用于检测寨卡病毒的核酸、实时荧光RPA试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及用于寨卡病毒检测的实时荧光RPA试剂盒及其检测方法。

背景技术：

寨卡病毒病也称寨卡热(Zika fever)，是由寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)引起并通过蚊媒传播的一种病毒性疾病。寨卡病毒于1947年首次在乌干达被发现，科学家们在用于黄热病监测的恒河猴体内分离到一种病毒，命名为“寨卡病毒”。1952年，乌干达及坦桑尼亚发现人感染寨卡病毒。随后仅有该病的零星报告或小规模流行。直至2007年，位于南太平洋地区密克罗尼西亚联邦雅浦岛发生寨卡病毒暴发流行，病毒由东南亚输入，也是首次发现寨卡病毒在亚非大陆以外传播。2013年，法属波利尼西亚发生寨卡病毒暴发。2015年以前，暴发疫情主要分布在非洲、东南亚和太平洋岛国。2015年5月，巴西发现首例确诊寨卡病例，泛美卫生组织(PAHO)发出警告，巴西政府估计有44-150万人感染寨卡病毒。随后，美洲多个国家相继发生寨卡病毒感染病例。迄今，全世界已有30多个国家报道寨卡病毒感染并引发多个国家输入性病例。近期有相关媒体报道中国台湾地区有输入性寨卡病毒感染病例报告，且有研究提示，寨卡病毒与新生儿小头畸形存在关联，并可通过性途径传播。我国和美洲地区有持续的经济贸易和旅游往来，且具备寨卡病毒传播蚊媒，存在病毒输入引发本地传播的风险。

寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，病毒颗粒呈球状，直径约为40-70nm。寨卡病毒为单股正链病毒，基因组长约10.8kb，含一条单一开放读码框，病毒蛋白由一个单一的多蛋白前体"经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成，包括3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，结构蛋白位于氨基端，非结构蛋白位于羧基段，具有丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶和RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)功能。其中，衣壳蛋白和单股正链基RNA因组构成20面体对称的核衣壳，外层脂质包膜。

寨卡病毒感染的实验室诊断主要依靠对发病5天内病人血液样本中病毒核酸的检测，包括病毒分离及RT-PCR扩增。一般发病后，5天内血液标本病毒分离率较高。可从病人全血、血清、血浆中分离病毒，用全血分离效率较高。将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21、Vero)进行分离培养，乳鼠脑内接种、巨蚊胸内接种亦可用于病毒分离。出现病变以后，用检测抗原或核酸方法鉴定病毒。分离到寨卡病毒可以确诊。

血清学试验，包括ELISA、免疫荧光、中和试验等，也被广泛应用于寨卡病毒的实验室检测。病毒特异性IgM和中和抗体出现较晚，约发病后1周末期可检出。在2007年雅浦岛寨卡病毒暴发流行时，美国疾病预防控制中心就已建立了检测寨卡病毒IgM特异性抗体的ELISA方法。但黄病毒间交叉反应常见，难以鉴别。有研究报道，寨卡病毒与登革病毒、黄热病毒、圣路易斯脑炎病毒等存在血清学交叉反应。此外，在感染早期，IgM和IgG抗体的滴度较低，难以确诊。空斑减少中和试验(PRNT)可检测病毒特异性中和抗体，可以区别黄病毒首次感染产生的抗体。目前尚没有检测寨卡病毒特异性抗体的商品化试剂。

目前，检测寨卡病毒的核酸方法主要为实时荧光RT-PCR。尽管该方法的检测时间相比普通PCR方法有所缩短，但其还是基于变温进行的，因此对于仪器的要求较高。截止目前，还没有见到一种快速、不需要特殊设备也可获得较为可靠的结果的检测方法。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplifcation，RPA)是近年来发展起来的新型等温扩增技术，其原理是重组酶和引物形成复合物，当发现模板DNA与引物完全互补的序列的时，单链DNA结合蛋白对模板DNA进行解链，引物与模板DNA开始配对并在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应，形成双链DNA产物；实时RPA则是在扩增体系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时监测。但目前由于引物及探针的设计难度较大，一般较难达到理想的检测效果。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供了一组用于等温扩增检测寨卡病毒的核酸。本发明的另一个目的是提供一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA试剂盒及其检测方法。本发明的检测方法不需要特殊的仪器即可获得检测结果，检测快速、成本低。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于等温扩增检测寨卡病毒的核酸，包括用于寨卡病毒检测的上、下游引物和探针，其中，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述探针的序列如SEQ ID No.3所示，其中，所述探针的第31位T碱基标记荧光基团，第32位T碱基标记荧光淬灭基团，所述第31位T碱基与所述第32位T碱基之间设有脱碱基位点，所述探针的3’端磷酸化设计。

