一目的在于提供由本发明所述质粒表达的重组蛋白。本发明的另一目的在于提供含本发明所述质粒、重组病毒或重组蛋白的生物材料。本发明的再一目的在于提供一种光调控细胞的方法，所述方法利用了本发明所述质粒。为实现上述目的，本发明提供一种光-基因质粒，其中，该质粒包含启动子、光感基因及可变色荧光蛋白基因。优选地，按质粒的复制方向，所述启动子位于所述光感基因及可变色荧光蛋白基因的上游；更优选地，按质粒的复制方法，所述含启动子、光感基因及可变色荧光蛋白基因依次顺序相连。作为本发明的一具体实施方式，该质粒的图谱如图1所示。本发明所述启动子为诱导光感基因及可变色荧光蛋白基因在特定细胞群中表达的特定启动子，这些特点启动子可以根据实际调控的细胞或组织按照现有技术进行选择。示例性的启动子包括但不限于ef1a、camkiia、hsyn、cag、fos、pv或th。优选地，所述启动子为hsyn。如前所述，本发明所述光感基因为编码光敏感型蛋白的基因，由其所表达的蛋白在光刺激下能产生生理功能变化。可应用于本发明的光敏基因包括但不限于chr2、enphr3.0、c1v1、cheta、archt。优先地，所述光敏基因为enphr3.0。本发明所述可变色荧光蛋白基因为编码光转化荧光蛋白的基因，由其所表达的蛋白在特定的光照条件下可实现颜色转换。可应用于本发明的可变色荧光蛋白基因包括但不限于eosfp、dendra2、kaede、mkikgr。优选dendra2。实现所述可变色荧光蛋白转换颜色的特定光照波长可根据现有技术选择，例如来源于脑珊瑚(瓣叶形)(lobophylliahemprichii)的eosfp，其经过390～405nm的光照由绿色变红色。来源于软珊瑚(dendronephthya)的dendgfp衍生物dendra2，其经过488nm或者405nm的光照由绿色变红色。如前所述，现有的光-基因技术体系光感受体表达在细胞表面，无论是在体外培养的细胞还是生物体内的细胞或组织，光受体的表达范围并不是都在光照射范围内，在光-基因技术中，精准调控某一空间的组织或细胞是公知的难题，目前没有办法确定光刺激到了哪些表达光感受体的细胞。因此光-基因技术体系在研究确切细胞功能时不够准确，研究对象只是一个大概的光-基因表达区域细胞群。本发明解决了本领域技术人员长期想解决但没有解决的技术问题，创造性地将光感基因及可变色荧光蛋白基因在质粒上结合形成所述质粒，其可用于观察确切被光调控的细胞及组织的功能。表达该光-基因质粒的细胞在光刺激下能产生生理功能变化；结合光通道上荧光变化指示作用确定被光调控的细胞。综合这些功能，产生了一类全新功能的质粒，其能准确地反应那些被光刺激的细胞功能，为更精确地解释细胞或组织功能提供了更为便利、有效的工具和方法。根据本发明的具体实施方式，在本发明所述质粒中，所述启动子为hsyn，所述光感基因为enphr3.0，且所述可变色荧光蛋白基因为dendra2。优选地，按质粒的复制方法，hsyn、enphr3.0及dendra2依次顺序相连。由于该质粒同时具有enphr3.0及dendra2，因此，不仅可使被光调控细胞具有光调控细胞活性的能力，还具有变色指示能力，两者的特性结合在一起使细胞或组织功能研究更加灵活精准，这类工具和应用该工具的方法使得生命功能检测和现象解释有质的提升。根据本发明的具体实施方式，该质粒为paav-hsyn-enphr3.0-dendra2。优选地，该质粒中enphr3.0-dendra2的基因序列如seqidno:2所示。进一步优选地，paav-hsyn-enphr3.0-dendra2的图谱如图2b所示。该质粒中从质粒的pucorigin复制起始位置依次顺序包括基因l-itr、hsyn、enphr3.0、dendra2、wpre、hghploya、r-itr、f1origin及ampr。制备本发明paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒包括但不限于：联合应用mfeⅰ单酶及hindⅲ单酶将paav-hsyn-enphr3.0-eyfp质粒中的eyfp基因切下后，再在酶切质粒骨架paav-hsyn-enphr3.0上连接采用mfeⅰ单酶及hindⅲ单酶酶切seqidno:1后含dendra2基因的的片段。由paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒表达的光感受体蛋白融合光转换荧光蛋白表达在组织内是绿色的，这种状态可以确定表达效果；当光纤植入到受体表达区并透射强紫外(405nm)或蓝光(488nm)光束照射可使被照射的绿色荧光蛋白转换成红色荧光蛋白，据此可确定光纤植入位置和被光束照射到的具体被调控细胞，例如脑细胞。paav-hsyn-enphr3.0-eyfp为现有质粒，其可通过商购获得，其图谱如图2a所示，该质粒具有1352bpmfeⅰ和2371bphindⅲ单酶切位点，联合应用mfeⅰ单酶及hindⅲ单酶将该质粒中的eyfp基因切下后，再在酶切质粒骨架paav-hsyn-enphr3.0上连接经过mfeⅰ单酶及hindⅲ单酶酶切seqidno:1后的含dendra2基因的片段即可获得的如图2b所示的paav-hsyn-enphr3.0-dendra2。另一方面，本发明提供一种重组病毒，其是由本发明所述的光-基因质粒经病毒载体包装而成。优选地，所述病毒载体腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒。作为优先方式，所述病毒载体为腺相关病毒。在本发明的具体实施方式中，采用腺相关病毒载体系统导入基因，替代的方法可选择其他基因导入方式，例如逆转录病毒系统、慢病毒系统等病毒载体。另一方面，本发明可提供一种重组蛋白，其是由本发明所述的光-基因质粒或本发明所述的重组病毒表达的。另一方面，本发明提供一种生物材料，其中，所述生物材料含有本发明所述的光-基因质粒，或本发明所述的重组病毒，或本发明所述的重组蛋白。