检测支原体的引物组、试剂盒及检测支原体污染的方法与流程

本发明涉及一种用于检测支原体的引物组、试剂盒及检测支原体污染的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

支原体(Mycoplasma)污染是细胞培养过程中最常见的污染之一，特别是在哺乳动物细胞的培养过程中，支原体污染问题尤其令人头疼，主要原因有以下三点：1)支原体体积非常小，直径为0.1μm，一般过滤除菌无法去除，光学显微镜下难以看清它的形态结构；2)支原体生命力顽强，能在偏碱条件(pH 7.6～8.0)下生存，且对青霉素有抗药性；3)细胞受支原体污染初期，部分敏感细胞可见细胞生长增增殖变慢、形态变圆。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。支原体最终会导致细胞死亡，不过更常见的情况是，支原体与细胞共存。在这过程当中，支原体慢慢增殖，直至对细胞产生明显的影响，如干扰细胞迁移、信号转导、淋巴细胞活化和细胞因子表达。对于相关科研工作者来说，最可怕的是支原体污染在不知不觉中改变许多参数，使研究成果的可信度大打折扣。

常用的支原体检测手段包括传统的培养法、ELISA法、PCR法等，目前PCR法是主流的支原体检测方法，然而目前已有的PCR支原体检测手段仍存在诸多问题，例如，广谱性不够、灵敏度不够或特异性不够等。

技术实现要素：

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种用于检测支原体的引物组，其包括：正向引物，其序列如SEQ ID No.1所示；以及反向引物，其序列如SEQ ID No.2所示。

本发明另一方面提供了一种用于检测支原体的试剂盒，其包括上述的用于检测支原体的引物组。

优选的，所述试剂盒还包括：支原体裂解缓冲液，聚合酶链式反应试剂；以及阳性对照。

更优选的，所述阳性对照包含支原体16S rDNA保守序列的阳性质粒。

优选的，所述试剂盒还包括阴性对照。

本发明再一方面提供了上述试剂盒用于检测支原体污染的用途。

优选的，所述试剂盒用于检测以下支原体中的任意一种或几种：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma。

本发明还一方面提供了一种采用上述的试剂盒检测支原体污染的方法，该方法包括以下步骤：步骤1)支原体裂解：采用所述试剂盒中的支原体裂解缓冲液；处理待检测样品获得裂解液；步骤2)PCR扩增：将步骤1)所获得的裂解液与所述聚合酶链式反应试剂和所述引物组混合，进行PCR扩增反应；步骤3)电泳：将步骤2)所得的PCR扩增产物上电泳，根据电泳条带结果判断是否存在支原体污染。

优选的，所述步骤2)的PCR扩增的条件如下：首先进行步骤a：94℃，10分钟；随后，步骤b：94℃，30秒；步骤c：60℃，30秒；步骤d：72℃，30秒；上述步骤b至步骤d共30个循环；最后进行步骤e：72℃，10分钟。

优选的，所述步骤1)包括：对待检测的样品进行去除细胞碎片的处理，之后离心以沉淀支原体，该支原体沉淀物重新混悬于所述支原体裂解缓冲液中，并在90～95℃下加热3～5分钟。

本发明的检测支原体的引物组，其试剂盒以及采用该试剂盒检测支原体污染的方法，具有以下优点：1)操作简便；2)判读容易：支原体检测的PCR反应产物单一，检测信息容易判断；3)广谱性好且特异性强：本发明特定的引物组专一地扩增支原体16S rDNA保守序列，不仅特异性强，并且能够能够适用于检测多种类型的支原体，广谱性好；4)灵敏度高；因此，本发明的试剂盒能够快速检测支原体污染情况，应用前景很广泛。

附图说明

图1为采用本发明实施例1的引物组扩增15种物种的体细胞DNA和支原体DNA阳性样品后的扩增产物的电泳结果；

图2为采用本发明实施例1的引物组扩增14种支原体DNA样品后的扩增产物的电泳结果；

图3为本发明实施例2的试剂盒的灵敏度试验的结果；

图4为本发明实施例3中三个检测样品的电泳结果。

具体实施方式

在本发明的一个具体实施方案中，一种用于检测支原体的引物组，其包括正向引物和反向引物；正向引物的序列为5'-CGA GTC GGC ATC TAA TAC TAT-3'(参见序列表中的SEQ ID No.1)；反向引物的序列为5'-AAA ACG ACA TTT CTG CCG C-3'(参见序列表中的SEQ ID No.2)。

在本发明的一个具体实施方案中，一种用于检测支原体的试剂盒，其采用上述的引物组。

本发明的试剂盒是采用高灵敏度的PCR技术进行支原体检测。支原体的rDNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区，例如16S rDNA；虽然各种物种之间的碱基序列差别很大，但存在保守序列。发明人经过大量的研究试验，筛选出了可以特异性PCR扩增支原体的16S rDNA保守序列的引物组，不仅广谱性较好，且灵敏度较高。

