本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白喉类毒素的纯化方法。
背景技术：
白喉一直是最令人恐怖的儿童期疾病之一，是由能够产生外毒素的白喉棒状杆菌（以下简称白喉杆菌）引起的急性病，该病的爆发具有破坏性。细菌毒素可以引起产生上呼吸道阻塞性假膜（哮吼）或损伤心肌及其他组织，虽然大多数感染为隐性或临床症状相对较轻，但许多患者死于由白喉引起的呼吸道阻塞或中毒性心肌炎。
历史上许多国家都发生过以儿童为主的白喉大流行。在白喉呈地方性流行的国家，该病多为散发病例或小规模爆发。尽管大多数的白喉杆菌感染为隐性或临床症状相对较轻，但其病死率高（>10%），即便在最近的爆发中亦是如此。据估计在20世纪80年代大量使用白喉类毒素以前，在发展中国家每年约有100万病例，5万～6万例死亡。即使在近几年，在地方性流行区，白喉的报告病死率仍超过10%。
人是白喉杆菌的唯一天然宿主。白喉仅通过飞沫和密切接触传播。高传染性皮肤白喉在热带地区的一些地方常见。在温带气候的地方多数病例发生在寒冷季节，而在温热带气候的地方一年四季均有传播发生。在白喉仍呈地方性流行的国家，该病主要影响学龄前儿童和学龄儿童。在大多数工业化国家白喉已无地方性流行或非常罕见。然而，保持儿童和成人的疫苗高接种率仍十分重要，这一点已从世界许多地方白喉的爆发中得到了印证，尤其是20世纪90年代发生在前苏联的白喉大流行。
传统的白喉疫苗生产流程是用液体培养基发酵培养产毒的白喉杆菌，对含外毒素的培养上清离心去除菌体，然后用硫酸铵二段盐析法进行精制，精制后的毒素用甲醛进行脱毒成为类毒素原液。但是传统的方法生产的类毒素原液存在纯度不高的缺点，增加了接种后副反应的发生，安全性有待提高。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种白喉类毒素的纯化方法，该方法操作简单、纯化方便、成本低、适用于工业化大规模生产。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种白喉类毒素的纯化方法，它包括以下步骤：
S1.离心：将培养的白喉培养液采用甲醛进行杀菌，然后用连续离心机进行离心去除菌体，控制进液端流速至离心上清液澄清、无乳光；
S2.超滤浓缩：将上述离心液采用孔径为0.45～0.65μm的滤芯预过滤，再用截留分子量为30KD的超滤膜超滤浓缩至原体积的1/10，然后用注射用水将浓缩液稀释一倍，再超滤浓缩至稀释前浓缩液的体积，重复上述操作3～5次，得终浓缩液；
S3.一段盐析：终浓缩液中加入硫酸铵进行盐析，然后按离心收集的上清液体积的1%加入活性炭，继续搅拌10～30min，再加入碳酸氢钠使其终浓度为0.5%，继续搅拌30～60min，离心收集盐析后的上清液；
S4.二段盐析：在盐析后的上清液中加入硫酸铵进行二段盐析，盐析后离心收集沉淀；
S5.超滤脱盐：用碳酸氢钠溶液溶解沉淀，采用孔径为0.45～0.65μm的滤芯预过滤，用碳酸氢钠溶液将截留液稀释一倍，用截留分子量为30KD的滤膜超滤浓缩至原体积，重复上述操作直至硫酸铵含量＜0.1%；
S6.脱毒：超滤脱盐后的白喉类毒素中加入甲醛溶液，置于35～39℃脱毒28～34d；
S7.层析：将脱毒后的白喉类毒素上样于SephacrylS-300层析柱，以1ml/min的流速洗脱，收集单体峰，除菌过滤后置于2～8℃保存。
进一步地，离心机的转速为18000～22000g。
进一步地，步骤S3和步骤S4中所述硫酸铵的加入质量为上清液体积的18～25%。
