本发明属于生物学领域，具体涉及小花清风藤中六种酰胺类生物碱的分离提取方法。
背景技术：
小花清风藤是清风藤科清风藤属的木质藤本或攀绿灌木，其根、茎、枝、叶均可入药。枝叶入药对治疗病毒性肝炎有较好的疗效。小花清风藤叶子中含有以下6种具有医药用途及中药研究价值的酰胺类化合物(分别简称为化合物1、2、3、4、5、6)：
由于以上6种酰胺类化合物结构差别较小，致分离纯化难度较大。
技术实现要素：
本发明目的在于提供小花清风藤中六种酰胺类生物碱的分离提取方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
小花清风藤中六种酰胺类生物碱的分离提取方法，具体包括以下步骤：
A：取小花清风藤干燥叶，粉碎，用其质量3.95倍的甲醇超声提取；
B：将甲醇提取后得到的提取液浓缩，向浓缩后的溶液中加入等体积量的纯化水，并搅拌均匀，在7℃条件下放置过夜；
C：将放置过夜的溶液抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至不含醇；
D：将步骤C得到的浓缩液加入其体积2倍量的纯化水稀释，用等体积的乙酸乙酯对稀释后的溶液进行萃取，将萃取液浓缩得到浸膏；
E：将步骤D得到的浸膏加入其质量1.58倍的甲醇溶解，滤去不溶物后，向甲醇溶液中加入等体积的丙酮，并搅拌均匀，在7℃的条件下放置过夜；
F：将步骤E得到的溶液进行抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至干，即得到6种酰胺的总生物碱样品；
G：将总生物碱样品用其质量0.79倍的丙酮溶解，加入与总生物碱样品质量相同的柱色谱硅胶，搅拌均匀，并挥去丙酮溶剂，用硅胶柱色谱进行进一步分离纯化，取总生物碱样品质量20倍的柱色谱硅胶，湿法装柱，以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂进行洗脱，共收集3部分样品，分别命名为E1、E2、E3，E1部分为样品的绿色色带全部出柱后即停止收集，E2部分为以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂洗脱四个保留体积的溶剂浓缩后的产物，E3部分为纯甲醇洗脱部分，E1和E3部分均弃去；
H：以二氯甲烷:甲醇的体积比为2.6:1的溶液为展开剂，将E2部分进行制备薄层分离，分别得到4个样品，分别为E2-1、E2-2、E2-3、E2-4，其中，E2-1的Rf值为0.90、E2-2的Rf值为0.56～0.60、E2-3的Rf值为0.40～0.50、E2-4的Rf值为0.20～0.26；
I：将E2-2、E2-3、E2-4进一步进行制备薄层,其中，E2-2、E2-3均以正己烷:丙酮的体积比为1.5:1的溶液为展开剂，且采取二次展开，E2-2得到两个样品分别命名为E2-2-1和E2-2-2，E2-2-1和E2-2-2的Rf值分别为0.40和0.32；E2-3得到两个样品分别命名为E2-3-1和E2-3-2，二者的Rf值分别为0.41和0.35；E2-4以正己烷:乙酸乙酯的体积比为1:2的溶液为展开剂，得到两个样品，分别命名为E2-4-1和E2-4-2，二者的Rf值分别为0.27和0.21；E2-2-1、E2-2-2、E2-3-1、E2-3-2、E2-4-1、E2-4-2分别对应6个酰胺类化合物中的1、2、3、4、5、6。
进一步，在整个分离提取过程中，温度≤50℃。
进一步，步骤A中，用甲醇超声提取3次，每次4小时，温度为50℃。
进一步，步骤B所述浓缩是将提取液浓缩至总提取体积的十分之一。
进一步，步骤C和步骤F所述抽滤所用仪器为布氏漏斗。
进一步，步骤G所述柱色谱硅胶的规格为100-300目。
本发明的有益效果在于：
本发明解决了小花清风藤中6种酰胺类化合物结构差别较小，致分离纯化难度较大的问题，成功分离纯化了6种酰胺类化合物。其中化合物N-cis-N-coumaroyl tyramine为从该植物中得到的新天然产物，其他5种均为该植物中首次分离得到的。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
小花清风藤中六种酰胺类生物碱的分离提取方法，具体步骤为：
A：取小花清风藤干燥叶，粉碎，用其质量3.95倍的甲醇超声提取3次，每次4小时，温度为50℃；
B：将甲醇提取后得到的提取液浓缩至总提取体积的十分之一，向浓缩后的溶液中加入等体积量的纯化水，并搅拌均匀，在7℃条件下放置过夜；