如上所述的核酸，优选地，所述荧光基团为FAM或TAMARA，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3’端的磷酸化设计可替换为连接C3-Spacer或biotin-TEG。

如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括寨卡病毒检测的阳性扩增产物序列，所述寨卡病毒检测的阳性扩增产物序列包含如SEQ ID No.4所示的序列。

一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的核酸，逆转录酶、重组酶及DNA聚合酶混合液、2×重组反应液、醋酸镁溶液。

如上所述的实时荧光RPA试剂盒，该试剂盒还包括20nm的纳米金溶液。

一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA方法，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：

(1)从样品中提取RNA；

(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述寨卡病毒的上、下游引物及探针，置于40℃恒温反应；

(3)在所述恒温反应进行5min后取出反应，进行上下颠换混匀反应液，然后放入继续进行反应25min，同时收集荧光信号；

(4)结果判定：待测样品中有明显扩增曲线，则判断为阳性，如无明显扩增曲线，判断为阴性。

如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中等温扩增的反应体系具体如下：反应总体积为50μL，其中，

缓冲液为2×重组反应液，

酶为逆转录酶、重组酶及DNA聚合酶混合液，

所述寨卡病毒的上、下游引物的终浓度为0.42μmol/L，所述探针的终浓度为0.12μmol/L，

所述样品的RNA为10μL，

所述反应体系中需要在最后加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液。

如上所述的方法，优选地，所述反应体系还包括有20nm的纳米金，其终浓度为0.12μmol/L。

如上所述的方法，优选地，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用包含如SEQ ID No.4所示的序列质粒作为阳性对照。

本发明提供了一种用于等温扩增检测寨卡病毒的实时荧光RPA试剂盒，使用方便，操作简便，有效替代实时荧光RT-PCR来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，成本低，并大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减少了在操作过程的污染，避免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实现了快速筛查，所用试剂盒的检测效果好，特异性强，灵敏度高。该实时荧光RPA试剂盒的用于检测寨卡病毒的反应时，所需仪器的兼容性强，在实时荧光PCR仪和具有荧光捕获功能的仪器上均可以进行反应，其最大优势在于进行等温扩增并在10～30min内即可实时检测到荧光信号。

提供的检测方法中(1)引物探针只需要一对；(2)只需要40℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；(3)反应时间仅需30min；(4)结果易于判断，并且可以实时观察。操作步骤较少，一次加入后直接进行反应，避免二次污染。纳米金溶液提高了体系关键成分的有效浓度，进一步提高了方法的灵敏度。该方法操作简单、方便快捷、克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，又克服了实时荧光RT-PCR技术的检测时间长、需要专用的变温设备等问题。本发明适合大批量样本的快速筛查检测。

附图说明

图1为本发明实施例2中的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图2为本发明实施例3中的阳性对照的检测结果。

图3为本发明对灵敏度的检测中扩增产物的起飞时间与质粒拷贝数的关系图。

图4为本发明方法对样品的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1引物、探针的设计

本发明中，采用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，进行对寨卡病毒的检测，对引物及RPA探针的设计尤为关键，且该技术的引物及探针设计没有专门的软件进行，只能依靠人工设计，并在RPA探针中间位置的两个胸腺嘧啶核苷酸上分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，两个基团之间设计一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被具有3'-5'外切酶活性的核酸外切酶III识别、切割，游离荧光基团，从而发出荧光信号随后被荧光检测的仪器捕获。则RPA探针的设计尤为重要，关系整个实验的成败，其设计的成功不仅需要依据经验设计，还需要大量实验验证，才能获得比较可靠适用于检测的引物及探针。

与普通PCR的引物相比，本发明中设计的引物较长35bp，如果设计的过短，会增加非特异性扩增导致假阳性，如果设计过长，导致无法进行扩增；与实时荧光RT-PCR相比，本发明中的探针中碱基修饰主要集中在序列的中后部，同时探针的中间出现Spacer，比实时荧光RT-PCR中的探针更为复杂，而且探针的设计完全依赖人工，没有专门的探针设计软件。经验证本发明设计的引物及探针获得较好的检测结果。

具体地，根据Genbank检索寨卡病毒的膜蛋白基因片段，设计上、下游引物及探针。寨卡病毒用于恒温扩增检测的上、下游引物(RPA-F、RPA-R)探针(RPA-P)，具体如下：

