船舶压载水中10‑50um生物快速检测方法及装置与流程

本发明涉及船舶携带的压载水中生物活体的检测方法及装置，详细讲是一种检测精度高、数据真实可靠的船舶压载水中10-50um生物快速检测方法及装置。

背景技术：

我们知道，远洋运输船舶为了保证船舶稳定性，一般在始发港口加装压载水，待停靠在目的港口时再排放压载水，其所携带的生物会给目的港口国带来生物入侵风险。为了应对此问题，国际海事组织（IMO）、美国海岸警卫队（USCG）和美国环境保护署（EPA）均制定了相应的生物入侵应对措施和压载水排放控制公约，要求多数商业运输船舶必须加装压载水处理设备（BWTS）以处理压载水。IMO G8导则和USCG参考的ETV草案明确规定了排放压载水中生物的尺寸及存活生物浓度，如下所示：

最小尺寸大于或等于 50µm 的存活生物少于 10 个/m³；

最小尺寸小于 50µm 但大于或等于 10µm 的存活生物少于10个/ml；

且作为人体健康标准，指标微生物小于下述浓度：

有毒霍乱弧菌 (血清型 O1 和 O139)少于1 cfu/100ml；

大肠杆菌：少于250 cfu/100ml；

肠道球菌：少于100 cfu/100ml。

目前，IMO国际压载水公约还未生效，但生效日期也已临近。USCG已经单方面宣布其规范生效，强制规定凡进入美国水域的商业运输船舶必须安装符合USCG规范和排放标准的BWTS，否则无法靠港进行相关作业。因各个水域的水质和生物分布情况有所差异，船舶所安装的BWTS不能保证每次排放的压载水都能满足排放标准，必须在靠近港口国排放前自行检测目标生物含量，因此，船上检测人员必须具有丰富的生物基础知识和检测经验，同时配备先进的生物检测仪器。对于绝大多数船舶设施和船员知识水平来说，很难满足此要求。

一般来说，10-50um生物主要为单细胞藻类，因其物种特殊性，既不能通过过滤方法完全去除，也不能通过紫外照射或化学方法完全灭杀，且种类繁多，已成为压载水中生物检测的难点。现有的快速检测装置是根据藻类叶绿素的含量预估藻细胞数量，经实验表明，部分已死亡藻细胞内的叶绿素仍然能保持完整，依据叶绿素含量判定细胞存活状态的方法误差大、可靠性低，甚至出现误判。另一方面，现有的的检测设备会将一些10um以下的藻细胞也计入，检测数据不精准。

技术实现要素：

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种结构简单、使用方便，检测速度快、精度高，数据真实可靠的船舶压载水中10-50um生物快速检测方法及装置。

本发明解决上述现有技术的不足所采用的技术方案是：

一种船舶压载水中10-50um生物快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)使用大孔径过滤器将经压载水处理设备处理后的（待排放的）压载水样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；

（2）取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；

（3）使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；

（4）向样品槽内加入活细胞荧光染色剂，染色5-30（10）分钟；

（5）染色后，向样品槽内加入其内液体体积0.5-2倍的细胞裂解液；

（6）待细胞（膜）充分裂（溶）解后，使用荧光计检测样品槽内液体的相对荧光强度；

相对荧光强参考值的获取方法如下：

a、选用已知符合压载水处理D-2标准中对10-50um存活生物的规定、含10-50um存活生物个数达到上限的水样作为参考检测样品，使用大孔径过滤器将参考检测样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；

b、取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；

c、使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；

d、向样品槽内加入活细胞荧光染色剂，染色5-30（10）分钟；

e、染色后，向样品槽内加入其内液体体积0.5-2倍的细胞裂解液；

f、待细胞充分裂解后，使用荧光计检测样品槽内液体的相对荧光强度；

g、按步骤a中参考检测样品的选取标准选取1-100种不同的参考检测样品，每种参考检测样品按步骤a、b、c、d、e、f的操作方法检测至少一次，根据所得数据求出平均相对荧光强度值，该平均相对荧光强度值为相对荧光强度参考值；

将第（6）步获得的相对荧光强度值与第g步获得的相对荧光强度参考值对比，判断该压载水样品是否符合排放标准。

本发明中第a步中所述的参考检测样品经如下方法获得：使用大孔径过滤器将经压载水处理设备处理后的（待排放的）压载水样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；将样品槽内的液体经FDA-CMFDA法在荧光显微镜下检测，其中10-50um存活生物的含量符合要求时，即可成为参考检测样品。

