一种纯化牛胎儿骨骼肌组织来源前体脂肪细胞的方法与流程

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本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种纯化牛胎儿骨骼肌组织来源前体脂肪细胞的方法。

背景技术：

干细胞是可以维持复制和并能分化为不同类型细胞能力的一类细胞，干细胞研究对于理解细胞以及组织的发生和分化调控是非常重要的。另外，干细胞研究对于医学领域同样具有巨大的潜力。像很多其他的器官，骨骼肌包含很多细胞类型，能产生肌源性的卫星细胞和脂肪组织源性的脂肪细胞，这些对畜牧业生产都是很重要的。众所周知，卫星细胞对于出生后骨骼肌的生长和成年人的骨骼肌的再生都很重要。过去近50年的对分离的卫星细胞的研究主要集中在其增殖的激活和抑制，调控他们在体外的活性，与其它细胞如血管生成细胞间的互作，亚群间的潜力，以及在基因治疗上作为载体的潜力。在肉牛生产中，动物的骨骼肌的生长发育和肌内脂肪的沉积是影响牛肉产量和价格的最主要因素。然而，目前为止对于早期肌肉发育和肌内脂肪发育的研究相对较少，尤其是不同细胞的干细胞发育来源，因此鉴定出用于区分不同来源的干细胞表面分子标记特征，并建立体外诱导分化模型体系对于研究家养动物肌肉和肌内脂肪分化具有重要意义。

胚胎干细胞到成肌的、成脂的、成纤维的定向的分子机制仍有很大程度的不明确。然而，质量被证实的胚胎干细胞已经从数量有限的哺乳动物物种中分离出来。而且，1981年胚胎干细胞在从来自非人类的实验小家鼠中分离出来。小鼠多潜能干细胞已经被彻底的建立，将其注入到囊胚内后将胚胎移植到雌性小鼠体内正常生长直至出生。此外，小鼠胚胎干细胞的基因组可以通过转基因和同源重组技术修饰后。基因工程细胞能经生殖系传递到后代。多潜能的人类胚胎干细胞系也已被成功建立，同样具备分化为不同种类细胞的能力。尽管对农业物种胚胎干细胞上投入了大量的努力，但是与鼠和人类的的努力相比尚不是很成功。这项工作的困难性可能有以下几点，一是农业物种和小鼠相比在胚胎植入前的发育存在物种的特异性，第二是对于农业动物胚胎发育所需要的生长因子尚不完全明了，三是在小鼠中有效的干细胞标记是否适用于农业动物尚不知道。然而，快速扩展的干细胞领域的知识，农业物种方面胚胎干细胞的研究也将取得进展。事实上，农业物种的胚胎干细胞发展研究中具有一个独特的机会，因为它们可以用来开展生殖系的试验，通过注入到胚胎内转移到代孕的母体内，然而此项试验在人类胚胎干细胞中是被禁止的。除此之外，小鼠胚胎干细胞应该是可以的(从遗传学角度看有这个能力去被操作)，作为卫星细胞发展和功能研究的平台。在将来，如果来自农业动物的胚胎干细胞种系得到发展了，小鼠干细胞研究可能就会转移到农业物种骨骼肌发育的动力学应用研究中。

在哺乳动物中，大部分骨骼肌结构是在胎儿期生长发育期完成的。主要肌纤维开始形成是在胚胎期，次级肌纤维生成是在人妊娠中期和后期，鼠的晚期和新生儿期。肌细胞生成受一系列转录因子控制，包括Pax3、Pax7，Gli和四个肌源性调节因子包括MyoD,Myf-5,肌细胞生成素和MRF-4。次级肌纤维在脂肪细胞形成，纤维生成重叠部分的形成是在人，猪，牛，羊，马，鸡的妊娠中期和啮齿动物妊娠后期。肌源性的，脂肪性的和纤维性干细胞是由胚胎干细胞分化产生。骨骼肌干细胞由肌源性转换成脂肪性可能会增加肌内脂肪沉积。一个纤维/脂肪祖母细胞可能存在骨骼肌中，对肌内脂肪堆积就像纤维那样在疾病方面有影响。

