特基拉芽孢杆菌JN369及其应用的制作方法

本发明涉及生物防治
技术领域：
，具体地说，涉及一种特基拉芽孢杆菌JN369及其在防治水稻稻瘟病中的应用。
背景技术：
：水稻(Oryzasativa)是最重要的粮食作物之一，全球有半数以上人口以水稻为食。稻瘟病(病菌为Magnaportheoryzae，其无性世代为Pyiculariaoryzae)是水稻最严重要的真菌性病害之一。稻瘟病菌(M.oryzae)是一种半活体寄生，在感染最初阶段具有很明显的活体营养阶段。稻瘟病根据其发病部位和发病时期不同可以分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗瘟、谷粒瘟、枝梗瘟等。目前生产上主要利用抗病品种和使用化学杀菌剂控制稻瘟病。主要使用的杀菌剂有三环唑、稻瘟灵、咪鲜胺、稻瘟酰胺、异稻瘟净、稻瘟净、敌瘟磷(克瘟散)、丙环唑、嘧菌酯、戊唑醇、烯丙苯噻唑、氯溴异氰尿酸、三氯异氰尿酸、四氯苯酞、肟菌·戊唑醇(拿敌稳)、硫磺·三环唑、甲硫·三环唑(稻津)、异稻·稻瘟灵、丙环唑·咪酰胺等；生物产品化学有效成分或活体微生物如春雷霉素、乙蒜素、氨基寡糖素、特基拉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。由于稻瘟病菌的遗传背景复杂，易变异，加上抗瘟品种单一化，主栽品种的遗传同质性高，抗病品种难保持持久抗稻瘟病，常常导致一个新的抗瘟品种在大面积种植几年后丧失抗性，而感病化。在抗病品种不能满足生产需要的情况下，化学防治是防治稻瘟病的有效手段，但由于用药不合理，给生态安全带来潜在的不利影响，也值得人们关注。生物防治即利用有益微生物活体或代谢产物杀灭或者降低病原微生物的数量以控制植物病害发生和危害。从植物病害的可持续控制来考虑，生物防治是一类绿色安全有效的防治措施。然而，生物防治领域中常会遇到拮抗微生物在田间自然条件下定殖力差、对病害防治效果不稳定等问题。大量的研究也表明，室内筛选出的拮抗微生物在温室中对病原菌有较强的抑制作用，而在大田防治中效果不理想，这可能是由于一方面菌株不适应大田生态环境而不能很好的定殖到植物的根围，另一方面与大田土壤中复杂的微生物种类与拮抗菌株之间出现相互作用，导致拮抗微生物防效降低，因此，选择筛选生物菌株的田间适应能力强或高效代谢产物应用于大田病害防治是解决上述问题的重要途径。技术实现要素：本发明的目的是提供一株新分离的生防菌-特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)JN369。本发明的另一目的是提供所述特基拉芽孢杆菌JN369在防治水稻稻瘟病中的应用。为了实现本发明目的，本发明的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)JN369是从湖南省桃江石牛江镇花田村(N28°42′55.56″，E112°15′74.24″)感稻瘟病水稻品种湘早籼24号的病丛中选取健康稻株分离获得的，采用与稻瘟病菌平板对峙法筛选出的对稻瘟病菌菌丝抑制率达79.95％的拮抗菌株，同时该菌株对多种病原菌都有良好拮抗作用，如对烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、葡萄灰霉菌(Botrytiscinerea)、辣椒胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、黄瓜疫病菌(Phytophthoramelonis)的菌丝抑制率分别达到69.31％、35.80％、70.83％和51.32％。现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCCNO：M2016340，保藏日期2016年6月22日。菌株JN369在NA平板上培养对其菌落形态进行观察及对其菌体的扫描电镜图观察，菌落形态不规则，边缘光滑，中间粗糙不透明、有褶皱，菌落污黄色。JN369菌体呈杆状，大小为(0.6～1.0)μm×(2.0～4.0)μm，芽孢椭圆到柱状，长0.5～1.0μm，形态如图1所示。菌株JN369能使淀粉水解、明胶液化，接触酶试验、VP试验、甲基红试验、硝酸盐还原试验呈阳性，使硫化氢试验、吲哚试验和苯丙氨酸脱氨酶试验呈阴性，能利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、玉米粉、D-甘露醇、D-阿拉伯糖。菌株JN369的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供由所述特基拉芽孢杆菌JN369制备的菌剂。本发明还提供所述特基拉芽孢杆菌JN369或由其制备的菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。前述的应用包括将所述特基拉芽孢杆菌JN369或由其制备的菌剂施用于水稻作物。其中，所述菌剂中特基拉芽孢杆菌JN369的活菌浓度≥1×107cfu/mL。