本发明涉及一种从青稞中分离纯化阿拉伯木聚糖的方法，具体涉及一种从青稞谷粒中提取和纯化阿拉伯木聚糖的方法。
背景技术：
：阿拉伯木聚糖(Arabinoxylans，AX)是一种非淀粉源的杂多糖，主要由木糖和阿拉伯糖构成，广泛存在于自然界特别是谷类作物中。根据其水溶性特点，阿拉伯木聚糖又分为水溶性和水不溶性两类。相比较而言，水溶性阿拉伯木聚糖结构相对简单，含量也比较低；水不溶性阿拉伯木聚糖结构相对复杂，分子内及分子间交联程度较高。体内和体外实验表明，阿拉伯木聚糖具有增加排便量、降血糖、降胆固醇、抗氧化、调节免疫甚至抗肿瘤等功效，其应用价值高、应用前景广泛。青稞生长在严寒缺氧的高原地带，是藏族人民每日饮食当中最主要的碳水化合物来源，具有突出的医疗保健功效，被认为是藏族人民长寿的重要因素之一。严寒、缺氧、干燥、强光照射等特殊环境使得青稞获得了极强的抗逆性，产生了十分丰富的次生代谢产物。青稞也因其营养组成全面且独特、食疗价值高而越来越受到民众青睐。有学者指出，青稞中的β-葡聚糖含量普遍高于世界其它地区种植的大麦品种。因此β-葡聚糖也被认为是青稞中与人体健康和长寿关系最为密切的营养物质。然而，近些年来谷类作物中阿拉伯木聚糖的生理功效也越来越多地见诸报道并被肯定。对阿拉伯木聚糖的研究主要聚焦在小麦、大麦、玉米等谷类作物，其提取方法也主要分为水法、碱法、酶法以及这些方法的联用。国内外对裸大麦(青稞即为裸大麦的一种)中阿拉伯木聚糖的研究相对较少。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种从青稞谷粒中提取和纯化阿拉伯木聚糖的方法。所述方法以青稞谷粒为原料，经过研磨、过筛、酶解、碱液溶解、透析、醇沉、真空冷冻干燥、脱脂得到粗制样品，其溶解后再依次经由填料celluloseDE-32和S-400洗脱得到纯化样品。所述方法能有效从青稞谷粒中分离得到高纯度的阿拉伯木聚糖，可用于其结构解析、理化性质鉴定及生物活性研究等。为实现上述目的，本发明采用以下方案：本发明涉及一种从青稞谷粒中提取和纯化阿拉伯木聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：S1、酶解：取青稞谷粒粉末样品加蒸馏水溶解，依次加入α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶进行酶解，酶解液离心；S2、碱提：酶解沉淀物加入碱液进行溶解，调节pH值至6.5～6.8，离心；S3、醇沉：碱提上清液中滴加2～3倍体积无水乙醇，静置过夜，离心；S4、真空冷冻干燥：醇沉沉淀物用蒸馏水复溶后浓缩、真空冷冻干燥，得固体粉末；S5、脱脂：以正己烷为溶剂，在60～90℃水浴条件下对固体粉末进行索氏提取，低温烘干得粗制样品；S6、DE-32洗脱：取粗制样品加蒸馏水溶解，离心；上清液经由DE-32洗脱；苯酚-硫酸法遴选有糖试管，合并滤液，60～90℃水浴蒸发浓缩得浓缩液；S7、S-400洗脱：浓缩液经由S-400洗脱；苯酚-硫酸法遴选有糖试管，依次测定各有糖试管中滤液的糖分组成及纯度，合并单一糖分相同且纯度>90％的滤液，并按单一糖分不同分开收集；60～90℃水浴蒸发浓缩，真空冷冻干燥得纯化样品粉末，根据纯化样品的液相色谱检测结果以及单糖分析实验获得阿拉伯木聚糖。优选的，所述青稞谷粒粉末样品的制备包括：分选无病变等正常青稞谷粒，研磨后过0.4～0.6mm筛网，即得所述粉末样品。优选的，步骤S1中，青稞谷粒粉末样品与蒸馏水的用量比为10g∶60～90mL。优选的，步骤S1中，依次加入α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶进行酶解具体为：加入50～100μL耐高温α-淀粉酶，80～100℃水浴1～2h；水浴温度调至60～80℃，加入10～20mg木瓜蛋白酶，水浴1～2h；100℃水浴灭酶10～20min，冷却后加入100～500μL糖化酶，60～80℃水浴1～2h；100℃水浴灭酶10～20min，冷却后60～90℃水浴2～4h。