本发明中第a步中所述的参考检测样品也可经如下方法获得：人工配制藻类溶液或自然海水经紫外线（UV）处理或经次氯酸钠（NaClO）处理，得测试液；使用大孔径过滤器将测试液中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；将样品槽内的液体经FDA-CMFDA法在荧光显微镜下检测，其中10-50um存活生物的含量符合要求时，即可成为参考检测样品。

本发明中所述的大孔径过滤器为使用网孔对角线长度为35-50um的尼龙筛绢制成的过滤器；所述的小孔径过滤器为使用绝对孔径为10um 的微孔滤膜制成的、可以反冲洗的过滤器；

本发明中所述活细胞荧光染色剂为FDA或/和CMFDA，其加入量根据样品槽内液体体积、以1-3mg/ml（2mg/ml）的比例加入。染色反应时间为5-30（10）分钟。FDA为荧光素二乙酸酯。

本发明中所述的清洗液是BES、MOPS、PBS（pH=7.0）、Tris-HCl(0.2-1.0M，pH=6.0-7.2)中的至少一种。可以有效防止FDA或CMFDA的非生物水解。

本发明中所述细胞裂解液为甲醇与氯仿（体积比1:1-1:3）的混合液或丙酮中的一种。

一种船舶压载水中10-50um生物快速检测装置，其特征在于包括样品箱、冲洗液箱、裂解液箱、废水箱、检测箱、一级过滤器和二级滤器，一级过滤器的出口与样品箱进口相连，检测箱上设有染色剂加入口，样品箱、冲洗液箱和染色剂箱的出口上分别设有样品泵、冲洗泵和裂解泵，样品泵的出口经过滤阀与二级过滤器的一端口相连，二级过滤器的另一端口经冲洗阀与冲洗泵出口相连，二级过滤器与冲洗阀间的连接管经排液阀与废水箱相连，检测箱的进液口经进液阀与过滤阀和二级过滤器间的连接管路相连，裂解泵出口与检测箱相连，检测箱上设有荧光计。

本发明中所述的一级过滤器为网孔对角线长度为35-50um的尼龙筛绢；二级滤器为绝对孔径为10um 的微孔滤膜；荧光计的发射光波长为460-490nm，接收的激发光波长为510-550nm。所述的检测箱下部经排放阀与废水箱相连。

本发明中所述的10-50um生物是指：尺寸小于50um但大于或等于10um的存活生物。

使用本发明的装置及方法来检测待排放的船舶压载水中10-50um生物时，首先按照相对荧光强参考值的获取方法来测试出使用特定的某种清洗液、活细胞荧光染色剂、细胞裂解液组合时的相对荧光强度参考值；在船舶需要检测时，使用该特定的清洗液、活细胞荧光染色剂、细胞裂解液的组合按照步骤1-6检测出相对荧光强度，当相对荧光强度不大于相对荧光强度参考值时，说明待排放的船舶压载水符合排放标准，反之说明待排放的船舶压载水不符合排放标准，使用相同的各种试剂的情况下，相对荧光强度参考值仅需检验一次，即可在多次、甚至无数次检验中成为参考值，有此参考值得情况下，本发明结构简单、使用方便，检测速度快、精度高，数据真实可靠。

附图说明

图1是本发明中速检测装置的结构示意图。

图2是本发明中相对荧光强度与四爿藻活细胞含量之间的对应关系图。

具体实施方式

一种船舶压载水中10-50um生物快速检测方法，包括如下步骤：

(1)使用大孔径过滤器将经压载水处理设备处理后的待排放的压载水样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；

（2）取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；

（3）使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；

（4）向样品槽内加入活细胞荧光染色剂，染色5-30分钟；

（5）染色后，向样品槽内加入其内液体体积0.5-2倍的细胞裂解液；

（6）待细胞充分裂解后，使用荧光计检测样品槽内液体的相对荧光强度；

相对荧光强参考值的获取方法如下：

a、选用已知符合压载水处理D-2标准中对10-50um存活生物的规定、含10-50um存活生物个数达到上限的水样作为参考检测样品；使用大孔径过滤器将参考检测样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；

b、取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体流出；

c、使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；

d、向样品槽内加入活细胞荧光染色剂，染色5-30（10）分钟；

e、染色后，向样品槽内加入其内液体体积0.5-2倍的细胞裂解液；

f、待细胞（膜）充分裂（溶）解后，使用荧光计检测样品槽内液体的相对荧光强度；

g、按步骤a中参考检测样品的选取标准选取1-100种不同的参考检测样品，每种参考检测样品按步骤a、b、c、d、e、f的操作方法检测至少一次，根据所得数据求出平均相对荧光强度值，该平均相对荧光强度值为相对荧光强度参考值；

