一种用于大量扩增PD‑1基因重组活化T细胞的培养基、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术及细胞治疗的技术工程领域，具体涉及一种PD-1基因重组活化T细胞培养基、试剂盒及其应用。详细内容包含：培养基、试剂盒以及大量扩增PD-1基因重组活化T细胞中的方法。

背景技术：

目前，在肿瘤细胞免疫治疗中，T细胞和DC细胞是抗肿瘤细胞免疫的核心角色，然而，目前报道的这些免疫细胞普遍存在着培养成本高、扩增数量有限(扩增数量一般可在(1-3)×10⁹)、扩增时间长、转染效率不稳定等不足，直接影响其抗肿瘤的效果。

将自体或脐带血来源的T细胞转染为PD-1基因重组活化T细胞，并大量扩增，从而应用于临床研究是肿瘤免疫治疗研究的重要内容之一。专利申请201610083007.3(名称：PD-1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro及包装与应用)提出了一种有效的途径，可通过采用该专利申请获得的重组逆转录病毒质粒Lenti-PD-1-Puro体外感染T细胞，从而达到敲除T细胞上PD-1受体，即获得PD-1基因重组活化T细胞。但是为能够实现该方法的临床有效应用，对该PD-1基因重组活化T细胞的有效的规模化培养则成为了主要难题。

技术实现要素：

本发明的目的即是为提高PD-1基因重组活化T细胞的转染效率、促进转染后T细胞的扩增速度、减少扩增时间，提供一种能够经济、简便、高效地将自体或脐带血T细胞转变为PD-1基因重组活化的T细胞并且可以大量增殖的培养基、试剂盒及其应用，从而提高该活化T细胞对肿瘤或其它相关疾病的治疗作用。

本发明的一种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基，包含有：基础培养基，所述基础培养基为1640培养基，还包含有：80-120ng·ml^-1的OKT3、800-1200U·ml^-1的IL-2、80-120ug·ml^-1的PHA、8-10ng·ml^-1的IL-4、800-1200U·ml^-1的GM-CSF。

优选的，上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基中，可包含有：95-105ng·ml^-1的OKT3，960-1060U·ml^-1的IL-2，95-105ug·ml^-1的PHA，8-10ng·ml^-1的IL-4，960-1060U·ml^-1的GM-CSF；更优选的，包含有98-102ng·ml^-1的OKT3，980-1020U·ml^-1的IL-2，98-102ug·ml^-1的PHA，8-10ng·ml^-1的IL-4，980-1020U·ml^-1的GM-CSF，最优选的，包含有100ng·ml^-1的OKT3，1000U·ml^-1的IL-2，100ug·ml^-1的PHA，10ng·ml^-1的IL-4，1000U·ml^-1的GM-CSF。

本发明还提供了一种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的试剂盒，该试剂盒包含有上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基。

本发明还提供了上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基或试剂盒的一种应用，其包括步骤：PD-1基因重组活化T细胞的预培养、PD-1基因重组活化T细胞的扩增培养；所述预培养是指通过Ficoll两步分离法从自体T细胞或脐带血来源T细胞分离出单个核细胞，经培养孵育后，搜集悬浮细胞，采用PD-1基因重组病毒Lenti-PD-1-Puro进行病毒感染，离心培养获得PD-1基因重组活化的T细胞；所述扩增培养是指将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞置于本发明的培养基接种培养。

优选的，上述所述应用中，所述预培养具体是为：将人自体T细胞或脐带血来源T细胞利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞，置于1640培养基，37℃、5％CO2孵育2小时后搜集悬浮细胞，将含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基与本发明的培养基按1:1(v/v)混合后感染T细胞，按感染复数5:1，调整细胞浓度为(1.0-1.2)×10⁶ml^-1，同时加入polybrener 10ug/ml增加感染效率，感染过夜后离心T细胞，并更换新鲜的本发明的培养基继续培养，即为PD-1基因重组活化的T细胞。所述含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基源自中国专利申请号201610083007.3实施例所得。

优选的，上述所述应用中，所述PD-1基因重组活化T细胞的扩增培养是为：将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞置于本发明的培养基接种于225cm²培养瓶中，接种密度为3～5×10⁶PD-1基因重组活化T细胞/孔，2-3日半量换液。

本发明还提供了上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基或试剂盒的另一种应用，其包括步骤：PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞的预培养、PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞的共培养；所述预培养是指通过Ficoll两步分离法从自体T细胞或脐带血来源T细胞分离出单个核细胞，经培养孵育后，收集贴壁细胞即DC细胞进行培养，并搜集悬浮细胞采用PD-1基因重组病毒Lenti-PD-1-Puro进行病毒感染，离心培养获得PD-1基因重组活化的T细胞；所述共培养是指将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞和DC细胞置于本发明的培养基接种培养。