优选的，步骤S1中，所述离心条件为：3000～3500转、10～15min。优选的，步骤S2中，酶解沉淀物加60～90mL0.1～1.0mol/LNaOH溶液溶解，60～90℃水浴2～4h；浓HCl溶液调碱提液pH值至6.5～6.8，离心。优选的，步骤S2中，所述离心条件为：3000～3500转、10～15min。优选的，步骤S3中，所述碱提上清液为透析后的碱提上清液。优选的，所述透析包括：碱提上清液转移至透析袋(44mm透析袋，MW：3000)并将其置于清水中，每8～12h换水一次，共2～3次换水，碱提上清液与清水的比值为1∶500～1000。优选的，步骤S3中，所述离心条件为：3000～3500转、10～15min。优选的，步骤S4中，醇沉沉淀物用60～90mL蒸馏水复溶，60～90℃水浴蒸发浓缩至约5～10mL；-20℃冷冻后，真空冷冻干燥24～48h。优选的，步骤S5中，所述索氏提取为反复抽提6～8h；所述低温烘干的温度为30～50℃。优选的，步骤S6中，洗脱时，采用2～3mL/管收集60～100管。优选的，步骤S6中，DE-32洗脱时，流速为0.1～1.0mL/min，流动相依次为蒸馏水和0.5～1mol/L的NaCl溶液；蒸馏水洗脱的(60～100管)滤液弃去，NaCl溶液洗脱的(60～100管)滤液留存；层析柱的规格为：2.6cmx30cm。优选的，步骤S6中，合并滤液后，在蒸馏水中透析36～48h，每8～12h换水一次，透析液与蒸馏水的比值为1∶10～20；60～90℃水浴蒸发浓缩至约1～5mL。优选的，步骤S6中，粗制样品与蒸馏水的用量比为0.1g∶1～2mL。优选的，步骤S7中，洗脱时，采用2～3mL/管收集60～100管。优选的，步骤S7中，S-400洗脱时，流速为0.1～1.0mL/min，流动相为蒸馏水；层析柱的规格为：1.6cmx100cm。优选的，步骤S7中，采用配备了示差检测器的高效液相色谱仪依次测定各有糖试管中滤液的糖分组成及纯度。优选的，所述高效液相色谱仪检测时示差检测器型号为Waters2414，糖柱型号为SUGARKS-805示差检测器温度为30℃，柱温为30～60℃；流动相为蒸馏水，流速为0.5～1.0mL/min。优选的，步骤S7中，60～90℃水浴蒸发浓缩至约3～5mL；-20℃冷冻后，进行真空冷冻干燥24～48h。本发明的指导思想就是分离除去水溶性β-葡聚糖，再进一步分离纯化得到高纯度阿拉伯木聚糖用于后续研究。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、酶解阶段充分去除淀粉、蛋白质等大分子杂质，再分离除去水溶性β-葡聚糖而保留水不溶性非淀粉多糖成分，极大地提高了阿拉伯木聚糖的纯度和提取率；2、脱脂步骤置于酶解步骤之后，极大地提高脱脂效率并节约时间、减少物力消耗；3、采用离子交换纤维素DE-32去除色素等小分子物质、葡萄糖树脂S-400分离不同分子量的未知多糖组分，效率高、效果好；4、通过优化提取方法及其工艺，成功从青稞谷粒中分离纯化得到高纯度的阿拉伯木聚糖。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为分离纯化青稞谷粒中阿拉伯木聚糖组分的流程图；图2为测定未知多糖组分1中单糖组成的气相色谱图。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1本实施例涉及一种从青稞谷粒中提取和纯化阿拉伯木聚糖的方法，其流程图如图1所示，具体步骤如下：分选若干无病变等正常青稞谷粒，研磨、过0.4mm筛网；称取10g粉末状样品加90mL蒸馏水溶解，加入50μL耐高温α-淀粉酶，80℃水浴1h；水浴温度调至60℃，加入15mg木瓜蛋白酶，水浴1h；100℃水浴灭酶10min，冷却后加入400μL糖化酶，60℃水浴1h；100℃水浴灭酶10min，冷却后86℃水浴4h；酶解液3000转离心15min，上清液留存，沉淀物备用。