入门载体pAmpGate和pGentGate的构建及使用方法与流程

本发明属于基因工程和分子生物学领域，涉及一种无缝高效的入门载体的构建方法及使用方法，具体涉及入门载体pAmpGate和pGentGate的构建方法及其应用。

背景技术：

现代分子生物学的研究，很大程度上依赖于DNA重组技术，体外人工重组DNA序列，在整个基因克隆的过程中非常关键。随着生物技术的发展，高效经济的DNA重组方法越来越被人们重视和追求。

DNA重组技术中，传统的酶切-连接经典克隆法是最常规的方法，也是目前仍然被广泛使用的方法。该方法利用识别特异的DNA序列的限制性核酸内切酶切割需要克隆的DNA片段和载体序列，产生黏性末端或平末端，然后用DNA连接酶重新连接DNA片段，形成新的重组DNA分子。此方法操作简单且应用广泛，但比较费时，对某些片段失败率高，DNA操作起来没有一致性，且有些序列没有合适的酶切位点。此方法是一种依赖于序列限制性内切酶酶切特性的克隆方法。

通路克隆技术(Gateway Cloning Technology)是一种基于序列重组的克隆方法，其构建过程主要包括入门克隆的构建和目的克隆的构建两步。由BP酶催化BP反应构建入门克隆和由LR酶催化LR反应构建目的克隆是Gateway克隆技术的基础。BP反应和LR反应是一种由整合酶催化的位点特异性重组反应，是一种不依赖于序列限制性内切酶酶切特性的新的克隆方法。在BP反应中，BP酶通过催化携带attB序列的PCR产物和携带attP序列的入门载体生成携带attL的入门克隆和携带attR的副产品(可表示为attB+attP→attL+attR)。在LR反应中，LR酶通过催化携带attL的入门克隆和携带attR的目的载体生成携带attB的目的克隆和携带attP的副产品(可表示为attL+attR→attB+attP)。在Gateway克隆过程中，目的基因克隆至入门载体完成入门克隆的构建后，LR反应可以将目的基因从入门克隆转移到不同的目的载体中，而无须考虑限制性内切酶酶切位点的限制，也无须重新构建入门克隆。而且Gateway技术具有非常大的灵活性，它可以通过Gateway转换系统将任何载体都变成Gateway兼容的目的载体。这正是Gateway克隆的强大之处，因为一旦拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，将目的基因从同一个入门克隆中转移到大量不同功能的Gateway目的载体中去。但是，Gateway技术的一个显著缺点是其所使用的BP酶和LR酶非常昂贵。此外，由于所使用的引物都需要加较长的attB接头，引物长度的增加也增加了构建的费用。另外，BP反应的效率有时较低，在实际操作中有些片段通过BP反应很难克隆进入入门载体，需要重复多次，降低了实验效率和增加了实验费用。

在实际操作中，有时不仅需要将单个基因片段重组至载体中，经常还需要将多个DNA片段按顺序连接拼接并重组至载体。人们发展了多种多样的多个DNA片段按序拼接技术，各有优缺点。其中，MultiSite Gateway拼接技术和Golden Gate拼接技术是近年来发展起来的两种重要的DNA多片段拼接技术。

MultiSite Gateway技术是一种基于Gateway克隆技术的多序列拼接技术。在其基于BP反应构建入门载体的过程中，首先，将多DNA片段分别通过BP反应重组至带有不同attP序列的入门载体中得到多个含DNA不同片段的入门克隆。然后通过LR反应将存在于不同入门克隆中的片段有序的拼接重组至目的载体中完成构建。在MultiSite Gateway构建过程中，整个操作灵活有效，准确定向。但同时此技术需要进行多次BP反应，需要多个带有不同attP序列的入门载体，构建费用昂贵，繁琐。并且最终的拼接序列各片段之间含有重组的“疤痕”序列，并非“无缝”连接。此疤痕序列可能对后续实验产生干扰，不适应于某些实验片段的拼接克隆。