优选的，上述所述应用中，所述预培养是为：将人自体T细胞或脐带血来源T细胞利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞，置于1640培养基，37℃、5％CO2孵育2小时后收集贴壁细胞即DC细胞，用含有1000U.ml^-1的GM-CSF和10ng.ml^-1的IL-4的1640培养基继续培养，第3天和第5天半量置换培养基，将培养第5天的DC细胞用终浓度为10μmol/L的唑来膦酸预处理48小时后收集，生理盐水洗涤1次，获得预培养的DC细胞；

搜集悬浮细胞，将含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基(专利申请号201610083007.3实施例所得)与权利要求1或2所述的培养基按1:1(v/v)混合后感染T细胞，按感染复数5:1，调整细胞浓度为(1.0-1.2)×10⁶ml^-1，同时加入polybrener 10ug/ml增加感染效率，感染过夜后离心T细胞，并更换新鲜的权利要求1或2所述的培养基继续培养，即为PD-1基因重组活化的T细胞。

优选的，上述所述应用中，所述共培养是为：将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞和DC细胞置于本发明的培养基接种于225cm²培养瓶中，接种密度为3～5×10⁶PD-1基因重组活化T细胞/孔，用本发明的培养基进行培养，此后2-3日半量换液。

优选的，上述所述应用中，所述共培养是将DC细胞与PD-1基因重组活化的T细胞按细胞数比1：100混合培养，培养基为本发明所述培养基，培养条件37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。

利用本发明的培养基，在无需加入异体血清及其他活化T细胞因子的条件下可以大量扩增PD-1基因重组活化的T细胞，即能够将人PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞同时大量扩增，且该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、效果稳定。

其中，需要说明的是，本文中所用的术语“PD-1基因重组活化T细胞”是利用包装好的重组病毒质粒Lentivirus PD-1-Puro(来源于中国专利申请号：201610083007.3)导入T细胞，从而达到敲除T细胞上的PD-1、解除肿瘤患者T细胞的抑制状态并使其激活进而攻击肿瘤细胞。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基。根据本发明的实施例，该培养基中含有OKT3、IL-2、PHA、L-4、GM-CSF，也可含有一定的唑来膦酸如10μmol/L。由此，利用本发明所制备的培养基能够高效地将人PD-1基因重组活化T细胞进行大量扩增，并且增殖时间短、效果稳定、操作简便、成本较低。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的培养基。由此，利用本发明的试剂盒能够有效地将人PD-1基因重组活化T细胞活化增殖，且应用该试剂盒的诱导方法快速高效、经济简便、效果稳定。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的试剂盒在大量扩增PD-1基因重组活化T细胞中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒大量扩增PD-1基因重组活化T细胞，快速高效、经济简便、培养时间短、增殖效果稳定，能够获得典型的PD-1基因重组活化T细胞。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种大量扩增沉默PD-1基因的活化T细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述的培养基，培养人PD-1基因重组活化T细胞，以便同时扩增PD-1基因重组活化T细胞。由此，利用本发明的大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的方法，能够在不加入异体血清等条件下，高效地将人PD-1基因重组活化T细胞大量增殖，且该方法诱导过程快速，操作简便，效果稳定，成本较低。

利用本发明的培养基，在无需加入异体血清的条件下，即能够将人PD-1基因重组活化T细胞大量扩增，且快速高效、经济简便、效果稳定。

本发明的培养基中，合理用量的IL-4与IL-2的联合使用能够起到更好的刺激活化T细胞的作用，而OKT3(CD3单克隆抗体)的使用则能够协同活化T细胞，从而提高PD-1基因重组活化T细胞的转染效率、促进转染后T细胞的扩增速度。

本发明提供了一种能够经济、简便、高效地将自体或脐带血T细胞转变为PD-1基因重组活化的T细胞并且可以大量增殖的培养基、试剂盒及其应用，提高了PD-1基因重组活化T细胞的转染效率、促进了转染后T细胞的扩增速度、减少了扩增时间，从而提高了该活化T细胞对肿瘤或其它相关疾病的治疗作用。

附图说明

图1大量扩增的PD-1基因重组活化T细胞的形态结构图；图1a为分离第0天的T细胞，图1b为培养第7天的T细胞，图1c为培养第14天的T细胞，图1d为培养第21天的T细胞；