优选地，所述生物材料为微生物、细胞或组织。另一方面，本发明提供一种光调控细胞的方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备本发明所述的质粒；优选地，该质粒为本发明所述的paav-hsyn-enphr3.0-dendra2；(2)将步骤(1)所得质粒利用病毒载体进行包装；优选地，该病毒载体为腺相关病毒；(3)将步骤(2)包装后的病毒注射至待调控细胞区或组织；优选地，该组织为脑组织；(4)植入光电极，在表达的光敏蛋白敏感的波长下进行光刺激，并记录细胞生理变化；优选地，在波长为593nm条件下进行光刺激；(5)在表达的可变色荧光蛋白可转换颜色的波长下进行光照，标记被光刺激的细胞；优选地，在405nm或者488nm进行光照；(6)显微镜下观察被光刺激的细胞。优选地，步骤(1)中所述质粒为本发明所述的paav-hsyn-enphr3.0-dendra2；步骤(2)中所述病毒为腺相关病毒；步骤(3)是将步骤(2)包装后的病毒注射入脑组织；步骤(4)是在波长为593nm条件下进行光刺激；步骤(5)是405nm或者488nm进行光照。特别地，本发明所述光调控细胞的方法尤其适用于对脑组织的精确调控，现有光-基因在脑中的表达范围一般采用脑组织切片观察荧光来确定，表达范围取决于注射病毒的体积和不同类型的病毒工具。同样地，尽管光调控的神经细胞围绕在刺激光附近，但以目前的技术手段无法区分哪些脑细胞受到光调控，哪些表达了光-基因但未受到光调控，也就无法达到细胞水平的精准调控和功能分析。本发明所述方法应用了所述质粒，本类质粒不仅具有光基因的光调控细胞活性的能力，还具有光转换荧光蛋白的变色指示能力，两者的特性结合在一起使细胞或组织功能的研究更加灵活精准，使得脑神经功能检测和脑活动现象解释有质的提升。综上所述，本发明主要提供了一种光-基因质粒及其应用，该质粒主要用于观察确切被光调控的细胞及组织的功能。表达该光‐基因质粒的细胞在光刺激下能产生生理功能变化；结合光通道上荧光变化指示作用确定被光调控的细胞。综合这些功能，该质粒能准确地反应那些被光刺激的细胞功能，为更精确地解释细胞或组织功能提供了更为便利、有效的工具和方法。附图说明图1为本发明所述质粒的图谱示意图。图2a为实施例1中paav-hsyn-enphr3.0-eyfp质粒的图谱。图2b为实施例1中制备得到的paav-hsyn-enphr3.0-dendra2图谱。图3a为实施例1中在593nm的激光刺激连接核记录的细胞电生理变化图。图3b为实施例1中光调控组织颜色变化过程，其中，左图为paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒注射在连接核脑区表达效果，右图为经光纤中405nm或488nm光照射后，光照区为红色(即被调控过的细胞群)，未光照区为绿色(即没有被光调控但表达了paav-hsyn-enphr3.0-dendra2的细胞群)。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。实施例1(i)大肠杆菌感受态细胞的制备1)从大肠杆菌(常用dh5a菌株)平板上挑取一个单菌落于3mllb培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；2)取0.4ml菌液转接到40mllb液体培养基中，37℃振荡培养2～3h；3)菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min；4)4℃离心10min(4000r/min)；5)倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽；6)用冰浴的0.1mol/l氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min；7)4℃离心10min(4000r/min)；8)倒出上清液，用冰浴的0.1mol/l氯化钙2ml悬浮细胞(冰上放置)；9)分装细胞，200μl一份，4℃保存。(ii)、质粒dna的转化1)取200μl新鲜制备的感受态细胞，加入质粒dna(该质粒的图谱如图2a所示，来源：http://www.addgene.org/26972/)2μl混匀，冰浴30min；2)离心管放到42℃保温90s；3)冰浴2min；4)每管加800μllb液体培养基，37℃培养1h(150r/min)；5)取适当体积(100μl)的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min；6)倒置平皿37℃，12～16h，出现菌落。(iii)质粒提取步骤1)取1～4ml在lb培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清；2)加250μl细胞悬浮液与rnasea的混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min；3)加入250μl细胞裂解液，轻柔的反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液；4)加入350μl中和液，立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀；5)12000室温离心10min，收集上清；6)将上清置于dna纯化柱中，静置1-2min；7)12000转离心1min，弃滤液；8)加入500μl洗涤液pb12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒dna；9)加入500μl去盐液，12000转离心1min，弃滤液，重复一次；10)12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；11)将dna纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100μl溶液eluent(无菌双蒸水，ph为8.0-8.5)，室温放置2min；12)12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒dna(1μg/ul以上)，质粒于-20℃保存。