C：将放置过夜的溶液用布氏漏斗抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至不含醇；
D：将步骤C得到的浓缩液加入其体积2倍量的纯化水稀释，用等体积的乙酸乙酯对稀释后的溶液进行萃取，将萃取液浓缩得到浸膏；
E：将步骤D得到的浸膏加入其质量1.58倍的甲醇溶解，滤去不溶物后，向甲醇溶液中加入等体积的丙酮，并搅拌均匀，在7℃的条件下放置过夜；
F：将步骤E得到的溶液用布氏漏斗抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至干，即得到6种酰胺的总生物碱样品；
G：将总生物碱样品用其质量0.79倍的丙酮溶解，加入与总生物碱样品质量相同的柱色谱硅胶，搅拌均匀，并挥去丙酮溶剂，用硅胶柱色谱进行进一步分离纯化，取总生物碱样品质量20倍的柱色谱硅胶，湿法装柱，以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂进行洗脱，共收集3部分样品，分别命名为E1、E2、E3，E1部分为样品的绿色色带全部出柱后即停止收集，E2部分为以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂洗脱四个保留体积的溶剂浓缩后的产物，E3部分为纯甲醇洗脱部分，E1和E3部分均弃去；使用的制备薄层板为德国Merck生产的TLC Silica Gel Plate 60 F254 Glass plates；
H：以二氯甲烷:甲醇的体积比为2.6:1的溶液为展开剂，将E2部分进行制备薄层分离，分别得到4个样品，分别为E2-1、E2-2、E2-3、E2-4，其中，E2-1的Rf值为0.90、E2-2的Rf值为0.56～0.60、E2-3的Rf值为0.40～0.50、E2-4的Rf值为0.20～0.26；
I：将E2-2、E2-3、E2-4进一步进行制备薄层,其中，E2-2、E2-3均以正己烷:丙酮的体积比为1.5:1的溶液为展开剂，且采取二次展开，E2-2得到两个样品分别命名为E2-2-1和E2-2-2，E2-2-1和E2-2-2的Rf值分别为0.40和0.32；E2-3得到两个样品分别命名为E2-3-1和E2-3-2，二者的Rf值分别为0.41和0.35；E2-4以正己烷:乙酸乙酯的体积比为1:2的溶液为展开剂，得到两个样品，分别命名为E2-4-1和E2-4-2，二者的Rf值分别为0.27和0.21；E2-2-1、E2-2-2、E2-3-1、E2-3-2、E2-4-1、E2-4-2分别对应6个酰胺类化合物的1、2、3、4、5、6。
在整个分离提取过程中，温度≤50℃。
步骤G所述柱色谱硅胶的规格为100目。
实施例2
小花清风藤中六种酰胺类生物碱的分离提取方法，具体步骤为：
A：取小花清风藤干燥叶，粉碎，用其质量3.95倍的甲醇超声提取3次，每次4小时，温度为50℃；
B：将甲醇提取后得到的提取液浓缩至总提取体积的十分之一，向浓缩后的溶液中加入等体积量的纯化水，并搅拌均匀，在7℃条件下放置过夜；
C：将放置过夜的溶液用布氏漏斗抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至不含醇；
D：将步骤C得到的浓缩液加入其体积2倍量的纯化水稀释，用等体积的乙酸乙酯对稀释后的溶液进行萃取，将萃取液浓缩得到浸膏；
E：将步骤D得到的浸膏加入其质量1.58倍的甲醇溶解，滤去不溶物后，向甲醇溶液中加入等体积的丙酮，并搅拌均匀，在7℃的条件下放置过夜；
F：将步骤E得到的溶液用布氏漏斗抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至干，即得到6种酰胺的总生物碱样品；
G：将总生物碱样品用其质量0.79倍的丙酮溶解，加入与总生物碱样品质量相同的柱色谱硅胶，搅拌均匀，并挥去丙酮溶剂，用硅胶柱色谱进行进一步分离纯化，取总生物碱样品质量20倍的柱色谱硅胶，湿法装柱，以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂进行洗脱，共收集3部分样品，分别命名为E1、E2、E3，E1部分为样品的绿色色带全部出柱后即停止收集，E2部分为以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂洗脱四个保留体积的溶剂浓缩后的产物，E3部分为纯甲醇洗脱部分，E1和E3部分均弃去；使用的制备薄层板为德国Merck生产的TLC Silica Gel Plate 60 F254 Glass plates；