酶解沉淀物加83mL0.5mol/LNaOH溶液溶解，86℃水浴4h；浓HCl溶液调碱提液pH值至6.5-6.8，3000转离心15min；沉淀物弃去，上清液转移至透析袋并将其置于清水中，每12h换水一次，共2次换水；透析后的上清液在磁力搅拌的条件下缓慢滴加3倍体积无水乙醇，静置过夜；3000转离心15min，醇沉液弃去，沉淀物用适量蒸馏水复溶，90℃水浴蒸发浓缩至约10mL；-20℃冷冻，真空冷冻干燥24h，将得到的固体粉末置于索氏提取装置中，用正己烷作溶剂，90℃水浴条件下反复抽提6-8h；40℃低温烘干即得粗制样品。取0.5g粗制样品加蒸馏水溶解，3000转离心15min；上清液经由DE-32洗脱，流动相分别为蒸馏水和1mol/L的NaCl溶液，在流速0.2mL/min条件下按3mL/管收集100管，其中蒸馏水洗脱的100管滤液弃去不用；苯酚-硫酸法遴选有糖试管，合并滤液；蒸馏水中透析36h，每12h换水一次；90℃水浴蒸发浓缩至约2mL。浓缩液再由S-400洗脱，流动相为蒸馏水，在流速0.2mL/min条件下按3mL/管收集100管；苯酚-硫酸法遴选有糖试管，高效液相色谱仪(配备示差检测器Waters2414，糖柱SUGARKS-805检测条件：检测器温度30℃、柱温35℃，流动相为蒸馏水，流速为1mL/min)依次测定各有糖试管中滤液的糖分组成及纯度，合并单一糖分相同且纯度>90％的滤液，并按单一糖分不同分开收集；90℃水浴蒸发浓缩至约5mL；-20℃冷冻，真空冷冻干燥24h即得纯化样品粉末。根据液相色谱检测结果可知此例分离纯化出两种未知多糖组分1和2，其纯度分别为96.08％和97.23％，粗制样品中的提取率分别为13.8％和14.1％；图2为测定未知多糖组分1中单糖组成的气相色谱图，由图2的气相色谱检测结果可知未知多糖组分1主要由阿拉伯糖和木糖组成，其中阿拉伯糖：木糖：葡萄糖的比例为28.9∶24.4∶1，为阿拉伯木聚糖。做单糖分析时，发现同样质量的未知多糖组分1和组分2，组分2中的阿拉伯糖和木糖的含量比组分1小很多(组分1约是组分2的25倍)。实施例2实施例2和实施例1的区别在于：DE-32和S-400的洗脱流速不同，即实施例2中DE-32和S-400的洗脱流速均为0.5mL/min。其它操作同实施例1。根据液相色谱检测结果可知此例也分离纯化出两种未知多糖组分1和2，其纯度分别为95.25％和95.38％，粗制样品中的提取率分别为2.7％和4.9％；根据气相色谱检测结果可知未知多糖组分1主要由阿拉伯糖和木糖组成，其中阿拉伯糖：木糖：葡萄糖的比例为22.4∶19.7∶1，为阿拉伯木聚糖。做单糖分析时，发现同样质量的未知多糖组分1和组分2，组分2中的阿拉伯糖和木糖的含量比组分1小很多(组分1约是组分2的25倍)。对比例1对比例1和实施例1的区别在于：DE-32和S-400的洗脱顺序不同，即对比例1中先用S-400洗脱再用DE-32洗脱。其它操作同实施例1。根据液相色谱结果可知此例不能分离纯化得到纯度高的单一未知多糖，粗制样品中混合多糖的提取率为8.9％，不再作单糖分析。对比例2对比例2和实施例1的区别在于：酶解最后阶段沉淀物和上清液的取舍不同，即对比例2中弃去沉淀物而保留上清液。此例除略去碱液溶解这一步骤外，其它操作同实施例1。根据液相色谱结果可知此例分离纯化出一种未知多糖，其纯度为98.86％，粗制样品中的提取率为31.1％；根据气相色谱检测结果可知未知多糖主要由葡萄糖组成，其中葡萄糖∶阿拉伯糖∶木糖＝39.8∶1∶1.4，应主要为β-葡聚糖(其中阿拉伯木聚糖组分约占多糖总量的6％)。表1为阿拉伯木聚糖(AX)纯度、提取率及混合多糖提取率对比表实施例1实施例2对比例1对比例2未知多糖提取率27.9％7.6％8.9％31.1％AX提取率13.8％2.7％00AX纯度96.08％95.25％----以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3