(iv)paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒的构建合成如下所示的序列(seqidno:1，由南京金斯瑞生物科技有限公司按现有方法合成)：ggtatccaattgtgtgggctcttggagtcgagggtatcgcggtgttgcccgttggggtgacgagctggggatattctttcctggatatcgtggcaaagtacattttcgcattcttgctcctgaactatctgacgtcaaacgaatctgtcgtgtccggcagcattttggatgttccatctgcttctgggaccccggctgatgatgcgcatgaacaccccgggaattaacctgatcaaggaggacatgcgcgtgaaggtgcacatggagggcaacgtgaacggccacgccttcgtgatcgagggcgagggcaagggcaagccctacgagggcacccagaccgccaacctgaccgtgaaggagggcgcccccctgcccttcagctacgacatcctgaccaccgccgtgcactacggcaaccgggtgttcaccaagtaccccgaggacatccccgactacttcaagcagagcttccccgagggctacagctgggagcgcaccatgaccttcgaggacaagggcatctgcaccatccgcagcgacatcagcctggagggcgactgcttcttccagaacgtgcgcttcaagggcaccaacttcccccccaacggccccgtgatgcagaagaagaccctgaagtgggagcccagcaccgagaagctgcacgtgcgcgacggcctgctggtgggcaacatcaacatggccctgctgctggagggcggcggccactacctgtgcgacttcaagaccacctacaaggccaagaaggtggtgcagctgcccgacgcccacttcgtggaccaccgcatcgagatcctgggcaacgacagcgactacaacaaggtgaagctgtacgagcacgccgtggcccgctacagccccctgcccagccaggtgtggtaacgaattcgatatcaagcttatcga(seqidno:1)基因片段，其中包含dendra2基因，将这段合成基因片段酶切后插入酶切质粒骨架paav-hsyn-enphr3.0上即获得paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒，其图谱如图2b所示。具体操作步骤为：1)酶切paav-hsyn-enphr3.0-eyfp酶切体系：paav-hsyn-enphr3.0-eyfp5μl10×m缓冲液5μlmfeⅰ0.5μlhindⅲ0.5μlh2o39μl总计50μl反应条件：37℃，过夜。电泳跑胶，120v，35min。回收5134bpdna片段溶解于20μl双蒸水中。2)酶切seqidno:1酶切体系：seqidno:15μl10×m缓冲液5μlmfeⅰ0.5μlhindⅲ0.5μlh2o39μl总计50μl反应条件：37℃，过夜。电泳跑胶，120v，35min。回收907bpdna片段溶解于20μl双蒸水中。3)连接质粒骨架paav-hsyn-enphr3.0酶切后5134bpdna片段与seqidno:1酶切后907bpdna片段连接体系：连接条件：在16℃连接5h。连接产物即为paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒，该质粒中enphr3.0-dendra2的基因序列如seqidno:2所示。paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒依次按照前面步骤(i)、(ii)、(iii)步获得高纯度的质粒dna(1μg/ul以上)，质粒于-20℃保存；paav-hsyn-enphr3.0-dendra2被kpnⅰ和sandⅰ切割，再用t4聚合酶，在ra2yn-enphr3.0末端补平，最后t4dna连接酶连接即可获得paav-hsyn-dendra2质粒，用于对照比较。具体操作步骤：1)酶切paav-hsyn-enphr3.0-dendra2酶切体系：paav-hsyn-enphr3.0-dendra25μl10×l缓冲液5μlkpnⅰ0.5μlsandⅰ0.5μlh2o39μl总计50μl反应条件：37℃，过夜。电泳跑胶，120v，35min。回收5134bpdna片段溶解于20μl双蒸水中。2)末端平滑化反应a)在微量离心管中制备下列反应液(总体积9μl)。注：dna片段须经过乙醇沉淀。b)70℃保温5分钟，然后转移至37℃保温。c)加入1μl的t4dna聚合酶，轻柔混匀(不可剧烈振荡)。d)37℃反应5分钟。(gc含量较低的dna，则25℃反应。)e)如果dna浓度很高，加入dna稀释缓冲液，使dna浓度达到1μg/50μl，并激烈振荡，使t4dna聚合酶失活，然后置于冰上，准备进行下一步反应。如果需要保存反应液，则立即做苯酚处理、乙醇沉淀。dna沉淀用dna稀释缓冲液溶解后于-20℃保存。3)自连paav-hsyn-enphr3.0-dendra2片段(kpnⅰ/sandⅰ)末端平滑化后的片段连接体系：连接条件：在16℃连接5h。