Golden Gate拼接是近年发展起来的一种利用IIS型限制性核酸内切酶(IIS restriction enzyme)介导的拼接技术，因此也称为IIS型克隆拼接法。IIS型限制性内切酶的特异之处是其识别位点和切割位点不相同，它特异性地识别双链DNA上的靶位点，而在识别靶位点的下游非特异性地切割双链DNA，产生黏性末端。在Golden Gate拼接操作中，用DNA连接酶将IIS型限制性内切酶酶切产生的几个带有黏性末端DNA片段按照既定的顺序连接，拼接成不含酶识别位点的DNA片段。并且酶切和连接过程可在一个体系中同时进行，大大简化了操作。此外，Golden Gate克隆拼接法获得的目的产物是“无缝”连接产物。目前，在Golden Gate技术中用的较多的IIS型限制性内切酶包括Bsa1，Bbs1和BsmB1等。Golden Gate由于其经济，便捷，“无逢”使其成为一种理想的新型多片段拼接技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于通过Golden Gate技术构建入门克隆的入门载体。

本发明所提供的入门载体，为含有DNA片段A的环形载体；所述DNA片段A自5’端到3’端依次含有attL1序列、IIs型限制性内切酶A的识别序列、IIs型限制性内切酶B的识别序列、筛选标签序列1、所述IIs型限制性内切酶B的识别序列、所述IIs型限制性内切酶A的识别序列、attL2序列。

所述attL1和所述attL2序列，可通过LR反应将克隆片段从入门克隆中重组至Gateway兼容的目的载体中。

在本发明中，所述IIs型限制性内切酶A具体为BsaI；所述IIs型限制性内切酶B具体为BbsI。本发明选用此两种IIS型限制性内切酶为Golden Gate拼接的序列基础，用于进行Golden Gate重组反应和多片段“无缝”拼接。

在本发明中，所述筛选标签序列1为caR-ccdB-lacZ；所述caR-ccdB-lacZ为自5’端到3’端依次含有caR、ccdB和lacZ的DNA片段；所述caR表示氯霉素抗性基因，所述ccdB表示ccdB致死基因，所述lacZ表示β-半乳糖苷酶基因。

由于本发明所提供的入门载体中含有caR-ccdB-lacZ，因此，在利用所述入门载体进行入门克隆构建的过程中，重组成功的克隆由于caR-ccdB-lacZ元件被目的基因替换，因此ccdB致死基因不再发挥功能，可以在普通的大肠杆菌菌株中(如Top10)繁殖扩增；而未重组成功的克隆由于含有ccdB基因表达ccdB蛋白而使细胞死亡达到筛选目的。此外由于caR-ccdB-lacZ此元件含有β-半乳糖苷酶基因lacZ，重组子也可以通过蓝白斑筛选得到。

在本发明中，所述attL1序列具体为序列表中序列1的第32-131位；所述attL2序列具体为序列表中序列1的第1658-1757位。

所述caR-ccdB-lacZ的序列具体为序列表中序列1的第312-1565位。其中，序列1的第312-971位为所述caR的编码序列；序列1的第990-1295位为所述ccdB的编码序列；序列1的第1314-1565位为所述lacZ的编码序列。

在所述DNA片段A中，在所述attL1序列的上游还有用于测序的上游引物序列Seq-F，在所述attL2序列的下游还有用于测序的下游引物的反向互补序列Seq-R。Seq-F和Seq-R可以用来对构建所得的入门克隆进行测序鉴定。

在本发明中，所述上游引物序列Seq-F具体为序列表中序列1的第1-25位；所述下游引物的反向互补序列Seq-R具体为序列表中序列1的第1781-1804位。

更加具体的，所述DNA片段A的序列为序列表中序列1。

进一步，所述入门载体由所述DNA片段A和骨架片段连接而成；所述骨架片段中含有与所述筛选标签序列1不同的筛选标签序列2，且不含有所述IIs型限制性内切酶A的识别序列和所述IIs型限制性内切酶B的识别序列。