肌肉细胞和脂肪细胞从间充质细胞中产生，间充质细胞存在于早起发育阶段，尤其在胎儿期和新生儿阶段的骨骼肌中。当大部分的间充质干细胞分化变成肌细胞时候，其中一小部分区别变成脂肪细胞——肌内脂肪堆积的基础。在细胞命运中关键因子是Wnt家族蛋白，这些蛋白是旁分泌生长调节剂，在细胞发展中可能存在不同的功能：Wnt信号可能引起细胞增殖，凋亡，决定细胞命运，变异，或者前体细胞维护。经典的Wnt通路是β-连环蛋依赖性的：结合的卷曲蛋白激活成凌乱的家族蛋白，家族蛋白激活了糖原合成酶激酶3，阻止了磷酸化的β-连环蛋白随后降解，导致β-连环蛋白的积累。没有Wnt刺激，轴蛋白/糖原合成酶激酶3/复合阿司匹林复合物能通过GSK-3β的磷酸化作用提高β-连环蛋白的抗原降解。稳定的β-连环蛋白进入细胞核后与转录因子上的T细胞因子/淋巴增强因子作用去激活特定的靶基因。在来自于骨髓的间充质干细胞中，Wnt的信号通路的激活作用加强了肌细胞生成，抑制了脂肪生成。抑制β-连环蛋白通路会减少肌细胞的总体数量。在前体脂肪细胞中Wnt信号被高度表达，通过阻断C/EBP和PPARγ来抑制脂肪的生成。稳定的β-连环蛋白与成肌细胞的脂肪分化抑制和随年龄增长的肌卫星细胞的脂肪生成能力有关。

骨骼肌干细胞存在于所有骨骼肌中，由于位置或功能不同,可能控制不同的增生型/分化能力。出生后的骨骼肌受环境和生理信号的影响极其敏感，能够根据所需修改成长和功能特性，例如，运动，受伤或者损伤启动了骨骼肌的重新生成和修复，尽管骨骼肌由大量经过有丝分裂的多核肌纤维组成。骨骼肌的可塑性很大一大部分是来自骨骼肌中存在的干细胞群，通常是卫星细胞。大部分体外研究用的是啮齿类动物的后背和后肢的肌肉来分离肌源性的卫星细胞。最近的一项关于反刍和非反刍肉用动物的分离研究表明，卫星细胞已经描述了特定的骨骼肌分离，但还是有不足之处需要去确定，是否控制来自不同肌肉的卫星细胞去分离。然而，大量的报道显示脂肪细胞行为差异取决于被分离细胞所在的位置，这表明位置可能会影响不同组织细胞的活动。例如，不同的脂肪组织位点具有独特的生长，发育和调节特征，动物依赖性的酶活。最近类似研究是使用的纯化培养的脂肪干细胞同时在细胞和分子两个水平进行的研究。

当需要的时候，卫星细胞通过启动成体终末分化程序来实现融合的功能。有趣的是，我们不断发现新的生长因子影响卫星细胞的增殖，这表明有可能有额外的机理待被发现。在肌纤维过度肥大或者修补时，卫星细胞能够将核贡献出来与现存的肌纤维融合。当肌纤维对于损伤无动于衷的时候，卫星细胞彼此进行融合形成新的肌管最终取替肌纤维。当然，骨骼肌是一个动态组织由大量要素组成，包括血管，神经和结缔组织。在骨骼肌生长和再生期间，这些要素需要生长和修补，为了生长出一个彻底的功能单位肌纤维间需要相互协调。这是由以前的研究支持的，为了去恢复适当的肌肉功能需要涉及到肌细胞生成，血管生成和神经形成之间的合作。肌细胞和其他细胞之间合作似乎是可能的。最近，研究人员已经提出证据来支持这个想法。为描述他们之间的相互作用，研究人员开发出了在体外共同培养的由微血管片段和卫星细胞组成的模型。此体系中，悬浮在胶原蛋白凝胶上的分离的MVF在鼠SC单层培养基础上进行培养。在SC的存在下，与MVF独自培养相比MVF展示出了更高的血管新生指数。最近通过Christov以及其他人的数据显示卫星和内皮细胞在肌肉中是紧密并列的，建议直接接触可能是重要的意味着细胞间的交流。总之，这些初步的结果表明一个以前没有被发现的卫星细胞作用是启动生成血管之前程序。