RPA-F(SEQ IDNo.1)：5′-AACAACAAAGAGGCATTGGTAGAATTCAAGGATGC-3′

RPA-R(SEQ IDNo.2)：5′-ACACGCCCTTCAATCTAAGCTTGTCCATTTTTAGG-3′

RPA-P(SEQ IDNo.3)：5′-CAGAGAACAGCCTTCCCTTTGCACCATCCATTCAGCCTCTAGAGCTC-3′。

在RPA探针中间位置的两个胸腺嘧啶核苷酸上分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，两个基团之间设计一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被具有3'-5'外切酶活性的核酸外切酶III识别、切割，游离荧光基团，从而发出荧光信号随后被荧光检测的仪器捕获，经过大量的实验验证，结果表明，本发明选择在第所述探针的第31位T碱基标记荧光基团，第32位T碱基标记淬灭基团，所述第31位T碱基与所述第32位T碱基之间设有脱碱基位点(dSpacer)，所述探针的3’端磷酸化，检测效果最优。所述探针5’端所标记的荧光基团为FAM时，对应的淬灭基团为BHQ1；当标记的荧光基团为TAMARA时对应的淬灭基团为BHQ2；探针的dSpacer设计也可选择脱碱基的类似，如采用四氢呋喃(THF)代替dSpacer；探针的3’端磷酸化的设计，也可采用连接C3-Spacer，biotin-TEG代替探针3’端磷酸化，经验证，采用上述基团检测时，检测效果相同。

实施例2质粒的构建

在Genebank中比对寨卡病毒的全基因组序列，选择较为保守的序列区段(膜蛋白基因，位点为1584-2107)，在1584位点5’端引物入SP6启动子序列：ATTTAGGTGACACTATAG，在2107位点3’端引入6×His标签序列。引物SP6启动子的原因是在质粒成功构建后，利用PCR方法扩增出上述重组序列，利用转录试剂盒，将人工合成的序列体外转录成RNA模拟寨卡病毒的核酸。利用6×His标签序列的目的是为了区分阳性质控和样本中真实存在的寨卡病毒核酸。

具体如下：

(1)人工合成组装的序列(SEQ ID No.4)如下：

5′-ATTTAGGTGACACTATAGCATTGGTTGGTGCACAAAGAGTGGTTTCATGACATCCCATTGCCTTGGCATGCTGGGGCAGACACCGGAACTCCACACTGGAACAACAAAGAGGCATTGGTAGAATTCAAGGATGCCCACGCCAAGAGGCAAACCGTCGTCGTTCTGGGGAGCCAGGAAGGAGCCGTTCACACGGCTCTCGCTGGAGCTCTAGAGGCTGAGATGGATGGTGCAAAGGGAAGGCTGTTCTCTGGCCATTTGAAATGCCGCCTAAAAATGGACAAGCTTAGATTGAAGGGCGTGTCATATTCCTTGTGCACTGCGGCATTCACATTCACCAAGGTCCCAGCTGAAACACTGCATGGAACAGTCACAGTGGAGGTGCAGTATGCAGGGACAGATGGACCCTGCAAGATCCCAGTCCAGATGGCGGTGGACATGCAGACCCTGACCCCAGTTGGAAGGCTGATAACCGCCAACCCCGTGATTACTGAAAGCACTGAGAACTCAAAGATGATGTTGGAGCTTGACCCACCACATCATCATCATCATCAT-3′。

(2)PCR扩增组装序列：

其中，扩增所用的引物F-1(SEQ ID No.5):5'ATTTAGGTGACACTATAGCATTGGT3'；和R-1(SEQ ID No.6)：5'ATGATGATGATGATGATGTGGTGGG 3'。选用的扩增试剂盒为PROMEGA公司GOTO EASYTM PCR试剂盒。反应体系组分及其体积见表1。

表1反应体系

扩增条件：采用以下扩增条件。

例如

PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示。将所扩增的PCR产物进行切胶回收。利用promega公司的TA克隆试剂盒进行TA克隆。切胶纯化后直接连接于pMD18-T载体，将构建好的转化至感受态细胞DH5α，挑取阳性单克隆测序，经测序并与选择的序列进行同源性比对发现，核苷酸同源性为100％，所选择的基因区段没有发生核苷酸的突变。

实施例3寨卡病毒等温扩增检测的方法

本发明建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有作为阳性对照及阴性对照试剂，阴性对照采用无核酸酶水；

阳性对照采用携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列含有如SEQ ID No.4所示的序列。

阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

经过多次优化实验，确定采用以下方法进行检测。

采用等温扩增检测寨卡病毒的方法包括以下步骤：

(1)样品RNA提取

样品RNA提取可选用商品化的核酸提取试剂盒(如Qiagen、promega公司等)进行提取。

(2)等温扩增

采用50μL反应体系：所述的缓冲液为2×重组反应液25μL，逆转录酶、重组酶及DNA聚合酶混合液5μL，

所述寨卡病毒的上、下游引物终浓度各为0.42μmol/L，探针的终浓度为0.12μmol/L，其中上、下游引物序列RPA-F、RPA-R如SEQ ID No.1、SE Q ID No.2所示，探针采用RPA-P:5′-CAGAGAACAGCCTTCCCTTTGCACCATCCA[FAMdT][dSpacer][BHQ1dT]CAGCCTCTAGAGCTC[phosphate]-3′；