在本发明中，所述筛选标签序列2具体为氨苄青霉素抗性基因序列或庆大霉素抗性基因序列。

更加具体的，含有所述氨苄青霉素抗性基因序列的所述入门载体的序列为序列表中序列2(pAmpGate)；含有所述庆大霉素抗性基因序列的所述入门载体的序列为序列表中序列3(pGentGate)。

如下(A)或(B)所示的生物材料也属于本发明的保护范围。

(A)由入门载体1和入门载体2组成的成套入门载体；所述入门载体1为如上所述的含有所述氨苄青霉素抗性基因序列的所述入门载体(pAmpGate)，所述入门载体2为如上所述的含有所述庆大霉素抗性基因序列的所述入门载体(pGentGate)。

成套入门载体中，这两种抗性的选择可以避免入门克隆的抗性和后续目的载体的抗性相同，从而可简化LR反应之后阳性克隆子的筛选操作。

(B)含所述入门载体的重组菌或重组细胞。

当然，所述入门载体或所述生物材料在基于Golden Gate技术构建入门克隆中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明构建了一种经济高效的入门载体。此入门载体可采用Golden Gate构建方法取代传统的BP反应进行入门克隆的构建，由经济实惠的IIS型限制性核酸内切酶(Bsa1和Bbs1)和DNA连接酶取代昂贵的BP酶，大大节省了实验费用。同时该入门载体既可以用来进行单片段DNA重组克隆，又可以进行多片段高效“无逢”拼接，由于在实际操作中，可采取“两步法”进行片段的酶切连接，因此无须考虑克隆片段中是否含有Bsa1和/或Bbs1酶切位点，是一种不依赖于序列酶切图谱特性的DNA克隆和拼接载体。整个操作过程在一个体系中即可完成，经济，高效且简单。由于此入门载体含有attL序列，因此在后续实验中又可利用Gateway系统中其丰富多样的目的载体进行各种实验而无需重新克隆片段构建入门载体。在实际研究中非常经济便捷。

附图说明

图1为pAmpGate和pGentGate载体测序引物之间的组分示意图，即DNA片段A所含组分示意图。

图2为pAmpGate和pGentGate载体的Bsa1和Bbs1酶切示意图。图中所示分别为pAmpGate和pGentGate载体的Bsa1和Bbs1酶切琼脂糖凝胶电泳图；其中第一条泳道均为Marker，第二条泳道均为各载体酶切条带。

图3为使用Bsa1进行单片段DNA克隆的流程图。入门载体pAmpGate和RGH1基因片段的PCR产物通过Bsa1酶Golden Gate克隆重组得到入门克隆。入门克隆使用Seq-F和Seq-R引物测序正确后，RGH1片段通过LR反应克隆至pEarlyGate101载体中得到最终的目的克隆。图右下部分为Bsa1酶的识别序列和酶切位点示意图。

图4为使用Bbs1进行多片段DNA拼接克隆的流程图。U6，gRHG1和T6的PCR产物通过Bbs1酶Golden Gate按顺序拼接重组至入门载体pGentGate得到入门克隆。入门克隆使用Seq-F和Seq-R引物测序正确后，拼接片段通过LR反应克隆至pMDC99载体中得到最终的目的克隆。图右下部分为Bbs1酶的识别序列和酶切位点示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pGGZ001质粒：Addgene,Cat:48868。

pHSN6A01质粒：Addgene,Cat:50586。

pEarleyGate101载体：Tair,Stock number:CD3-683。

pMDC99载体：Tair,Stock number:CD3-745。

大豆品种williams 82：GRIN-Global,Stock number:PI 518671。

大肠杆菌Top10：天根生化科技有限公司,Cat:CB104-02。

实施例1、入门载体pAmpGate和pGentGate的构建

一、pAmpGate载体的构建

1、caR-ccdB-lacZ元件的构建

首先设计引物Xcm1-Bsa1-Bbs1-F和Xcm1-Bsa1-Bbs1-R，如下：

Xcm1-Bsa1-Bbs1-F：

5’-TCCCCAatacttgtccgGAGACCgcaGTCTTCcTCCGAATT CGCTTACTAAAAGCC-3’；

下划线依次为Xcm1，Bsa1，Bbs1和BamH1酶的识别位点，两个分别为Bsa1和Bbs1酶酶切产生的黏性末端。3个相连核苷酸黑体为N端构建融合蛋白时务必确保其在读码框中。

