一种烟曲霉菌半乳甘露聚糖多克隆抗体的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是用于针对烟曲霉菌半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)抗原的一种多克隆抗体及其制备方法。

背景技术：

曲霉菌(Aspergillus)是一种重要的条件致病菌,常感染免疫能力低下或免疫能力缺陷的患者。烟曲霉菌是引起免疫抑制患者严重深部曲霉菌感染的最常见病原菌，病死率很高。

近年来，随着抗生素的大量滥用和免疫抑制剂在临床的广泛使用，侵袭性深部真菌感染的发病率和病死率越来越高。其中，曲霉特别是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)已经逐渐成为临床上一种重要的致病真菌。侵袭性曲霉病在血液病和造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplants,HSCT)患者中死亡率高达70％～90％。

免疫学检测方法其灵敏度和特异性都较无菌体液培养及组织活检方法有明显的优势，正逐渐成为烟曲霉菌检测的常用方法，其中酶联免疫吸附试验(ELISA)技术具有操作简单，灵敏度高，检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。

经证实半乳甘露聚糖作为曲霉菌的主要抗原成分存在于曲霉菌细胞壁上，也是细胞壁主要抗原成分。烟曲霉菌半乳甘露聚糖发现在感染的动物模型和侵袭性曲霉病患者的血清中含量较高，因此作为诊断曲霉菌感染的标志物。通过特异性针对烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的抗体实现对曲霉菌的检测，检测血液敏感性达到80％以上。在烟曲霉菌的临床检测中，目前国际市场上有为数不多的免疫检测产品，如：Bio-Rad公司的双抗体夹心ELISA产品。我国国内并没有真正用于烟曲霉菌临床检测的免疫学检测产品。而免疫学检测产品的关键在于能否得到合适的抗体，因此，制备针对烟曲霉半乳甘露聚糖抗原的抗体成为开发该抗原检测产品的关键。

烟曲霉菌半乳甘露聚糖是一种多糖，而多糖类物质因为结构特殊、免疫原性差、结构类似，很多是半抗原，很难像蛋白免疫原一样容易得到单克隆抗体，经常需要对抗原表位进行化学修饰，使其成为完全抗原才能进行免疫。尽管现有技术中公开有相关实验进行抗烟曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备，但其方法复杂，周期较长且成本高；现有技术中公开的抗烟曲霉菌半乳甘露聚糖多克隆抗体的制备方法，主要通过烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原粗提物、灭活孢子等混合抗原作为免疫原免疫动物产生抗体后纯化。现有纯化技术主要包括硫酸铵盐析法、亲和层析法、透析、葡聚糖凝胶和亲和层析纯化等方法。

申请号CN201210011794.2的中国发明专利公开了一种烟曲霉菌多克隆抗体的制备方法，此发明中利用硫酸铵盐析法和亲和层析法初步纯化血清得到了烟曲霉菌多克隆抗体，然而此法仅除去部分杂质且获得多克隆抗体效价较低。

CN105435758A的中国专利公开了一种以黄芪甲苷为配基的免疫亲和层析柱及其应用，此发明中采用黄芪甲苷作为配基与抗体结合，固相载体琼脂糖凝胶、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃或聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶中的一种，得到了纯度较高的黄芪甲苷单克隆抗体但纯化得到的单克隆抗体的效价仅达1:7500。

综上所述，尽管现有技术中公开了烟曲霉半乳甘露聚糖多克隆抗体的制备方法，但是上述方法获得的产品的多克隆抗体的效价不能满足在临床检测烟曲霉菌的应用，迫切需要一种新的方法制备出效价高的抗半乳甘露聚糖抗原的多克隆抗体。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对以上不足提供了提供一种纯度更高的烟曲霉菌半乳甘露聚糖多克隆抗体及其制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

烟曲霉菌半乳甘露聚糖多克隆抗体的制备，包括如下步骤：

(a)用烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫动物；

(b)从免疫后的动物体内取血，分离血清；

(c)初步提取步骤(b)得到的血清，得到粗提多克隆抗体；

(d)烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原偶联微珠的制备；

(e)利用步骤(d)制备的产品进一步对步骤(c)得到的产物进行免疫亲和层析纯化。

上述步骤(a)中烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫动物，所述免疫方法采用皮下注射、足垫注射、脾内注射、静脉注射或腹腔注射，所述免疫动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪或驴，优选兔，所述免疫剂量可视具体动物种类而定，优选的免疫剂量为0.01-0.1mg/只/次，初次免疫后每隔2-4周免疫进行一次，免疫次数≥3次；优选的，所述的初次免疫后每2周免疫1次，免疫次数为3-5次，更优选的免疫次数为3次。