图2大量扩增PD-1基因重组活化T细胞时，PD-1基因重组活化T细胞PD-1基因的表达(Western blotting蛋白定量检测)，即PD-1蛋白定量检测结果图；图中A：空白质粒的对照组；B：培养14天的CIK+重组PD-1逆转录病毒质粒组；C：培养28天的CIK+重组PD-1逆转录病毒质粒组；

图3采用PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro(专利申请号：201610083007.3)与T细胞共培养，即获得PD-1基因重组活化T细胞，大量扩增该T细胞，在增殖的第14天，利用Lenti-PD-1-Puro上携带的GFP荧光标记，采用免疫荧光检测T细胞的上的PD-1基因，证实PD-1基因重组活化T细胞上的PD-1基因被敲除的免疫荧光结果图；

图4大量扩增PD-1基因重组活化T细胞，在活化T细胞增殖的第14天，采用流式细胞仪，利用PD-1流式标记抗体来检测PD-1基因重组活化T细胞上PD-1基因的表达的结果图。PD-1基因在敲除前后的表达分别是：81.3％vs 10.1％。图4a:第28天的CIK细胞高表达PD1(85.3％),图4b:重组PD-1逆转录病毒质粒显著抑制PD-1的表达(10.1％),图4c:MCF-7高表达PD-L1。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1.人PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞的预培养

材料与试剂：淋巴细胞分离液(Ficoll)(天津灏洋生物科技有限公司)；1640培养基(Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青)；细胞计数试剂盒(CCK-8)(日本Dojindo公司)；凋亡试剂盒(日本Dojindo公司)；IL-2、INF-γ、CD3单抗、IL-1、IL-4(Peprotech公司产品)；植物血凝素(PHA)(美国Sigma公司)；CD3-FITC/CD56-PE,PD1-PE鼠抗人单克隆抗体及同亚型对照抗体兔抗鼠IgG(美国eBioscience公司)；FC500流式细胞仪和相应软件(美国Beckman Coulter公司)；GM-CSF(Peprotech公司产品)；

本发明的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基(简称本发明的培养基)，其中含有基础培养基1640培养基，以1640培养基为基准，还包含有100ng·ml^-1的OKT3，1000U·ml^-1的IL-2，100ug·ml^-1的PHA，10ng·ml^-1的IL-4，1000U·ml^-1的GM-CSF。

方法步骤：

1.Ficoll两步分离法从人自体T细胞(从肝癌志愿者静脉取血50ml)分离出单个核细胞，用不含血清培养基(美国LONZA)调整细胞浓度为3×10⁶.ml^-1，在37℃，5％CO2培养箱中培养，于培养的第1天加入终浓度为1000U.ml^-1的IFN-γ；第2天加入终浓度为100ng.ml^-1的CD3单抗,1000U.ml^-1的IL-2，100ug.ml^-1的PHA；后每隔1～2d补充本发明的培养基，调整细胞浓度为3×10⁶.ml^-1，IL-2终浓度为1000U.ml^-1，培养箱中继续培养、传代。该步骤可作为细胞培养前的筛选，以期获得较高纯度较多量的T细胞。

2.将经上述步骤1所得培养细胞，置于1640培养基，37℃，5％CO2孵育2小时收集贴壁细胞(DC细胞)，用含有1000U.ml^-1的GM-CSF和10ng.ml^-1的IL-4的1640培养基继续培养，第3天和第5天半量置换培养基，将培养第5天的DC细胞用终浓度为10μmol/L的唑来膦酸预处理48小时后收集，生理盐水洗涤1次，获得预培养的DC细胞；

3.搜集悬浮细胞，将含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基(专利申请号201610083007.3的实施例所得)与本发明的培养基按1:1(v/v)混合后感染T细胞，按感染复数5:1，调整细胞浓度为1.0×10⁶ml^-1，同时加入polybrener 10ug/ml增加感染效率，感染过夜后离心T细胞，并更换新鲜的本发明的培养基继续培养48小时，即为PD-1基因重组活化的T细胞，此时Lenti-PD-1-Puro可敲除T细胞中PD-1受体。

实施例2.人PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞的共培养。

将实施例1预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞和DC细胞置于本发明的培养基接种于225cm²培养瓶中，将DC细胞与PD-1基因重组活化的T细胞按细胞数比1：100混合培养，接种密度为(3～5)×10⁶PD-1基因重组活化T细胞/孔，用本发明的培养基进行培养，培养条件37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，此后3日半量换液，培养14天可见典型样PD-1基因重组活化T细胞形成。培养过程中，于不同时间点，利用倒置相差显微镜观察PD-1基因重组活化T细胞的生长形态、通过免疫荧光及流式细胞仪检测PD-1基因重组活化T细胞标记基因的表达情况。