Xcm1-Bsa1-Bbs1-R：

5’-CCCCAatacttgtacgGAGACCgcaGTCTTCcAGGCCTGAGAAAAAAAAgcggacctcCGAA-3’

下划线依次为Xcm1，Bsa1，Bbs1和Xho1酶的识别位点，两个分别为Bsa1和Bbs1酶酶切产生的黏性末端。3个相连核苷酸黑体为C端构建融合蛋白时务必确保其在读码框中。

以pGGZ001质粒为模板，Xcm1-Bsa1-Bbs1-F和Xcm1-Bsa1-Bbs1-R为引物，按phusion酶(NEB,Cat:M0530)操作说明书PCR高保真扩增得到caR-ccdB-lacZ元件序列，Xcm1酶切PCR产物，琼脂糖电泳纯化大小为1507bp酶切产物。胶回收测序，其序列为序列表中序列1的第142-1648位。

由于caR-ccdB-lacZ元件的存在，因此在入门克隆构建过程中重组成功的克隆由于此元件被目的基因所替换，因此ccdB致死基因不再发挥功能，可以在普通的大肠杆菌菌株中(如Top10)繁殖扩增；而未重组成功的克隆由于含有ccdB基因，表达ccdB蛋白而使细胞死亡达到筛选目的。此外由于此元件含有lacZ基因序列，重组子也可以通过蓝白斑筛选得到。

另外，Bsa1和Bbs1两个IIS型限制性内切酶相连接，为Golden Gate拼接提供了序列基础。此外，载体还设计了Xcm1，BamH1和Xho1等普通限制性核酸内切酶酶切位点可供选择进行入门克隆的构建。

2、携带Ampicillin抗性基因载体骨架的合成

请Genscript公司合成携带Ampicillin抗性基因的高拷贝载体骨架，其骨架序列设计过程如下：

a.设计骨架序列含有pUC复制启始位点和Ampicillin抗性基因序列，并且不含有Xcm1，Bsa1，Bbs1，BamH1和Xho1等酶切位点，将其命名为“ampR”序列；

b.将attL1和attL2序列分别加入到“ampR”序列的两端，并在attL1和attL2的内侧分别设计Seq-F和Seq-R测序序列，得到“attL1-ampR-attL2”序列；

c.在attL1和attL2的两端分别引入Xcm1酶切位点，得到“Xcm1-attL1-ampR-attL2-Xcm1”。

Genscript公司合成“Xcm1-attL1-ampR-attL2-Xcm1”序列，Xcm1酶切且琼脂糖电泳纯化大小为3330bp酶切产物，纯化产物序列如序列表中序列2第1649-4837-1-141位。

attL1和attL2序列为片段从入门克隆通过LR反应重组至目的载体提供了序列基础。在attL1和attL2序列两侧分别设计的Seq-F和Seq-R测序序列，可以用来对构建进行测序鉴定。