H：以二氯甲烷:甲醇的体积比为2.6:1的溶液为展开剂，将E2部分进行制备薄层分离，分别得到4个样品，分别为E2-1、E2-2、E2-3、E2-4，其中，E2-1的Rf值为0.90、E2-2的Rf值为0.56～0.60、E2-3的Rf值为0.40～0.50、E2-4的Rf值为0.20～0.26；
I：将E2-2、E2-3、E2-4进一步进行制备薄层,其中，E2-2、E2-3均以正己烷:丙酮的体积比为1.5:1的溶液为展开剂，且采取二次展开，E2-2得到两个样品分别命名为E2-2-1和E2-2-2，E2-2-1和E2-2-2的Rf值分别为0.40和0.32；E2-3得到两个样品分别命名为E2-3-1和E2-3-2，二者的Rf值分别为0.41和0.35；E2-4以正己烷:乙酸乙酯的体积比为1:2的溶液为展开剂，得到两个样品，分别命名为E2-4-1和E2-4-2，二者的Rf值分别为0.27和0.21；E2-2-1、E2-2-2、E2-3-1、E2-3-2、E2-4-1、E2-4-2分别对应6个酰胺类化合物中的1、2、3、4、5、6。
在整个分离提取过程中，温度≤50℃。
步骤G所述柱色谱硅胶的规格为300目。
实施例3
小花清风藤中六种酰胺类生物碱的分离提取方法，具体步骤为：
A：取小花清风藤干燥叶，粉碎，用其质量3.95倍的甲醇超声提取3次，每次4小时，温度为50℃；
B：将甲醇提取后得到的提取液浓缩至总提取体积的十分之一，向浓缩后的溶液中加入等体积量的纯化水，并搅拌均匀，在7℃条件下放置过夜；
C：将放置过夜的溶液用布氏漏斗抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至不含醇；
D：将步骤C得到的浓缩液加入其体积2倍量的纯化水稀释，用等体积的乙酸乙酯对稀释后的溶液进行萃取，将萃取液浓缩得到浸膏；
E：将步骤D得到的浸膏加入其质量1.58倍的甲醇溶解，滤去不溶物后，向甲醇溶液中加入等体积的丙酮，并搅拌均匀，在7℃的条件下放置过夜；
F：将步骤E得到的溶液用布氏漏斗抽滤，弃去沉淀，滤液浓缩至干，即得到6种酰胺的总生物碱样品；
G：将总生物碱样品用其质量0.79倍的丙酮溶解，加入与总生物碱样品质量相同的柱色谱硅胶，搅拌均匀，并挥去丙酮溶剂，用硅胶柱色谱进行进一步分离纯化，取总生物碱样品质量20倍的柱色谱硅胶，湿法装柱，以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂进行洗脱，共收集3部分样品，分别命名为E1、E2、E3，E1部分为样品的绿色色带全部出柱后即停止收集，E2部分为以二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1的溶液为起始溶剂洗脱四个保留体积的溶剂浓缩后的产物，E3部分为纯甲醇洗脱部分，E1和E3部分均弃去；使用的制备薄层板为德国Merck生产的TLC Silica Gel Plate 60 F254 Glass plates；
H：以二氯甲烷:甲醇的体积比为2.6:1的溶液为展开剂，将E2部分进行制备薄层分离，分别得到4个样品，分别为E2-1、E2-2、E2-3、E2-4，其中，E2-1的Rf值为0.90、E2-2的Rf值为0.56～0.60、E2-3的Rf值为0.40～0.50、E2-4的Rf值为0.20～0.26；
I：将E2-2、E2-3、E2-4进一步进行制备薄层,其中，E2-2、E2-3均以正己烷:丙酮的体积比为1.5:1的溶液为展开剂，且采取二次展开，E2-2得到两个样品分别命名为E2-2-1和E2-2-2，E2-2-1和E2-2-2的Rf值分别为0.40和0.32；E2-3得到两个样品分别命名为E2-3-1和E2-3-2，二者的Rf值分别为0.41和0.35；E2-4以正己烷:乙酸乙酯的体积比为1:2的溶液为展开剂，得到两个样品，分别命名为E2-4-1和E2-4-2，二者的Rf值分别为0.27和0.21；E2-2-1、E2-2-2、E2-3-1、E2-3-2、E2-4-1、E2-4-2分别对应6个酰胺类化合物的1、2、3、4、5、6。
在整个分离提取过程中，温度≤50℃。
步骤G所述柱色谱硅胶的规格为200目。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。