进一步地，步骤S5中所述碳酸氢钠溶液的质量百分比浓度为0.1～0.5%。
进一步地，步骤S7中层析柱采用0.15mol/L的氯化钠平衡。
本发明具有以下优点：本发明提供的一种白喉类毒素的纯化方法，该方法制备的白喉类毒素原液纯度高，可达2500Lf/mg，从而降低了接种后副反应的发生，安全性更高；本发明方法操作简单、纯化方便、成本低、适用于工业化大规模生产。
附图说明
图1为本发明洗脱液的层析色谱图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：一种白喉类毒素的纯化方法，它包括以下步骤：
S1.离心：将培养的白喉培养液采用甲醛进行杀菌，连续离心机进行离心去除菌体，先启动离心机，待离心机转速为18000g后，打开蠕动泵调节转速为100rad/min，控制进液端流速至离心上清液澄清、无乳光；
S2.超滤浓缩：将上述离心液采用孔径为0.45μm的滤芯预过滤，再用截留分子量为30KD的超滤膜超滤浓缩至原体积的1/10，然后用注射用水将浓缩液稀释一倍，再超滤浓缩至稀释前浓缩液的体积，重复上述操作3次，得终浓缩液；
S3.一段盐析：终浓缩液中加入质量为上清液体积18%的硫酸铵进行盐析，然后按离心收集的上清液体积的1%加入活性炭，继续搅拌10min，再加入碳酸氢钠使其终浓度为0.5%，继续搅拌30min，离心收集盐析后的上清液；其中，所述离心机的转速为18000g；
S4.二段盐析：在盐析后的上清液中加入质量为上清液体积18%的硫酸铵进行二段盐析，盐析后离心收集沉淀；其中，所述离心机的转速为18000g；
S5.超滤脱盐：用碳酸氢钠溶液溶解沉淀，采用孔径为0.45μm的滤芯预过滤，用碳酸氢钠溶液将截留液稀释一倍，用截留分子量为30KD的滤膜超滤浓缩至原体积，重复上述操作直至硫酸铵含量＜0.1%；其中，所述碳酸氢钠溶液的质量百分比浓度为0.1%；
S6.脱毒：超滤脱盐后的白喉类毒素中加入甲醛溶液，置于35℃脱毒28d；
S7.层析：将脱毒后的白喉类毒素上样于采用0.15mol/L的氯化钠平衡的Sephacryl S-300层析柱，以1ml/min的流速洗脱，收集单体峰，如图1所示，除菌过滤后置于2℃保存。
实施例2：一种白喉类毒素的纯化方法，它包括以下步骤：
S1.离心：将培养的白喉培养液采用甲醛进行杀菌，连续离心机进行离心去除菌体，先启动离心机，待离心机转速为22000g后，打开蠕动泵调节转速为220rad/min，控制进液端流速至离心上清液澄清、无乳光；
S2.超滤浓缩：将上述离心液采用孔径为0.65μm的滤芯预过滤，再用截留分子量为30KD的超滤膜超滤浓缩至原体积的1/10，然后用注射用水将浓缩液稀释一倍，再超滤浓缩至稀释前浓缩液的体积，重复上述操作5次，得终浓缩液；
S3.一段盐析：终浓缩液中加入质量为上清液体积25%的硫酸铵进行盐析，然后按离心收集的上清液体积的1%加入活性炭，继续搅拌30min，再加入碳酸氢钠使其终浓度为0.5%，继续搅拌60min，离心收集盐析后的上清液；其中，所述离心机的转速为22000g；
S4.二段盐析：在盐析后的上清液中加入质量为上清液体积25%的硫酸铵进行二段盐析，盐析后离心收集沉淀；其中，所述离心机的转速为22000g；
S5.超滤脱盐：用碳酸氢钠溶液溶解沉淀，采用孔径为0.65μm的滤芯预过滤，用碳酸氢钠溶液将截留液稀释一倍，用截留分子量为30KD的滤膜超滤浓缩至原体积，重复上述操作直至硫酸铵含量＜0.1%；其中，所述碳酸氢钠溶液的质量百分比浓度为0.5%；