在本发明的一个具体实施方案中，试剂盒还包括：支原体裂解缓冲液；聚合酶链式反应试剂；以及阳性对照。

其中，关于支原体裂解缓冲液，可以采用常规的支原体裂解缓冲液，诸如0.1mmol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.5％Triton X-100或Tween 20等；可以通过市场途径直接购买获得或自行配置后，装配入试剂盒。

其中，关于聚合酶链式反应试剂，是PCR扩增反应所需的常规试剂，例如Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂和dNTPs等的组合；可以通过市场途径直接购买获得或自行配置后，装配入试剂盒。在本发明的一个具体实施方案中，PCR扩增反应的反应体系为：10倍的缓冲液5μl、dNTPs各200μmol/L、Taq酶2.5μl、待测样品5μl；总体积50μl(其余用灭菌双蒸水补平)。

其中，关于阳性对照，在本发明的一个优选实施方案中，阳性对照可以包含支原体16S rDNA保守序列，更优选的，阳性对照可以为含有支原体16S rDNA保守序列的阳性质粒。当然，在本发明的一个替代实施方案中，可以采用现有的支原体检测试剂盒中的阳性对照，可市购、也可以根据现有技术自行构建。

在本发明的一个优选实施方案中，试剂盒还可以包括阴性对照。阴性对照可以为不含有支原体DNA序列的溶液，例如无菌水、PCR缓冲液、生理盐水等。

在本发明的一个具体实施方案中，上述试剂盒可以用于检测支原体污染。在本发明的一个优选实施方案中，上述试剂盒可以用于检测以下支原体中的任意一种或几种：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma。

在本发明的一个具体实施方案中，一种采用上述的试剂盒检测支原体污染的方法，该方法包括以下步骤：步骤1)支原体裂解：采用所述试剂盒中的支原体裂解缓冲液；处理待检测样品获得裂解液；步骤2)PCR扩增：将步骤1)所获得的裂解液与所述聚合酶链式反应试剂和所述引物组混合，进行PCR扩增反应；步骤3)电泳：将步骤2)所得的PCR扩增产物上电泳，根据电泳条带结果判断是否存在支原体污染。

其中，步骤1)支原体裂解，可以采用常规的获取支原体DNA的方法；例如，将待检测样品煮沸后离心，支原体DNA会溶于离心后的上清中；也可以采用常规的裂解试剂对支原体进行裂解处理，以获取支原体DNA。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤1)包括：对待检测的样品进行去除细胞碎片的处理，之后离心以沉淀支原体，该支原体沉淀物重新混悬于支原体裂解缓冲液中，并在90～95℃下加热3～5分钟。在本发明的一个具体实施方案中，采用低速(例如500～800转/分)、短暂离心2～3分钟，以沉淀细胞碎片；然后取上清液移入新的离心管中，以15000～20000转/分的转速离心10～15分钟，以沉淀支原体；之后，弃上清液，再向离心管中加入支原体裂解缓冲液，并使支原体沉淀物混悬于支原体裂解缓冲液中，最后在90～95℃下加热3～5分钟，以获取支原体DNA。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤2)的PCR扩增的条件如下：首先进行步骤a，在94℃下变性10分钟；随后，步骤b：在94℃下变性30秒；步骤c：在60℃下退火30秒；步骤d：在72℃下延伸30秒；上述步骤b至步骤d共进行30个循环；最后进行步骤e：在72℃下延伸10分钟。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤3)中，步骤2)所得的PCR扩增产物上琼脂糖凝胶电泳，根据跑胶结果判断是否存在支原体污染情况。

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

实施例1：引物组的设计和合成

首先，选定待检测的支原体物种：依据目前细胞培养过程中最常见的支原体污染案例，选定15种常见的支原体物种作为待检测的目标支原体物种：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma；

然后，比对基因库：从美国基因数据库Genbank检索，比对上述15种目标支原体物种的16S rDNA序列，通过xxxx软件进行同源序列分析比对，找到保守专一的序列作为目标片段；

随后，以上述的目标片段设计PCR扩增反应所需的引物。

最后，针对设计出来的引物进行特异性和灵敏度测试；如果特异性不足或者灵敏度不足，则重新设计引物。

经过发明人的大量试验，最终获得的优化引物组如下：

正向引物的序列为5'-CGA GTC GGC ATC TAA TAC TAT-3'(参见序列表中的SEQ ID No.1)；

反向引物的序列为5'-AAA ACG ACA TTT CTG CCG C-3'(参见序列表中的SEQ ID No.2)；

在本实施例中，采用常规方法合成上述引物组。

实施例2：试剂盒的制备

1)参照上述实施例1合成引物组；

2)支原体裂解缓冲液：购自SIGMA-ALDRICH公司生产的支原体裂解试剂(产品号为07066)；

3)聚合酶链式反应试剂：购自TaKaRa生物科技公司生产的“低背景、高灵敏PCR系列”产品，主要包括：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂和dNTPs；