然而很多的报告记录了出生后的肌源性卫星细胞外在的和固有的调控，可塑性骨骼肌通过生产能力和对各种各样细胞因子的响应来进行例证。根据炎症和细胞因子谱，骨骼肌将在分解代谢和合成代谢中做出响应。例如，骨骼肌在感染与生存相关的支撑物过程阶段中就会分解。相反，炎症加上锻炼最终会导致肌肉肥大。迄今为止，研究了在卫星细胞活动上的多种类细胞因子的效果提供了混合的结果，可能与细胞类型，剂量和时间有关。

在细胞水平有两个生理组分存在。一个是脂类代谢，指进入或者离开脂肪细胞(脂肪生成和脂肪分解)的能量流，它不需要干细胞活动。第二个是生理学组分，称为脂肪形成，是可以识别的细胞转变，其由纺锤形的干细胞收缩，首先形成一个缺乏脂类的前体脂肪细胞，然后形成了一个多个脂滴的脂肪细胞，最后形成成熟的脂肪细胞。鉴于很多每年发表的关于脂类代谢和脂肪生成的文章，基本不能获得一个有效的通过外源性处理降低体内油脂或者降低脂肪细胞分化的方法。的确，在脂肪细胞形成领域发表的大部分发表的文章认为，一旦前体脂肪细胞开始油脂累积，细胞将继续向前进行终端分化成为一个参与脂类代谢的脂肪细胞。在大多动物脂肪中，具备油脂合成和储存能力的脂肪细胞数量在出生时都没有明确的展现。并且，出生后脂肪细胞生长是增生和肥大双重效果，每种变化的效果因脂肪位置而不同。有趣的是，根据传统思维应该是更多的脂肪细胞需要在特定部位沉积，并且成纤维细胞在结缔组织部分转变成脂肪细胞。

体外研究显示激活的过氧化物酶增生物受体(PPARγ)和CCAAT-增强子-结合蛋白(C/EBPs)都是控制脂肪细胞生成的决定性因子。他们的表达诱导了来自胚胎干细胞脂肪生成。已经发布的与农业动物相关的大量证据支持了这个观点，但与人类和啮齿动物稍有不同的调节机制。脂肪生成起始于胎儿期，反刍动物妊娠中期，猪和啮齿动物后期。脂肪形成起始时的差异主要是由于不同物种新生动物在成熟度方面的差异。脂肪形成是通过几个关键转录因子控制，包括PPARγ和C/EBPs。C/EBPβ和-δ首先通过脂肪形成刺激物进行诱导，接下来是通过在PPARγ和C/EBPα在表达方面的增加。C/EBPα和PPARγ彼此强迫去打开脂肪形成特定程序去促进脂肪形成。PPARγ值脂肪形成的主调节因子。PPARγ在维甲类x受体α(RXRα)和结合在一起的过氧化物酶体增生物反应原件的合作上形成了异质二聚体在靶基因激活上。因此，维甲酸会通过RXRα和RXRα和PPARγ的相互作用来影响脂肪形成。PPARγ是转录因子的一个激活配体。在不活跃状态，PPARγ与协阻抑物联系去压制它的转录活动。结合配体导致协阻抑物代替助激活剂去支配组蛋白乙酰转移酶活动例如cAMP效应元件结合蛋白((CBP/p300))。组蛋白的乙酰化作用导致此处染色质分裂和基因进行表达。脂肪酸是PPARγ的受体，与正常的脂肪酸相比，被氧化的脂肪酸似乎有更高的能力去激活PPARγ。

总之，骨骼肌组织发育是农业动物生产能力的核心因素。提高骨骼肌产量和肌内脂肪含量又是肉牛业生产中的重要研究内容。虽然已经开展了大量关于农业家养动物干细胞的研究，但目前世界科研人员还在为建立理想的体外模型而开展大量工作。为了能够分离和纯化骨骼肌来源的成肌/成脂干细胞的，进而用来在体外建立诱导分化的模型一直是农业动物科研人员长期开展也是迫在眉睫的工作之一。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种纯化骨骼肌来源脂肪前体细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是通过细胞表面标记分子血小板源性生长因子受体α对骨骼肌来源多潜能干细胞进行分选。

一种纯化牛胎儿骨骼肌组织来源前体脂肪细胞的方法，所述方法使用的材料为，牛3月龄胎儿背最长肌组织，所用试剂为，胶原酶、胎牛血清、低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、细胞分选缓冲液、抗血小板源性生长因子受体α抗体、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、牛胰岛素和油红O。