3、pAmpGate载体的拼接

使用T4连接酶(NEB，M0202S)，将步骤1和步骤2中的琼脂糖电泳纯化产物按操作说明书连接，转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞(Invitrogen,Cat.11782-018)，挑单克隆测序正确后，得到pAmpGate载体。pAmpGate载体的全序列如序列表中序列2所示，其中第1-25位为Seq-F序列，第32-131位为attL1序列，第156-161位为BsaI识别序列，第169-174位为BbsI识别序列，第312-1565位为caR-ccdB-lacZ元件序列，第1616-1621位为BbsI识别序列，第1629-1634位为BsaI识别序列，第1658-1757位为attL2序列，第1781-1804位为Seq-R序列。pAmpGate载体用Bsa1和Bbs1酶切得到的酶切图谱如图2所示，由图可见，此两种IIs型限制性内切酶分别可酶切得到两个片段，说明pAmpGate载体中分别含有此两种酶的两个酶切位点，与设计和预期一致。

二、pGentGate载体的构建

1、caR-ccdB-lacZ元件的构建

pGentGate的caR-ccdB-lacZ元件的构建同步骤一中pAmpGate载体的构建步骤1所述。

2、携带Gentamicin抗性基因载体骨架的合成

请Genscript公司合成携带Gentamicin抗性基因的高拷贝载体骨架，其骨架序列设计过程如下：

a.设计骨架序列含有pUC复制启始位点和Gentamicin抗性基因序列，并且不含有Xcm1，Bsa1，Bbs1，BamH1和Xho1等酶切位点，将其命名为“gentR”序列；

b.将attL1和attL2序列分别加入到“gentR”序列的两端，并在attL1和attL2的内侧分别设计Seq-F和Seq-R测序序列，得到“attL1-gentR-attL2”序列；

c.在attL1和attL2的两端分别引入Xcm1酶切位点，得到“Xcm1-attL1-gentR-attL2-Xcm1”。

Genscript公司合成“Xcm1-attL1-gentR-attL2-Xcm1”序列，Xcm1酶切且琼脂糖电泳纯化大小为3446bp酶切产物，纯化产物序列如序列表中序列3第1649-4953-1-141位。

attL1和attL2序列为片段从入门克隆通过LR反应重组至目的载体提供了序列基础。在attL1和attL2序列两侧分别设计的Seq-F和Seq-R测序序列，可以用来对构建进行测序鉴定。

3、pGentGate载体的拼接

使用T4连接酶(NEB，M0202S)，将步骤1和步骤2中的琼脂糖电泳纯化产物按操作说明书连接，转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞(Invitrogen,Cat:11782-018)，挑单克隆测序正确后，得到pGentGate载体。pGentGate载体的全序列如序列表中序列3所示，其中第1-25位为Seq-F序列，第32-131位为attL1序列，第156-161位为BsaI识别序列，第169-174位为BbsI识别序列，第312-1565位为caR-ccdB-lacZ元件序列，第1616-1621位为BbsI识别序列，第1629-1634位为BsaI识别序列，第1658-1757位为attL2序列，第1781-1804位为Seq-R序列pGentGate载体用Bsa1和Bbs1酶切得到的酶切图谱如图2所示，由图可见，此两种IIs型限制性内切酶分别可酶切得到两个片段，说明pGentGate载体中分别含有此两种酶的两个酶切位点，与设计和预期一致。。

本实施例构建的入门载体pAmpGate和pGentGate分别含有Ampicillin抗性基因和Gentamicin抗性基因序列，这两种抗性的选择可以避免入门克隆的抗性和后续目的载体的抗性相同，从而可简化LR反应之后阳性克隆子的筛选操作。

实施例2、入门载体pAmpGate和pGentGate的使用

使用实施例1构建的pAmpGate或pGentGate入门载体，可采用Golden Gate的方法进行入门克隆的构建。具体为：首先，将Bsa1(或者Bbs1)酶切位点序列引入正向引物和反向引物中；然后，用高保真DNA聚合酶PCR扩增目的片段并纯化产物；接着，用“两步法”重组拼接片段使其进入入门载体；最后，转化入门克隆到大肠杆菌TOP10感受态并挑选阳性克隆测序完成入门克隆的构建。