本发明所述的步骤(b)中，优选的，从免疫后的动物体内取血前，还包括测定免疫后动物的血清效价的步骤，更优选的，所述的测定免疫后动物的血清效价步骤在免疫后每隔1-7天进行一次。所述的步骤(b)中从免疫后的动物体内取血为处死后采血，也可以不处死。更优选的，所述的从免疫后的动物体内取血步骤包括：用颈动脉放血的方法采血，待血液凝固，血清分离出后，离心，取上清。

本发明所述步骤(c)中，所述粗提方法为饱和硫酸铵盐析法，所述步骤包括：取步骤(b)中得到的血清，加入等体积生理盐水，再加入双倍体积的饱和硫酸铵溶液，0-10℃低温沉淀过夜，优选为4℃；低温8000g-12000g离心5-20min收集沉淀，优选10000g离心10min；沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，再缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，0-10℃低温静置0.6-1.2h，优选为4℃静置1h；8000g-12000g离心5-20min收集沉淀，优选10000g离心10min,磷酸缓冲液复溶，2-8℃保存备用。

本发明所述(d)中抗原偶联微珠的制备方法包括：将半乳甘露聚糖抗原与蛋白A微珠随机偶联；用5-15倍体积的缓冲液洗涤偶联微珠两次，后重悬微珠，留取样品；加入足量定向偶联剂孵育并留取样品；终止交联及磁珠保存；

所述随机偶联包含将半乳甘露聚糖抗原与蛋白A微珠混匀成为稀薄的浆状，室温摇动混匀孵育0.5-2h,优选1h；所述抗原与蛋白A混合的比例为按照1mL蛋白A微珠与1-4mg抗原比例混匀，优选1mL蛋白A微珠2mg抗原比例。所述缓冲液为pH8.0-9.5的0.2mol/L硼酸钠缓冲液，优选的pH9.00.2mol/L硼酸钠缓冲液；所述离心选自3000g离心2min，10000g离心30s中的一种；所述定向偶联剂为固体二甲基庚二酸；所述定向偶联剂加入量的终浓度为20mmol/L；所述定向偶联剂孵育为室温孵育30min。所述留样为留取相当于10ml交联微珠的样品。

所述终止交联包括加入0.1-0.25mol/L终止液洗涤微珠1次终止交联，加入0.2mol/L乙醇胺溶液重悬磁珠，室温孵育2h，混匀；所述终止液为0.1-0.25mol/L乙醇胺溶液。所述保存包括以磷酸缓冲液洗涤微珠，后重悬于磷酸缓冲液，并加入硫柳汞保存。

在本发明所述步骤(e)中所述免疫亲和层析柱的制备方法包括：将烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原偶联微珠装入层析柱，用与待纯化抗体溶液相同的缓冲液洗柱，并采用20倍柱体积的缓冲液进行冲洗柱体，得到免疫亲和层析柱；

在本发明所述步骤(e)中所述免疫亲和层析法利用免疫亲和层析柱中的抗原偶联微珠中的烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原作为配基与抗体结合，微珠proteinA作为基质；

在本发明所述步骤(e)中利用免疫亲和层析的方法纯化抗烟曲霉菌半乳甘露聚糖多克隆抗体的步骤包括：

1)粗提抗体转入所述免疫亲和层析柱中，并利用结合缓冲液冲洗；

2)对结合抗体的层析柱进行预洗脱，后利用分段洗脱法洗脱抗体，并检测；

3)步骤2)所得抗体进行透析纯化得到纯化抗体；

4)层析柱的再生与保存。

所述步骤1)中粗提抗体转入层析柱采用蠕动泵控制流速；所述流速采用每毫升柱体积大约1m/h的流速；所述结合缓冲液洗柱体积为10-25倍柱床体积缓冲液洗柱；所述的结合缓冲液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)等中的一种。

所述步骤2)预洗脱采用预洗缓冲液，洗脱体积为10-25倍柱床体积缓冲液；所述分段洗脱利用0.4-0.8倍柱体积的洗脱缓冲液对柱床进行连续洗脱；所述洗脱液进行分管收集；所述洗脱液选自0.2M pH2.8甘氨酸的HCl缓冲液、0.1M pH3.0甘氨酸缓冲液、7M脲、1M乙酸和0.2M氯化钾，优选为pH3.0的0.1M甘氨酸缓冲液；所述检测采用SDS-PAGE电泳检测。