所述方法包括以下步骤：

步骤一、细胞的分离培养；

步骤二、细胞培养；

步骤三、细胞的成脂诱导；

步骤四、油红O；

步骤五、油红O染色试验结果。

所述步骤一具体包括以下步骤：

步骤(1)将牛胎儿用75％的酒精和含有双抗的磷酸盐缓冲液冲洗几遍；

步骤(2)然后放置于无菌环境中小心剪破羊膜，取出胎儿，用眼科剪剪开背部皮肤，用眼科剪刀、镊子分离出背部肌肉；

步骤(3)用镊子取出2块绿豆粒大小的肌肉组织放入到培养皿中，培养皿里预先加入含有双抗的磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液洗清洗3次除去血细胞；

步骤(4)然后转移到EP管中，加入1mL 0.1％Ⅳ型胶原酶，用眼科剪剪碎至肉糜状；

步骤(5)将剪碎的组织放入37℃气体恒温摇床中消化45min，期间每15min吹打组织一次；

步骤(6)45min后用40μm的细胞过滤网将细胞浆过滤，400rpm离心5min，弃去上清液，加入细胞分选缓冲液悬浮细胞；

步骤(7)加入2μL抗血小板源性生长因子受体α抗体后孵育15min,，300rcf离心10min；

步骤(8)加入1mL细胞分选缓冲液后300rcf离心10min，弃上清，重复一次；

步骤(9)吸去上清后加入80μL细胞分选缓冲液，再加入20μL抗兔源免疫球蛋白微珠，混匀后4℃中孵育15min；

步骤(10)加入1mL细胞分选缓冲液后300rcf离心10min，弃上清，重复一次；

步骤(11)加入500μL细胞分选缓冲液悬浮细胞；

步骤(12)将MS分选柱至于磁力架上，将悬浮液加入到准备好的MS分选柱上，收集流下的阴性细胞，冲洗分选柱3次，每次用500μL细胞分选缓冲液，收集流下的液体与第一步合并；

步骤(13)将MS分选柱从磁力架上取下置于新的收集管中，加入1mL细胞分选缓冲液后，用活塞快速推入到分选柱中，收集流出的液体即为阳性细胞。

所述步骤二具体包括以下步骤：

当原代细胞生长聚集至70～80％的时候，吸去旧培养基，并用磷酸盐缓冲液清洗2次，将0.25％胰蛋白酶加入后，放入培养箱中约30s，在倒置相差显微镜下观察细胞呈圆形时，用手轻柔敲打培养皿，直到圆形的细胞漂浮后，即刻加入培养基来终止消化反应继续进行，轻柔的吹打细胞，以1:3比例进行传代培养，将细胞放入温度为37℃、CO₂含量为5％的恒温培养箱中培养。

所述步骤三具体包括以下步骤：当细胞生长汇聚到100％时，弃掉培养基，用磷酸盐缓冲液清洗2次，加入成脂细胞诱导液，生长培养基加0.5μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、1μM地塞米松，开始进行诱导，每3d换一次液。

所述步骤四具体包括以下步骤：

步骤(a)弃掉旧培养基，将4％多聚甲醛加到孔板中，室温固定细胞20min；

步骤(b)用磷酸盐缓冲液清洗3遍；

步骤(c)加入油红O常温下染色10min；

步骤(d)弃掉油红O染色液，用磷酸盐缓冲液清洗3遍；

步骤(e)置于倒置显微镜下观察细胞中脂滴的染色情况并拍照。

所述步骤五具体包括以下步骤：

在细胞诱导第10d时，对血小板源性生长因子受体α阳性细胞和血小板源性生长因子受体α阴性细胞进行油红O染色，结果表明，前者比后者脂滴更多、更大。

有益效果

通过分子表面标记血小板源性生长因子受体α筛选纯化后的阳性组的脂肪前体细胞，在诱导分化后形成了具有大量脂滴的脂肪细胞，而阴性组细胞所形成的脂滴量很少。因此，此方法对于促进脂肪前体细胞纯化具有优异的效果。

附图说明

图1-2分选后细胞成脂细胞诱导分化的油红O染色结果；

其中，图1是血小板源性生长因子受体α阴性细胞成脂分化后油红O染色结果；

图2是血小板源性生长因子受体α阳性细胞成脂分化后油红O染色结果；

具体实施方式

实施例1