本发明进一步提供一种防治水稻稻瘟病的方法，将所述枯草芽孢杆菌JN369的培养液进行离心，得到活体菌沉淀与上清液(含代谢产物)，将活体菌配制菌悬液施用于水稻作物，或将上清液施用于水稻作物。可选的，所述上清液(代谢产物)的制备方法包括：菌株JN369在NA固体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂17g/L，pH7.0，蒸馏水配制)平板上活化后，用打孔器打取直径5mm的2个菌饼接入装有150mLNB液体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，蒸馏水配制)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min条件下，摇床振荡培养6d，用细菌过滤器过滤，获得特基拉芽孢杆菌JN369代谢产物。进一步地，所述施用方法优选为叶面喷施。即将菌株JN369代谢产物或活体菌(浓度≥1×107cfu/mL)在稻瘟病菌侵染前或侵染后1-3d，采用叶面喷雾法施用于水稻作物上，能够起到较好的防效效果，也证明了该菌株具有良好的治疗稻瘟病效果。预防时，可在水稻抽穗初期施用，施用方法同上。作为优选，施用量为菌体4.5×1012cfu/hm2～4.5×1013cfu/hm2；根据权利要求6和8所述菌体与代谢产物混合使用4.5×1011cfu/hm2～4.5×1012cfu/hm2。。此外，采用平板对峙培养法发现菌株JN369对多种病原指示菌，例如烟草赤星病菌(A.alternata)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、辣椒胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黄瓜疫病菌(P.melonis)生长的抑菌率分别为69.31％、35.80％、70.83％和51.32％。本发明的有益效果在于：本发明经筛选得到一种特基拉芽孢杆菌JN369并对其进行了保藏，利用本发明提供的特基拉芽孢杆菌JN369对水稻稻瘟病进行防治，避免了化学防治对环境和稻米安全的潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险。菌株JN369活体菌及其代谢产物对稻瘟病均有较好的防效，保护和治疗作用兼具，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发。附图说明图1为本发明特基拉芽孢杆菌JN369的菌株扫描电镜下菌体形态。图2为本发明实施例1中特基拉芽孢杆菌JN369在NA平板上培养结果；其中，A为菌落形态，B为划线培养结果。图3为本发明实施例1中特基拉芽孢杆菌JN369对不同病原指示菌的生长抑制效果；其中，A1为烟草赤星病菌(A.alternata)；A2为JN369对烟草赤星病菌菌丝生长抑制效果；B1为棉花枯萎病菌(F.oxysporum)；B2为JN369对棉花枯萎病菌菌丝生长抑制效果。图4为本发明实施例2中特基拉芽孢杆菌JN369及其代谢产物对稻瘟病菌(M.oryzae)的菌丝生长抑制效果；其中，A为菌株JN369对稻瘟病菌生长抑制效果，CK为稻瘟病菌；B为菌株JN369的代谢产物对稻瘟病菌菌丝生长抑制效果，CK为稻瘟病菌。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1特基拉芽孢杆菌JN369的分离获得从湖南省桃江石牛江镇花田村(N28°42′55.56″，E112°15′74.24″)感稻瘟病水稻品种湘早籼24号的病丛中选取健康稻株，共分离出517株菌株，采用与稻瘟病菌平板对峙法筛选出1株对稻瘟病菌(M.oryzae)菌丝抑制率达79.95％的拮抗菌JN369。通过在NA固体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂17g/L，pH7.0，蒸馏水配制)平板上培养菌株JN369(图2A和图2B)，对其菌落形态进行观察，对其菌体的扫描电镜图观察，并结合该菌的生理生化、微生物学检测结果，以及16SrDNA测序结果(见SEQIDNO.1)，最终确定菌株JN369为特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)。此外，采用平板对峙培养法发现菌株JN369对多种病原指示菌具有抑制效果(图3)，例如烟草赤星病菌(A.alternata)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum)、辣椒胶孢炭疽(C.gloeosporioides)、黄瓜疫病(P.melonis)生长的抑菌率分别为69.31％、35.80％、70.83％和51.32％。