当对PD-1基因的活化T细胞进行培养时，各种检测结果如下：

PD-1基因重组活化T细胞分化培养0、7、14、21天的形态结构如图1a-图1d所示。由图可以看出，培养前T细胞呈分散生长；培养第7天，PD-1基因重组活化T细胞发生明显形变，呈克隆样生长，初步呈现样PD-1基因重组活化T细胞形态；诱导分化第14天，PD-1基因重组活化T细胞形态较为均一，呈现典型样PD-1基因重组活化T细胞形态，50mL血经培养可得到约(8-9)×10¹⁰个活化T细胞；在培养的第21天，PD-1基因重组活化T细胞会进一步增殖，PD-1基因重组活化T细胞形态明显不均一。由此表明，诱导分化14天是较好的时间点，而且，这时的PD-1基因重组活化T细胞可以进行收集。

PD-1基因重组活化T细胞分化培养0、7、14、21、28天，PD-1基因重组活化T细胞PD-1基因表达检测结果如图2所示。由图2可以看出，在培养的前14天，随着培养时间的延长，PD-1基因表达逐渐下调，大多数PD-1基因重组活化T细胞在培养后第14天达到最低的表达水平；14天以后，PD-1基因重组活化T细胞标记基因的表达下降不再明显。

其中，分化培养第14天的PD-1基因重组活化T细胞的免疫荧光及流式PD-1基因重组活化T细胞流式细胞仪检测的结果分别如图3和图4所示。所述鉴定是通过检测PD-1基因重组活化的T细胞特异标记CD3实现的。从图3的免疫荧光结果可见：PD-1基因重组活化T细胞培养后第14天PD-1基因表达上呈阴性(图3b)，活化T细胞用做阳性对照，可见呈阳性(图3a)，同时，PD-1基因重组活化T细胞PD-1基因减少。其中，图中为绿色荧光下观测到的荧光染色结果，图中标尺为20um。从图4流式细胞仪检测结果可见，培养第14天形成的PD-1基因重组活化T细胞基本不表达PD-1基因。上述结果均表明PD-1基因重组活化T细胞成功敲除了PD-1基因，呈现了PD-1基因不表达的状态。

实施例3.人PD-1基因重组活化T细胞的预培养

本发明的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基(简称本发明的培养基)同实施例1。

方法步骤：

1.Ficoll两步分离法从人自体T细胞(从肝癌志愿者静脉取血50ml)分离出单个核细胞，用不含血清培养基调整细胞浓度为3×10⁶.ml^-1，在37℃，5％CO2培养箱中培养，于培养的第1天加入终浓度为1000U.ml^-1的IFN-γ；第2天加入终浓度为100ng.ml^-1的CD3单抗,1000U.ml^-1的IL-2，100ug.ml^-1的PHA；后每隔1～2d补充本发明的的培养基，调整细胞浓度为3×10⁶.ml^-1，IL-2终浓度为1000U.ml^-1，培养箱中继续培养、传代。该步骤可作为细胞培养前的筛选，以期获得较高纯度较多量的T细胞。

2.将经上述步骤1所得培养细胞，置于1640培养基，37℃，5％CO2孵育2小时除去贴壁细胞(DC细胞)，搜集悬浮细胞，将含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基(专利申请号201610083007.3的实施例所得)与本发明的培养基按1:1(v/v)混合后感染T细胞，按感染复数5:1，调整细胞浓度为1.0×10⁶ml^-1，同时加入polybrener 10ug/ml增加感染效率，感染过夜后离心T细胞，并更换新鲜的本发明的培养基继续培养48小时，即为PD-1基因重组活化的T细胞，此时Lenti-PD-1-Puro可敲除T细胞中PD-1受体。

实施例4.人PD-1基因重组活化T细胞的培养

将实施例3预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞置于本发明的培养基(如实施例1所述)接种于225cm²培养瓶中，接种密度为(3～5)×10⁶PD-1基因重组活化T细胞/孔，用本发明的培养基进行培养，培养条件37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，此后3日半量换液，培养14天可见典型样PD-1基因重组活化T细胞形成。培养过程中，于不同时间点，利用倒置相差显微镜观察PD-1基因重组活化T细胞的生长形态、通过免疫荧光及流式细胞仪检测PD-1基因重组活化T细胞标记基因的表达情况。与实施例1-2所得结果相比，实施例3-4采用50mL血经培养可得到约(6-8)×10¹⁰个活化T细胞，因而采用T细胞和DC细胞共培养的方式较佳，由于DC细胞的协同作用，再结合采用本发明的培养基，能够实现对本发明的PD-1基因重组活化T细胞进行更加有效的扩增。