S6.脱毒：超滤脱盐后的白喉类毒素中加入甲醛溶液，置于39℃脱毒34d；
S7. 层析：将脱毒后的白喉类毒素上样于采用0.15mol/L的氯化钠平衡的Sephacryl S-300层析柱，以1ml/min的流速洗脱，收集单体峰，如图1所示，除菌过滤后置于8℃保存。
实施例3：一种白喉类毒素的纯化方法，它包括以下步骤：
S1.离心：将培养的白喉培养液采用甲醛进行杀菌，连续离心机进行离心去除菌体，先启动离心机，待离心机转速为19000g后，打开蠕动泵调节转速为150rad/min，控制进液端流速至离心上清液澄清、无乳光；
S2.超滤浓缩：将上述离心液采用孔径为0.52μm的滤芯预过滤，再用截留分子量为30KD的超滤膜超滤浓缩至原体积的1/10，然后用注射用水将浓缩液稀释一倍，再超滤浓缩至稀释前浓缩液的体积，重复上述操作4次，得终浓缩液；
S3.一段盐析：终浓缩液中加入质量为上清液体积20%的硫酸铵进行盐析，然后按离心收集的上清液体积的1%加入活性炭，继续搅拌18min，再加入碳酸氢钠使其终浓度为0.5%，继续搅拌40min，离心收集盐析后的上清液；其中，所述离心机的转速为20000g；
S4.二段盐析：在盐析后的上清液中加入质量为上清液体积20%的硫酸铵进行二段盐析，盐析后离心收集沉淀；其中，所述离心机的转速为20000g；
S5.超滤脱盐：用碳酸氢钠溶液溶解沉淀，采用孔径为0.52μm的滤芯预过滤，用碳酸氢钠溶液将截留液稀释一倍，用截留分子量为30KD的滤膜超滤浓缩至原体积，重复上述操作直至硫酸铵含量＜0.1%；其中，所述碳酸氢钠溶液的质量百分比浓度为0.2%；
S6.脱毒：超滤脱盐后的白喉类毒素中加入甲醛溶液，置于36℃脱毒30d；
S7.层析：将脱毒后的白喉类毒素上样于采用0.15mol/L的氯化钠平衡的Sephacryl S-300层析柱，以1ml/min的流速洗脱，收集单体峰，如图1所示，除菌过滤后置于4℃保存。
实施例4：一种白喉类毒素的纯化方法，它包括以下步骤：
S1.离心：将培养的白喉培养液采用甲醛进行杀菌，连续离心机进行离心去除菌体，先启动离心机，待离心机转速为21000g后，打开蠕动泵调节转速为190rad/min，控制进液端流速至离心上清液澄清、无乳光；
S2.超滤浓缩：将上述离心液采用孔径为0.58μm的滤芯预过滤，再用截留分子量为30KD的超滤膜超滤浓缩至原体积的1/10，然后用注射用水将浓缩液稀释一倍，再超滤浓缩至稀释前浓缩液的体积，重复上述操作5次，得终浓缩液；
S3.一段盐析：终浓缩液中加入质量为上清液体积23%的硫酸铵进行盐析，然后按离心收集的上清液体积的1%加入活性炭，继续搅拌25min，再加入碳酸氢钠使其终浓度为0.5%，继续搅拌30～60min，离心收集盐析后的上清液；其中，所述离心机的转速为21000g；
S4.二段盐析：在盐析后的上清液中加入质量为上清液体积23%的硫酸铵进行二段盐析，盐析后离心收集沉淀；其中，所述离心机的转速为21000g；
S5.超滤脱盐：用碳酸氢钠溶液溶解沉淀，采用孔径为0.60μm的滤芯预过滤，用碳酸氢钠溶液将截留液稀释一倍，用截留分子量为30KD的滤膜超滤浓缩至原体积，重复上述操作直至硫酸铵含量＜0.1%；其中，所述碳酸氢钠溶液的质量百分比浓度为0.4%；
S6.脱毒：超滤脱盐后的白喉类毒素中加入甲醛溶液，置于38℃脱毒32d；
S7. 层析：将脱毒后的白喉类毒素上样于采用0.15mol/L的氯化钠平衡的Sephacryl S-300层析柱，以1ml/min的流速洗脱，收集单体峰，如图1所示，除菌过滤后置于6℃保存。