将第（6）步获得的相对荧光强度值与第g步获得的相对荧光强度参考值对比，判断该压载水样品是否符合排放标准。

其中A为任何数值，优选100-500的自然数。

本发明中第a步中所述的参考检测样品经如下方法获得：使用大孔径过滤器将经压载水处理设备处理后的待排放的压载水样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；将样品槽内的液体经FDA-CMFDA法在荧光显微镜下检测，其中10-50um存活生物的含量符合要求时，该经压载水处理设备处理后的待排放的压载水样品即可成为参考检测样品。

本发明中第a步中所述的参考检测样品也可经如下方法获得：人工配制藻类溶液或自然海水经紫外线（UV）处理或经次氯酸钠（NaClO）处理，得测试液；使用大孔径过滤器将测试液中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；将样品槽内的液体经FDA-CMFDA法在荧光显微镜下检测，其中10-50um存活生物的含量符合要求时，该经压载水处理设备处理后的待排放的压载水样品即可成为参考检测样品。

更进一步的，所述的大孔径过滤器为使用网孔对角线长度为35-50um的尼龙筛绢制成的过滤器；所述的小孔径过滤器为使用绝对孔径为10um 的微孔滤膜制成的、可反冲洗的过滤器。所述活细胞荧光染色剂为FDA或/和CMFDA，其加入量根据样品槽内液体体积、以1-3mg/ml（2mg/ml）的比例加入。染色反应时间为5-30（10）分钟。FDA为荧光素二乙酸酯；所述的清洗液是BES、MOPS、PBS（pH=7.0）、Tris-HCl(0.2-1.0M，pH=6.0-7.2)中的至少一种，可有效防止FDA或CMFDA的非生物水解。其中PBS为：硫化铅、Tris-HCl为：三（羟甲基）氨基甲烷。所述的细胞裂解液为甲醇与氯仿（体积比1:1-1:3）的混合液或丙酮中的一种。

用于实现上述检测方法的船舶压载水中10-50um生物快速检测装置，结构如图1所示：包括样品箱2、冲洗液箱13、裂解液箱3、废水箱14、检测箱17、一级过滤器1和二级滤器8，一级过滤器1为使用网孔对角线长度为50um的尼龙筛绢制成的过滤器；二级滤器是使用绝对孔径为10um的微孔滤膜制成的过滤器。一级过滤器的出口与样品箱2进口相连，经一级过滤器过滤后的液体进入与样品箱2内一级过滤器和样品箱2间连接管路上可以设有一级泵，也可以是一级过滤器设在样品箱2上方，利用液体的重力自然流入。检测箱17上设有染色剂加入口12，样品箱2、冲洗液箱14和裂解液箱3的出口上分别设有样品泵4、冲洗泵13和裂解泵5，样品泵4的出口经过滤阀6与二级过滤器8的一端口相连，二级过滤器8的另一端口经冲洗阀11与冲洗泵13出口相连，二级过滤器8与冲洗阀11间的连接管经排液阀10与废水箱15相连，检测箱17的进液口经进液阀9与过滤阀6和二级过滤器8间的连接管路相连，裂解泵5出口经裂解阀7与检测箱17相连，检测箱17上设有荧光计18，荧光计18的检测探头设在检测箱17内；荧光计的发射光波长为460-490nm，接收的激发光波长为510-550nm；所述的检测箱下部经排放阀16与废水箱15相连。

本发明中所述的10-50um生物是指：尺寸小于50um但大于或等于10um的存活生物。

船舶压载水中10-50um生物快速检测装置工作时，将待检测的压载水样品放入一级过滤器内，一级过滤器将压载水样品中不小于50um的存活生物滤出，经其过滤后的滤出液进入样品箱内，向冲洗液箱和裂解液箱内分别加入清洗液和细胞裂解液；打开过滤阀和排液阀，其它阀门关闭，样品泵工作，定量的将样品箱内的滤出液经二级过滤器过滤，滤出的液体排入废水箱内，而不小于10um的存活生物被二级过滤器截留；关闭过滤阀和排液阀，此时染色阀和排放阀也处于关闭状态，打开冲洗阀和进液阀，冲洗泵工作，使用定量的冲洗液对二级过滤器反冲洗，将其截留的10-50um生物冲洗进检测箱内；关闭冲洗阀和进液阀，经向染色剂加入口向样品箱内加入适量的活细胞荧光染色剂、对活细胞进行荧光染色；对活细胞染色完成（约10分钟）后，打开裂解阀，裂解泵工作，将细胞裂解液输入检测箱内，待细胞充分裂解后，使用荧光计测出检测箱内的相对荧光强度值。选取80种通过实验室方法已经确定的、含9个10-50um存活生物的待排放压载水水样作为待检测的压载水样品，通过上述的使用方法使用该装置进行检测，求取平均值作为相对荧光强度参考值；将相对荧光强度值与相对荧光强度参考值对比，当相对荧光强度不大于相对荧光强度参考值时，说明待排放的船舶压载水符合排放标准，反之说明待排放的船舶压载水不符合排放标准，使用相同的各种试剂的情况下，相对荧光强度参考值仅需求取一次，即可在多次、甚至无数次检验中成为参考值，有此参考值的情况下，本发明结构简单、使用方便，检测速度快、精度高，数据真实可靠。