所述样品的RNA为10μL，

所述反应体系中需要在最后加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液，

其余用无核酸酶水补足总体积50μL。

上述的2×重组反应液，逆转录酶、重组酶及DNA聚合酶混合液，可采用英国TwistDX公司的试剂。

设置阳性对照时，分别采用实施例2中含有寨卡病毒的阳性扩增序列的质粒替换样本RNA，如采用如设置阴性对照时，采用无核酸酶水替换样本RNA。

扩增条件：优选以下扩增条件：

40℃，30min。

其中，在反应进行5min后取出反应，进行上下颠换混匀反应液，然后放入继续进行反应25min；

(3)荧光型号收集，在反应一开始，选择信号通道FAM通道或TAMARA通道进行荧光信号采集(与设计的探针中荧光基团相对应)。

(4)结果判定：待测样品中有明显扩增曲线，则判断为阳性，如无明显扩增曲线，判断为阴性。如图2所示，明显的扩增曲线为阳性对照的检测结果。

本发明所用的检测方法仅对检测寨卡病毒的核酸进行检测，并不是对寨卡病例进行确诊的检测，本发明的检测方法为非诊断目的的检测方法。

实施例4本发明检测方法的灵敏度

将实施例2中制备的质粒模板标准品，即阳性质粒标准品作10^-4～10^-10梯度倍比稀释，采用实施例3中的检测的方法来验证该方法的灵敏度，对每一个浓度的样本，都做3个重复试验，并建立标准曲线。

实施例2中制备的原质粒标准品的浓度为17.63ng/μL，按照拷贝数copies/μL＝(17.63ng/μL×10^-9)×(6.02×10²³)/(660×DNA长度)公式计算，原质粒标准品的拷贝数为2.91×10¹⁰copies/μL。

采用实施例3中的检测试剂和方法，获得检测寨卡病毒的灵敏度为29.1copies/μL。

为了提高检测灵敏度，避免假阴性检测结果的发生，在实施例3的基础上，在反应体系中加入了纳米金溶液，经大量试验发现，在所述反应体系中加入20nm、终浓度为0.12μmol/L的纳米金溶液0.6μL，检测灵敏度可提高一个数量级，即根据实验结果，本发明中检测寨卡病毒的最低检测限为2.91copies/μL，实验中扩增产物的起飞时间与质粒拷贝数的关系如图3所示。

实施例5本发明与实时荧光RT-PCR的检测比较

将实施例2中制备的质粒模板标准品，即阳性质粒标准品作10^-1～10^-10梯度倍比稀释，采用实施例3中的加入纳米金的检测的方法来与现有技术中的实时荧光RT-PCR方法进行比较，对每一个浓度的样本，都做3个重复试验。实时荧光RT-PCR采用文献：Faye O,Faye O,Diallo D,et al.Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught Mosquitoes[J].Virology Journal,2013,10(16):2663-2664.中所公开的引物及探针、其反应体系及反应条件如下：2×RT-PCR缓冲液12.5μL、上下游引物各0.2μL、探针0.2μL、酶混合液1μL、检测样本RNA为10μL及无核酸酶水补足体系至25μL。混匀后，45℃逆转录25min，95℃灭活及预变性15min；95℃变性15sec，55℃退火及延伸60sec(收集荧光信号)，进行45个循环，实验结果见表，通过比较发现本发明的检测灵敏度比现有技术中的实时荧光RT-PCR检测限，高1个数量级，即为本发明的最低检出限为2.91 copies/μL，而实时荧光RT-PCR的检测限为29.1 copies/μL，采用本发明的检测方法与实时荧光RT-PCR检测结果如下表2。

表2本发明的检测方法与实时荧光RT-PCR检测结果

实施例6本发明的特异性及实际样本的检测

参照Qiagen提取试剂盒的说明书进行RNA提取，并用优化好的检测体系和条件即实施例3来评价该检测方法的特异性，对两例寨卡病毒确诊阳性的样本、2黄热病度感染的阳性样本、100份未感染寨卡病毒的人血清及50份没有感染寨卡病毒的蚊组织样本进行检测，上述样品均由淮安疾控中心提供，检测结果见图4所示。有明显扩增曲线的为阳性，对寨卡病毒确诊阳性的样本检测为阳性，对黄热病度感染的阳性样本、未感染寨卡病毒的人血清及没有感染寨卡病毒的蚊组织样本的检测均为阴性，说明本发明建立的方法即采用的引物及探针的特性强，与其他病原不发生交叉反应。