在引物的设计过程中，由于载体中attL1侧和attL2侧设计的Bsa1和Bbs1切割位点所产生的黏性末端分别是“ACCT”和“GTAT”(如图1所示)，因此需克隆的最末端的正向引物和反向引物的酶切位点也需设成相应的“ACCT”和“GTAT”以便连接进入载体。为了确保N端或C端的融合蛋白能正确表达，引物中的酶切序列和片段特异引物序列之间无须填补另外的核苷酸，直接相连即可在正确的读码框中翻译。

实验过程中采用“两步法”重组拼接片段，得以保证即使所克隆拼接的片段中含有Bsa1(或者Bbs1)酶切位点，也可以使用此流程完成构建。因为“两步法”中的第二步“Ligation”能使被切割的序列重新连接。因此，此方法是一种不依赖于序列的酶切位点特性的构建方法，保证了不同序列的克隆和拼接操作的一致性，大大简化了实际操作过程。

以下结合具体实例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实例仅用于详细说明本发明pAmpGate或pGentGate入门载体的使用方法，而不用于限制本发明的范围。

一、使用Bsa1进行单片段DNA的克隆

拟克隆大豆抗胞囊线虫相关基因座RHG1中的Glyma.18G022700基因至C端带有YFP标签的Gateway目的载体pEarleyGate101中。构建流程示意图如图3所示，具体操作为：

1、设计引物

根据phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Gmax)大豆基因组序列设计大豆Glyma.18G022700基因的特异正向引物和反向引物，并在引物上分别引入能产生“ACCT”和“GTAT”黏性末端的Bsa1酶切位点序列，引物序列如下：

RHG1-AACT-F：5’-aacaGGTCTCa-3’；

RHG1-GTAT-R：5’-aacaGGTCTCa-3’。

其中，GGTCTC为Bsa1酶识别序列，和为Bsa1酶酶切后产生的粘性末端序列，斜体为Glyma.18G022700基因特异引物序列。

2、高保真PCR扩增

以大豆品种williams82的cDNA为模板，以步骤1中设计的引物按phusion酶(NEB,Cat.M0530)操作说明书高保真扩增Glyma.18G022700的CDS序列(序列4)，琼脂糖凝胶回收纯化PCR产物。

3、“两步法”酶切连接

采用两步法酶切连接DNA片段：

第一步：Restriction-Ligation

其反应体系如下：

在PCR仪中，进行如下程序：

第二步：Ligation

取出第一步中的反应体系，加入

ATP：0.5μl

T4酶：0.5μl

16℃，2小时至过夜连接。

其中，所使用的试剂为T4酶：(NEB，Cat:M0202S)；Bsa1：(NEB，Cat:R0535S)；ATP：(NEB，Cat:P0756S)。

4、入门克隆的测序鉴定

将步骤3中的酶切连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态，涂含有Ampicillin抗性的LB平板。挑选阳性克隆，用Seq-F和Seq-R引物测序，测序正确的克隆即为构建完成的入门克隆pAmpGate-RHG1。入门克隆pAmpGate-RHG1的结构描述为：将Glyma.18G022700基因CDS序列(序列4)替换入门载体pAmpGate中两个BsaI位点之间的小片段后得到的重组质粒。

5、目的克隆的构建

使用Invitrogen公司的LR酶(Invitrogen，Gateway LR Clonase 2Enzyme Mix，Cat:11791-020)，按操作说明书采用LR反应将Glyma.18G022700基因片段从入门克隆pAmpGate-RHG1重组至pEarleyGate101目的载体中，涂含有卡纳霉素(Kanamycin)抗性的LB平板。经测序验证获得阳性克隆，将其命名为pEarlyGate101-RHG1。pEarleyGate101-RHG1即为最终的目的克隆。pEarleyGate101-RHG1的结构描述为：将pEarleyGate101目的载体中位于attR1和attR2之间的片段通过LR反应替换为入门克隆pAmpGate-RHG1中位于attL1和attL2之间的片段后得到的重组质粒。