连接产物即为paav-hsyn-dendra2质粒。paav-hsyn-dendra2质粒依次按照前面步骤(i)、(ii)、(iii)步获得高纯度的质粒dna(1μg/μl以上)，质粒于-20℃保存；(v)根据aavhelper-freesystem操作步骤包装paav-hsyn-enphr3.0-dendra2腺相关病毒，备用。具体操作步骤：(a)aav-293细胞的冻存1)去掉细胞培养上清液，加入pbs洗去残留的培养基。2)加入0.25％的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。3)细胞计数，将细胞全部晃下，加入3ml37℃预热的10％dmem，用10ml移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出置于15ml离心管中，取50μl混匀后的细胞于1.5mleppendorf管中，加入450μl10％dmem，即为10倍稀释，混匀，取10μl细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10倍稀释)，即为实际n万/ml细胞浓度。4)细胞离心，1000rpm/min，5min。去掉上清。5)根据细胞计数结果加入细胞冻存液(70％完全培养基+20％fbs+10％dmso)重悬细胞，密度为3×106个/ml。6)分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。(b)aav-293细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。1)设置温度为37～42℃的水浴。2)查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套，防止被冻伤)，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1～2min内使细胞溶液完全溶解。3)将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm/min，5min。4)去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。5)将培养皿平稳放入37℃、5％co2和95％相对湿度的培养箱中培养。6)第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。(c)aav-293细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80％～90％时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1)消化细胞，方法同细胞冻存。2)细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3)根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。(d)aav包装和浓缩等1)质粒扩增构建好的aav载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1μg/μl，a260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。推荐使用qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。2)传aav-293细胞将培养aav-293细胞t75瓶中的培养基吸净，加入2ml4℃冰箱取出的0.25％胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37℃培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3ml37℃水浴中预热的10％dmem，移液枪用10ml移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15ml离心管中，取50μl混匀后的细胞于1.5mleppendorf管中，加入450μl10％dmem，即为10倍稀释，混匀，取10μl细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10倍稀释)，即为实际n万/ml细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/t75；若第三天转染，铺350-400万/t75。每瓶t75加10ml10％dmem培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％即可进行转染。转染前无需换培养基。3)制备脂转复合物(complex)试剂名称试剂数量载体质粒5μl(1.0μg/μl)包装质粒5μl(1.0μg/μl)辅助质粒5μl(1.0μg/μl)lipofectaminetm2000辅助质粒混合物转入细胞4)aav病毒收毒：病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。a)准备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37℃水浴；b)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；c)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1mlpbs重悬；d)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。