所述步骤4)中层析柱的再生利用起始缓冲液冲洗基质，所用体积为10-25倍柱体积的起始缓冲液；所述层析保存为加入0.01％硫柳汞，并于4℃冰箱保存。

用上述方法制备得到的多克隆抗体及制备方法是需要本发明保护的。

本发明的另一方面提供了一种所述的烟曲霉半乳甘露聚糖多克隆抗体在制备用于检测曲霉菌疾病检测试剂盒中的应用。所述检测指抗原与抗体间的特异性反应。本领域技术人员知晓，试剂盒可包括抗原、抗体、酶标抗体、洗涤液、底物显色液、终止液等，本发明对此不作限定。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种抗烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的多克隆抗体的制备方法。本发明得到的多克隆抗体为国内首例使用免疫亲和层析提纯的抗烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的多克隆抗体，填补了国内空白。实验结果表明，用本发明所属方法制得的多克隆抗体具有效价高，特异性好的特点，用SDS-PAGE显示为均一抗体产物，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1×10⁶，该抗体在侵袭性真菌疾病临床诊断领域中，应用前景广阔。

附图说明

图1显示了兔IgG型多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果；

图2显示了兔IgG型多克隆抗体的效价测定的结果。

具体实施方式

实施例1抗烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的多克隆抗体的制备

所使用的烟曲霉菌半乳甘露聚糖采用专利CN104945527A中实施例4的方法制备得到。

1.免疫动物

将烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。

2.多克隆抗体的获得

1)效价测定：免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价1次，免疫次数不少于3次。

2)分离抗血清：血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20℃保存。

3.用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化

1)取2ml抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀过夜；

2)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2mLPBS溶解，缓慢滴加1ml饱和硫酸铵溶液，4℃静置1小时；

3)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用1mLPBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜。

4.烟曲霉菌半乳甘露聚糖抗原偶联微球的制备

1)将半乳甘露聚糖结合到蛋白A微珠上。按每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单克隆抗体将抗体和蛋白A混合成为稀薄的匀浆，在总量为10mL的溶液中加入大约1.5mL微珠，室温孵育1h，轻轻摇动混匀；

2)用10倍体积pH9.0的0.2mol/L硼酸钠洗涤微珠2次，每次以3000g离心2min，或10000g离心30s；

3)用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠，留取相当于10mL湿微珠的样品。加入足量的二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L；

4)室温孵育30min，使结合在蛋白A微珠上的半乳甘露聚糖与微珠基质发生交联。并轻轻混匀。留取相当于10ml交联微珠的样品；

5)用0.2mol/L乙醇胺(pH8.0)洗涤微珠1次以终止交联反应。然后将其重悬于0.2mol/L乙醇胺溶液中，室温孵育2h，轻轻混匀。微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS磷酸缓冲液(0.01M)，加入硫柳汞保存。

5.多克隆抗体的分离纯化步骤如下：

1)将半乳甘露聚糖交联的微珠转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器，收集残留的微珠；

2)用20倍柱床体积与待纯化抗体溶液相同的缓冲液洗柱；

3)将待纯化抗体溶液加入层析柱，按每毫升柱体积大约1m/h的流速，使抗体溶液流过层析柱，用蠕动泵控制流速；

4)用10-15倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；

5)用10-15倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；

6)采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分；

7)检测每管的抗体含量，将浓度高的各管合并，根据抗体的用途，需对收集的抗体洗脱液透析；

8)用15倍柱床体积的起始缓冲液流经基质，使层析柱再生。加入0.01％硫柳汞可长期保存于4℃的环境中。

实施例2抗体的检测

1.SDS-PAGE电泳检测

对实施例1制得的抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。实验结果见图1(pAb泳道为多抗，M泳道为蛋白Marker)。由图中可看出，在25KD和50KD分子量区有清晰明显的条带且无杂带，说明抗体纯度很高。

2.效价测定

用间接ELISA法对抗体效价对实施例1中得到的抗体进行效价测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为磷酸盐缓冲液溶液。检测结果见图2。从结果可看出，该抗体效价大于1:1×10⁶，表明该抗体的效价很高。

应当知道只是用实施例对本发明进行了描述，在本发明基础上做出的改进仍属本发明范畴。