实施例2特基拉芽孢杆菌JN369在水稻稻瘟病防治中的应用菌株JN369在NA固体培养基平板上活化后，用打孔器打取直径5mm的2个菌饼接入装有150mLNB液体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，蒸馏水配制)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min条件在摇床中振荡培养6d，用细菌过滤器过滤，获得特基拉芽孢杆菌JN369代谢产物。将菌株JN369代谢产物和PDA培养基以体积(mL)1:8的量混匀，接直径为7mm的稻瘟病菌菌饼于配好的培养基上，以无菌水代替拮抗菌培养液为对照，28℃培养，10d后测量稻瘟病菌的菌饼的大小，3次重复，结果显示对稻瘟病菌菌丝的抑制率为79.95％。温室盆栽试验包括JN369菌株不同浓度活体菌和代谢产物对水稻高感稻瘟病品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果试验两部分，试验在组培控温光照培养室内进行。JN369活体菌对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果：采用喷雾法接种稻瘟病菌(分生孢子浓度为1×105个/mL)诱发稻瘟病。将JN369活菌浓度梯度设计为：1×1010cfu/mL、1×109cfu/mL、1×108cfu/mL、1×107cfu/mL共4个浓度梯度。试验包括3种处理方式，分别为：A组先喷稻瘟病菌孢子液，第3d喷4个浓度梯度的JN369菌株活菌液；B组接种稻瘟病菌孢子悬浮液前1d分别喷4个浓度梯度的JN369菌株活菌液；C组接种稻瘟病菌孢子液前3d先分别喷4个浓度梯度的JN369菌株活菌液；设置清水、20％三环唑WP(×400倍液)和40％稻瘟灵EC(×500倍液)为对照，每种处理方式3钵，每钵30株。接种后7-10d对稻瘟病抗性进行分级调查和防治稻瘟病效果评价。JN369菌株代谢产物对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果评价：采用水稻活体接种法接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液(浓度为1×105个/mL)诱发稻瘟病。具体试验包括3种处理方式，分别为：A组先喷稻瘟病菌孢子液，第3d喷代谢产物；B组先喷代谢产物，1d后喷稻瘟病菌孢子液；C组先喷代谢产物，3d后喷稻瘟病菌孢子液。设置清水、杀菌剂40％稻瘟灵EC(×500倍液)和20％三环唑WP(×400倍液)为对照，每种处理方式3钵，每钵30株。接种后7-10d对稻瘟病抗性进行分级调查和防治效果评价。温室盆栽试验结果：JN369活体菌对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果见表1，JN369菌株代谢产物对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果见表2。表1JN369活体菌对湘晚籼12号的稻瘟病治疗效果处理及菌体浓度(cfu/ml)病株率(％)病情指数相对防效(％)1×107(A组)64.4418.0271.811×108(A组)44.448.8886.101×109(A组)43.3310.2483.971×1010(A组)66.6715.3076.0640％稻瘟灵(A组)85.5529.8753.28三环唑(A组)85.5536.4243.05清水(A组)97.7863.95/1×107(B组)83.3338.9039.891×108(B组)62.2220.7467.941×109(B组)60.0019.0170.611×1010(B组)84.4440.8636.8340％稻瘟灵(B组)91.1142.1034.9220％三环唑(B组)81.1137.4142.18清水(B组)100.0064.69/1×107(C组)67.7829.6354.201×108(C组)66.6724.3262.401×109(C组)61.1118.8070.801×1010(C组)74.4433.3348.4740％稻瘟灵(C组)86.6739.8838.3620％三环唑(C组)87.7840.7437.02清水(C组)100.0064.69/注：以上数据均为3次重复结果。表2JN369菌株代谢产物对湘晚籼12号的稻瘟病防治效果处理病株率(％)病情指数相对防效(％)JN369(A组)45.558.5286.6740％稻瘟灵(A组)85.5529.8753.28三环唑(A组)85.5536.4243.05清水(A组)97.7863.95/JN369(B组)84.4437.9041.4140％稻瘟灵(B组)91.1142.1034.9220％三环唑(B组)81.1137.4142.18清水(B组)100.0064.69/JN369(C组)76.6727.9056.8740％稻瘟灵(C组)86.6739.8838.3620％三环唑(C组)87.7840.7437.02清水(C组)100.0064.69/注：以上数据均为3次重复结果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3