5)aav病毒浓缩：a)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中。b)将两次收集的上清混合在一起，用0.45μm滤器过滤除杂质。c)加入1/2体积的1mnacl，10％peg8000溶液，混合均匀，4℃过夜。d)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的pbs溶液溶解，待完全溶解后用0.22μm滤器过滤除菌。e)加入核酸酶(benzonase)消化去除残留的质粒dna(终浓度为50u/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟；f)用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的aav病毒。6)aav的纯化a)向病毒浓缩液中添加固体cscl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)；b)将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/mlcscl溶液将离心管剩余空间填满；c)在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有aav颗粒的组分；d)重复上述过程一次。e)将病毒装入100kda的透析袋，4℃透析脱盐过夜，此即为纯化的aav病毒。7)aav病毒包装滴度测定(采用q-pcr法)a)取20μl浓缩病毒液，加入1μlrnase-freednase，混匀，37℃水浴反应30min。b)4℃，12000rpm/min，离心10min，取10μl上清到另一个无菌的1.5mlep管中。c)加入90μl稀释缓冲液(dilutionbuffer，1mmtris-hcl,ph8.0，0.1mmedta，150mmnacl)，混匀，37℃金属浴反应30min。d)自然冷却至室温，加入1μl蛋白酶k，65℃水浴反应1h。e)100℃金属浴反应10min，自然冷却至室温。f)进行q-pcr检测滴度，5.0×1012iu/ml左右。8)aav病毒的储存、稀释a)病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存；如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管，并使用封口膜封口)。i)病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新测定病毒滴度。ii)反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10％；因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融，建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。b)病毒的稀释：如果需要稀释病毒，将病毒取出置于冰浴融解后，使用pbs缓冲液或培养目的细胞无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(尽量在三天内用完)分装后使用。(vi)paav-hsyn-enphr3.0-dendra2质粒的应用具体操作步骤：1)50mg/kg给小鼠注射戊巴比妥钠进行麻醉，固定于脑立体定位仪上；2)连接核(ap:-1.0mm；ml:0.0mm；dv:3.8mm)钻孔并用外部尖端直径为10-20μm的玻璃微量注射器进行压力注射100nl3.0×1012vp/mlpaav-hsyn-enphr3.0-dendra2或者paav-hsyn-dendra2相关病毒；3)缓慢注射(50nl/min)，注射完后，留针10分钟，缓慢抽回注射器，缝合伤口；4)病毒表达3周后，在连接核(ap:-1.0mm；ml:0.0mm；dv:3.8mm)植入光电极；5)小鼠恢复一周，593nm的激光刺激连接核并记录细胞电生理变化，结果如图3a所示，其中，图3a中a为注射paav-hsyn-enphr3.0-dendra2小鼠，未给光刺激单神经元记录电信号，b为注射paav-hsyn-enphr3.0-dendra2小鼠，给593nm黄光刺激单神经元记录电信号，c为注射paav-hsyn-dendra2小鼠，给593nm黄光刺激单神经元记录电信号；比较图3a中三组数据可以看出，注射paav-hsyn-enphr3.0-dendra2小鼠，给光刺激时神经元被抑制。6)10％戊巴比妥深度麻醉3只注射过paav-hsyn-enphr3.0-dendra2小鼠，经心脏灌注生理盐水和4％多聚甲醛固定鼠脑，取出脑于4％多聚甲醛后固定过夜，然后30％的蔗糖脱水两天；7)3只注射过paav-hsyn-enphr3.0-dendra2小鼠405nm或488nm的激光照射连接核脑区，标记被光刺激的细胞；8)10％戊巴比妥深度麻醉第7步处理过的小鼠，经心脏灌注生理盐水和4％多聚甲醛固定鼠脑，取出脑于4％多聚甲醛后固定过夜，然后30％的蔗糖脱水两天；9)冰冻切片6个鼠脑，取连接核(ap:-1.0mm；ml:0.0mm；dv:3.8mm)组织显微镜下读片，结果如图3b所示，左侧图为未经488nm的激光照射对照组鼠脑中paav-hsyn-enphr3.0-dendra2的荧光表达效果，右图为经405nm或488nm的激光照射对照组鼠脑中paav-hsyn-enphr3.0-dendra2的荧光表达效果。比较图3b中两幅图可以看出，经过激光转化变色(转化成红色，箭头所指部分)可以很好地找到被光刺激到的细胞或者组织。综合以上步骤，本发明中的质粒能准确地反应那些被光刺激的细胞功能。最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。当前第1页12