实例1

一种船舶压载水中10-50um生物快速检测方法，包括如下步骤：使用网孔对角线长度为50um的尼龙筛绢制成的过滤器将经压载水处理设备处理后的待排放的压载水样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；取200ml滤出液，小于10um的存活生物随液体滤出；使用10ml的物质的量浓度为0.8mol/L、pH=7的Tris-HCl反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；向样品槽内加入活细胞荧光染色剂荧光素二乙酸酯20mg，染色10分钟；染色完成后，向样品槽内加入10ml的细胞裂解液（细胞裂解液为甲醇与氯仿按体积比1:2混合而成的液体），静置5分钟；细胞充分裂解后，使用荧光计检测样品槽内液体的相对荧光强度。

相对荧光强参考值的获取方法如下：选用60种已知的、每毫升含9个10-50um存活生物的待排放压载水水样作为参考检测样品；对每种参考检测样品进行如下操作：使用网孔对角线长度为50um的尼龙筛绢制成的过滤器将参考检测样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；取200ml滤出液，小于10um的存活生物随液体滤出；使用10ml的物质的量浓度为0.8mol/L、pH=7的Tris-HCl反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；向样品槽内加入活细胞荧光染色剂荧光素二乙酸酯20mg，染色10分钟；染色完成后，向样品槽内加入10ml的细胞裂解液（细胞裂解液为甲醇与氯仿按体积比1:2混合而成的液体），静置5分钟；细胞充分裂解后，使用荧光计检测样品槽内液体的相对荧光强度值。计算出该60种参考检测样品处理后得到的相对荧光强度的平均值，该平均值为相对荧光强度参考值。将待检测压载水处理后得到的相对荧光强度值与相对荧光强度参考值对比，即可判断该待检测压载水样品是否符合排放标准。

参考检测样品经如下方法获得：使用大孔径过滤器将经压载水处理设备处理后的待排放的压载水样品中不小于50um的存活生物滤出，得滤出液；取Aml滤出液，使用小孔径过滤器过滤并截留滤出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物随液体滤出；使用3-10%Aml的清洗液反冲洗小孔径过滤器、将截留的尺寸在10-50um的存活生物冲洗进入到样品槽内；将样品槽内的液体经FDA-CMFDA法在荧光显微镜下检测，其中10-50um存活生物的含量符合要求时，即可成为参考检测样品。本发明中分别采用清洗液选用BES、MOPS、PBS（pH=7.0）、Tris-HCl(0.2-1.0M，pH=6.0-7.2)中的至少一种，能够最大限度的减少FDA的非生物水解。细胞裂解液能够使活细胞内部的荧光素浸出，提高检测结果的准确性。

FDA连有两个共轭的醋酸自由基，是一种非极性物质，能自由通过藻类细胞膜，被细胞中的酯酶、蛋白酶、脂肪酶等非专一性酶催化水解成荧光素。FDA是无色化合物，本身没有荧光，而反应产物荧光素是一种极性且具有荧光发光性能的物质，化学性质稳定、不易被分解，难以穿过细胞膜，在细胞内积累。当细胞内储存的荧光素超过一定量后释放到环境中，由于反应物与产物的荧光特性不同，因此即使反应物过剩，也不干扰产物的测定。

相对荧光强度与10-50um生物含量之间的关系

配制不同浓度的四爿藻溶液，其存活细胞含量使用FDA-CMFDA法检测确定。将各溶液加入到本发明的装置中，使用本发明的方法进行相对荧光强度的测试。以四爿藻活细胞含量为x轴，以测得的相对荧光强度为y轴，作出图2，由图2可知，本发明的检测结果与实际活细胞含量具有较好的一一对应关系，能够反映

出样品中的活细胞含量。