二、使用Bbs1进行多片段DNA的拼接克隆

拟设计基因组编辑CRISPR-Cas9的guide RNA表达单元，此guide RNA的靶位点为大豆抗胞囊线虫相关基因座RHG1中的Glyma.18G022700基因。即将U6启动子，guide RNA序列，T6终止子三个元件(U6:gRHG1:T6)按顺序拼接并克隆至Gateway目的载体pMDC99中。构建流程示意图如图4所示，具体操作为：

1、设计引物

采用在线CRISPR-Cas9的guide RNA spacer设计网站CRISPR-PLANT(http://www.genome.arizona.edu/crispr/index.html)设计以Glyma.18G022700为靶位点的guide RNA得到guide RNA spacer序列GGACTGCGGAACGAATCGGA。根据此spacer序列设计以RGH1为靶位点的guide RNA引物：

gRGH1-ATTG-F：

5’-gatGAAGACcg-3’；

gRGH1-TTTT-R：

5’-gatcaGAAGACcg-3’。

设计U6启动子和终止子引物：

U6-AACT-F：5’-gatGAAGACcg-3’；

U6-ATTG-R：5’-gatcaGAAGACcg-3’。

T6-TTTT-F：5’-gatGAAGACcg-3’；

T6-GTAT-R：5’-gatcaGAAGACcg-3’。

其中，双下划线为引入引物中的guide RNA spacer序列，斜体为基因特异引物，GAAGAC为Bbs1酶识别位点。为酶切位点产生了黏性末端，其中ATTG为U6自身碱基，TTTT为guid RNA自身碱基，因此此三个片段的拼接是一种片段之间不含“疤痕”序列的“无缝”拼接。

2、高保真PCR扩增

以pHSN6A01质粒为模板，以步骤1中设计的引物按phusion酶(NEB,Cat:M0530)操作说明书高保真分别扩增U6启动子，guide RNA编码序列和T6终止子序列，且分别琼脂糖凝胶回收纯化此三个序列。其中，U6启动子序列大小约为424bp(序列5中1-424bp)；guide RNA编码序列约为103bp(序列5中425-527bp)；T6终止子序列约为185bp(序列5中528-712bp)。

3、“两步法”酶切连接

采用两步法酶切拼接DNA片段：

第一步：Restriction-Ligation

其反应体系如下：

在PCR仪中进行的程序同步骤一3“第一步”中的程序。

第二步：Ligation

Ligation过程同步骤一3中的Ligation操作。其中所用的试剂Bbs1酶为：NEB，Cat:R0539S。其它试剂同步骤一3中所用的试剂。

4、入门克隆的测序鉴定

将步骤3中的酶切连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态，涂含有Gentamicin抗性的LB平板。挑选阳性克隆，用Seq-F和Seq-R引物测序，测序正确的克隆即为入门克隆pGentGate-U6:gRHG1:T6。入门克隆pGentGate-U6:gRHG1:T6的结构描述为：将U6:gRHG1:T6序列(序列5)替换入门载体pGentGate中两个BbsI位点之间的小片段后得到的重组质粒。

5、目的克隆的构建

使用Invitrogen公司的LR酶(Invitrogen，Gateway LR Clonase 2Enzyme Mix，Cat:11791-020)，按操作说明书采用LR反应将U6:gRHG1:T6拼接片段从入门克隆pGentGate-U6:gRHG1:T6重组至pMDC99目的载体中，涂含有Kanamycin抗性的LB平板。经测序验证获得阳性克隆，将其命名为pMDC99-U6:gRHG1:T6。pMDC99-U6:gRHG1:T6即为最终的目的克隆。pMDC99-U6:gRHG1:T6的结构描述为：将pMDC99目的载体中位于attR1和attR2之间的片段通过LR反应替换为入门克隆pGentGate-U6:gRHG1:T6中位于attL1和attL2之间的片段后得到的重组质粒。

该实施例的结果表明，本发明实施例1构建的入门载体既可以用来进行单片段DNA重组克隆，又可以进行多片段高效“无逢”拼接。