4)阳性对照：为含有支原体16S rDNA保守序列(270bp)的质粒；

5)阴性对照：无菌水。

将上述引物组的正向序列和反向序列分别置于密闭容器中；阳性对照和阴性对照分别置于密闭容器中；再与购得的聚合酶链式反应试剂产品一同装配入试剂盒。

实施例2的用于检测支原体的试剂盒的特异性评价

本发明的目的是为了开发一种能够检测细胞培养过程中的常见支原体污染的试剂盒，必须对支原体样品具有专一性(或者说特异性)。

在特异性评价试验中，以15种物种(兔、马、鸡、狗、绿猴、猪、老鼠、大鼠、猫、人、恒河猴、牛、仓鼠、果蝇、鱼)的体细胞DNA作为特异性检测对象；以支原体DNA质粒(已知的阳性样品)作为阳性对照；采用实施例1的引物组对15种物种的体细胞DNA和支原体DNA阳性样品进行PCR扩增；

参见图1，上述15种物种的体细胞DNA和支原体DNA样品的扩增产品的电泳结果；从图1可以看出，实施例1的引物组仅扩增的支原体DNA的目标片段，15种物种的体细胞DNA的结构均为阴性；该结果表明，本发明的引物组及其试剂盒的特异性良好。

实施例2的用于检测支原体的试剂盒的广谱性评价

本发明的目的是为了开发一种能够检测细胞培养过程中的常见支原体污染的试剂盒，最好能够满足常见支原体物种的广谱性检测。

在广谱性评价试验中，以14种支原体：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma作为广谱性检测对象。

如图2所示，14种支原体DNA样品的检测结果均为阳性，该结果表明，本发明的引物组及其试剂盒的广谱性良好。

实施例2的用于检测支原体的试剂盒的灵敏度评价

在灵敏度评价试验中，以支原体阳性质粒作为检测对象，进行倍比稀释以验证灵敏度。灵敏度测试最高检测量设置为125个质粒拷贝，稀释后依次为：62.5、31.25、15.3、7.81和3.91个拷贝。进行PCR反应、跑胶，验证支原体最低检测量。

检测结果如图3所示，本发明的引物组及其试剂盒能够在31.25copies(即相当于31.25颗支原体的DNA量)获得检测结果，并且在62.5颗支原体(小于100颗支原体)具有较高的灵敏度。

从图3的结果可以看出，本发明的引物组及其试剂盒能够检测出小于100颗支原体的样品，具有较高的灵敏度。

实施例3：检测支原体污染

步骤1)支原体裂解：采用实施例2试剂盒中的支原体裂解缓冲液处理待检测样品(样品1、2和3)获得裂解液；

首先，取0.5-1毫升的待检测样品(细胞培养上清液)加入2毫升的离心管中；以500rpm的转速短暂离心60秒以沉淀细胞碎片；取离心后的上清液移入新的已灭菌的2毫升离心管中；以20000rpm的转速离心10分钟以沉淀支原体，再轻轻吸弃上清液；再向离心管中加入50微升的支原体裂解缓冲液，用移液枪轻轻抽打以混匀沉淀物，以95摄氏度加热3分钟，即获得含有支原体DNA的裂解液；

步骤2)PCR扩增：将步骤1)所获得的裂解液与所述聚合酶链式反应试剂和所述引物组混合，进行PCR扩增反应；

PCR扩增反应体系：10倍的缓冲液5μl、dNTPs各200μmol/L、Taq酶2.5μl、待测样品5μl；总体积50μl(其余用灭菌双蒸水补平)；

PCR扩增采用BIO-RAD T100^TM PCR仪。

PCR扩增的条件如下：

首先进行步骤a，在94℃下变性10分钟；

随后，步骤b：在94℃下变性30秒；步骤c：在60℃下退火30秒；步骤d：在72℃下延伸30秒；上述步骤b至步骤d共进行30个循环；

最后进行步骤e：在72℃下延伸10分钟。

步骤3)电泳：将步骤2)所得的PCR扩增产物上电泳，根据电泳条带结果判断是否存在支原体污染。

电泳条件如下：选用Amresco的琼脂糖凝胶、Bersing的TAE缓冲液；琼脂糖凝胶的浓度为2％：100毫升TAE缓冲液中加入2g琼脂糖凝胶；跑胶电压100V，时间为30分钟；使用标记物为100bpDNA标记物(SMOBio-DM2100)；无需添加上样缓冲液。

关于支原体污染的判断，基于阳性对照和阴性对照的结果。

参上述实施例2的试剂盒中采用的阳性对照(含有支原体16S rDNA保守序列(270bp)的阳性质粒)和阴性对照(无菌水)。

在电泳步骤中，以1μl的阳性对照和1μl的阴性对照作为替代。

参见图4，三个待检测样品中，仅样品1检测出了支原体污染；样品2和样品3未检测出支原体污染。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。