本发明涉及一种药物的合成方法，具体来说是一种酶法合成头孢地尼的工艺。
背景技术：
头孢地尼是第三代口服头孢菌素，具有抗菌谱广、抗菌作用强、临床疗效高、毒性低、过敏反应少、方便使用等特点。对G+、G -菌和厌氧菌均有较强的抗菌活性，对β-内酰胺酶具有高度稳定性。
合成头孢地尼主要采用化学溶媒法，过程中需要消耗大量有机溶剂，工艺复杂，危险性高，环境污染较严重。酶法相比化学法在环保和成本上具有明显的优势。酶法制备头孢地尼的工艺相对流程短，工艺简单，杂质的带入及产生较少，合成过程中无溶媒及有毒的试剂。
在酶法生产头孢地尼的过程中，固定化头孢地尼合成酶的选择是酶法工艺的关键。固定化头孢地尼合成酶对产品的收率、杂质的含量、产品的质量等起着关键的作用。另外，固定化酶的稳定性决定其使用寿命和生产成本。
因此如何确定固定化头孢地尼合成酶中固定化原料比例显得尤为关键。
技术实现要素：
现有头孢地尼合成工艺中，普遍采用化学法进行生产，存在着工艺步骤繁琐、反应时间长，转化率低、大量使用有机溶剂等问题，本发明提供了一种固定化头孢地尼合成酶，及合成头孢地尼的新工艺。
本发明的内容是通过以下方案通过的：
一种酶法合成头孢地尼的工艺，具体步骤如下：
（1）在反应器中加入固定化头孢地尼合成酶和一定量去离子水，再加入7-氨基-3-乙烯基-3-头孢环-4-羧酸（7-AVCA）、头孢地尼侧链酸活性酯（2-（2-氨基噻唑-4-基）-2-三苯甲氧基氨基乙酸硫代苯并噻唑酯），搅拌混合，得混合液A；混合液A的pH值为6-8，控制混合液温度为5-25℃，反应60-180min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；
所述的7-AVCA与头孢地尼侧链酸活性酯的摩尔比为1/1.03-1.20，7-AVCA在去离子水中浓度为300-500mmol/L，固定化头孢地尼合成酶在去离子水中的浓度为5-30 u/mL；
优选反应时间为120-160min，反应时间过短，转化率低，反应不完全；但反应时间过长，头孢地尼开始水解，杂质升高。这个反应时间是固定化头孢地尼合成酶催化时根据7-AVCA最佳转化率考察出来的最佳反应时间。
（2）取步骤（1）所得的反应液B，通过筛网，分离出最终反应液C和固定化酶；
所述的筛网为80-120目，优选90-110目；筛网目数过大，固定化头孢地尼合成酶就容易从筛网泄露；目数过小，头孢地尼粗品从筛网放料就较困难；
（3）将步骤（2）所述的反应液C用氨水溶液调节pH为7..8-8.0溶清，过滤，再用盐酸溶液调节至pH为2.5-2.8，进行结晶，降温至5℃以下养晶1-2h，洗涤，干燥，即得产品头孢地尼。
所述的氨水溶液浓度优选6mol/L；氨水溶液浓度低，会对头孢地尼产品收率造成影响，浓度高，会影响产头孢地尼产品质量；盐酸溶液优选6mol/L，浓度过高或过低会对晶型和收率造成影响。
步骤（1）中所述的7-AVCA残留浓度为小于1mg/mL。
所述产品的头孢地尼纯度99.5%以上，反应摩尔收率86%以上。
本发明所述的固定化头孢地尼合成酶来源于假单胞菌的酰化酶固定化于氨基环氧型载体上，酰化酶固定化过程为现有技术；氨基环氧型载体与酰化酶发酵酶液的质量体积比为1:1-3（g：mL）；酰化酶发酵酶液中酰化酶酶活含量为500-1000U/ml；
本发明中所述的氨基环氧型载体是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂中的一种或两种组合。
本发明将固定化酶投入水相中，每次反应后仅需母液和去离子水清洗即可再用。整个合成过程，工艺简单，操作方便，反应时间短、能耗低、污染少。所得产品质量好，收率高。因此，本发明是一种高效率的绿色生产工艺。
本发明的有益效果：
（1）本发明取代了使用大量使用有机溶剂的化学法生产工艺，绿色环保，污染小。
（2）本发明所使用的固定化头孢地尼合成酶可以回收重复使用，降低了成本。此外固定化头孢地尼合成酶性能稳定，反应后易于分离。此外，还便于运输、储存及自动化操作。
（3）本发明中首次采用固定化头孢地尼合成酶进行制备头孢地尼，并确定了酰化酶与氨基环氧型载体固定化的最佳比例，使得该反应过程完全，反应时间更短，提高了反应收率，头孢地尼产品质量更好，纯度更高，收率更高。
综上所述，本发明具有操作简单，能耗小，污染少，收率高，产品纯度高的优点，更易于工业化生产。
具体实施方式
本发明通过比较例和实施例来阐明本发明，但不以任何形式限制本发明。
各实施例中，所使用的固定化头孢地尼合成酶来源于假单胞菌的酰化酶固定化于氨基环氧型载体上，酰化酶固定化过程为现有技术；氨基环氧型载体与酰化酶发酵酶液的质量体积比为1:1-3（g：mL）；酰化酶发酵酶液中酰化酶酶活含量为500-1000U/ml；
实施例一
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水，0.04mol的7-AVCA和0.046mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为8-10℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例二
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水，0.04mol的7-AVCA和0.046mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例三
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.046mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至6.8，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例四
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.046mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.2，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例五
在反应器中加入500u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.046mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为190min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例六
在反应器中加入2000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.046mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为120min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例七
在反应器中加入3000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.046mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为110min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例八
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.042mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例九
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.044mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例十
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.04mol的7-AVCA和0.048mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例十一
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.03mol的7-AVCA和0.0345mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为120min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例十二
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.05mol的7-AVCA和0.0575mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为160min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过90目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例十三
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.05mol的7-AVCA和0.0575mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过80目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例十三
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.05mol的7-AVCA和0.0575mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过100目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
实施例十四
在反应器中加入1000u的固定化头孢地尼合成酶，100mL的去离子水， 0.05mol的7-AVCA和0.0575mol的头孢地尼侧链酸活性酯，搅拌混合，得混合液A；然后向反应器中加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节A混合液pH值至7.0，保持反应温度为6-8℃，反应时间为140min，采用HPLC进行跟踪检测，直至7-AVCA在反应液中的残留浓度小于1mg/mL，结束反应，得反应液B；将上述反应液B通过110目筛网将反应液与固定化酶分离，得反应液C；C反应液用6mol/L氨水调pH至7.8-8.0溶解，过滤，再用6mol/L盐酸溶液结晶调pH值，终点pH=2.5-2.8；在0-5℃养晶1h后，洗涤，干燥，得头孢地尼成品；固定化酶用母液和去离子水清洗，可再利用。
对实施例一~十四所得的头孢地尼产品进行性能测试
纯度、单杂、总杂主要用HPLC检测。
检测结果如下表所示：
从以上结果可知：本发明工艺简单，操作方便，反应时间短、能耗低、污染少。所得产品质量好，收率高。因此，本发明是一种高效率的绿色生产工艺。