本发明属于蛋白质的分离纯化领域，尤其涉及一种重组枯草杆菌纤溶酶的分离纯化方法。
背景技术：
我国人口众多，人口老龄化速度加快，心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升，而且心脑血管疾病发病的年轻化趋势越来越严重，每年因患心脑血管疾病死亡的人数高达700万人，心脑血管疾病患病人数已经超过3亿，已经成为人类健康的头号杀手。仅在我国整个心脑血管疾病相关市场已经超过1万亿元。而心脑血管疾病背后主要致病原因是血栓的形成。但是，目前血栓栓塞性疾病的治疗主要有外科手术、保守疗法和溶栓疗法3种方法都存在一定的缺陷。外科手疗法风险很大，而且手术部位血管变薄，容易导致血管破裂出血，此外人造血管部位更容易再次形成血栓；保守疗法主要指长期服用西药，西药疗法让患者长期服用抗血栓药物，包括抗凝剂、抗血小板聚集药物和降血压药物，降低凝血倾向。长期服用西药加速血管老化，使血管变脆变薄，导致血管破裂引起严重的出血性副作用，溶栓疗法是目前认为治疗血栓栓塞性疾病最为有效并且可靠的手段，但是，市场上溶栓药物因为存在半衰期过短、特异性低引起出血性副作用等瓶颈问题而难以得到普及，并且只能用于注射抢救用药。因此，市场上非常缺乏可以长期服用且安全有效的预防和治疗血栓栓塞性疾病的溶栓药物。
枯草杆菌纤溶酶是由枯草芽孢杆菌分泌的一种纤维蛋白溶解酶，首先是从日本古老的发酵食品纳豆中分离得到。枯草杆菌纤溶酶对人体纤维蛋白/纤维蛋白原具有靶向的溶解功效，与目前市场上在售的心脑血管疾病治疗药物相比，枯草杆菌纤溶酶可以靶向溶解血栓中起到主体支撑作用的胶联纤维蛋白，从而发挥瓦解血栓再通血管的功效，并且安全无毒副作用。因此，枯草杆菌纤溶酶在心脑血管疾病的预防和治疗领域具有无限的发展前景。但是，目前应用于该蛋白的分离纯化关键技术还没有得到有效解决，而分离纯化大量得到高度纯化的枯草杆菌纤溶酶，是实现枯草杆菌纤溶酶药物的开发并实现产业化的必要前提。而枯草杆菌纤溶酶自上世纪80年代发现以来，一直依靠传统大豆固体发酵很难实现枯草杆菌纤溶酶的大量分离纯化。由于固体发酵含量极低，并且发酵产物及其复杂，势必造成纯化成本极其高昂。因此枯草杆菌纤溶酶一直用于保健食品领域的开发，并没有发挥其自身的重要药用价值。
技术实现要素：
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种重组枯草杆菌纤溶酶的分离纯化方法，能够获得高纯度的重组枯草杆菌纤溶酶，而且操作简单，易于产业化放大。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种重组枯草杆菌纤溶酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)疏水层析：选用苯基琼脂糖系列疏水填料填充层析柱,使用A液冲洗平衡层析柱，紫外吸收波长为280纳米进行检测，重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液去除菌体后直接上样到疏水层析柱中，继续流加A液，直至流穿峰流穿完全，更换B液进行洗脱，直至与填料相结合的重组枯草杆菌纤溶酶被全部洗脱，得到高纯度的重组枯草杆菌纤溶酶液；
2)脱盐层析：流动相缓冲液为B液，调节纯化设备的紫外吸收波长为280纳米,选用G25脱盐填料填充层析柱；流加一个柱体积等量的B液，将疏水层析中所得的纯化液上样到G25脱盐填料填充的层析柱中进行脱盐处理，收集流出的重组枯草杆菌纤溶酶蛋白峰，得到脱盐纯化液。
本发明还提供一种重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：取菌种库保存的重组枯草杆菌纤溶酶的重组酵母菌，在YPD固体培养基中划线，28度培养48-72小时，挑取单菌落接种到200毫升的YPD液体培养基中，于摇床中28度培养18-24小时，待OD600达到6-10时，进行发酵罐接种发酵；
2)接种：将活化好的200毫升种子液以10％接种量接种到7升发酵罐的发酵培养基中，初始发酵培养基的体积为2升；
3)批量生长阶段：设定发酵温度为28度，28％的氢氧化铵自动调整pH维持在5.0,保证发酵过程中溶氧DO大于20％，直至甘油完全消耗，DO接近100％，重组酵母细胞的产量为90-150克/升的湿重；
4)甘油的流加阶段：设定初始补加速率为每升初始发酵液中每小时流加甘油量为10-15毫升，保证发酵过程中过程中DO大于20％，甘油的补充要在4小时或者以上，末期重组酵母细胞的湿重达到180～220克/升；
5)甲醇诱导阶段：停止流加甘油补充液后直至发酵液中的甘油消耗完全，DO升至100％保持40分钟左右，诱导温度降低到26度，设定甲醇补加速率为每升初始发酵液中每小时流加甘油量为3.6毫升,2-4小时后，DO读数稳定，补给速率加倍到7.3毫升/小时/升；2个小时后，甲醇的补给速率增加到10.9毫升/小时/升直至发酵结束；保证发酵过程中DO大于20％；整个甲醇的补给阶段持续70小时，每升初始发酵体积需要500-750毫升的甲醇补给；
6)收罐：发酵液于4℃下，8000转/分钟离心10分钟，收集上清液，即得重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液，所得的重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液的蛋白含量可达到6.0-8.5克/升。
进一步，所述A液为pH值为6.50的20毫摩尔磷酸缓冲液中加1摩尔氯化钠；所述B液为pH值为6.50的20毫摩尔磷酸缓冲液。
进一步，所述疏水层析柱的大小为5厘米×20厘米。
进一步，所述苯基琼脂糖系列疏水填料的体积为500毫升。
进一步，所述G25脱盐填料的体积为3升。
进一步，以质量体积百分比计，所述YPD固体培养基的配方为：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、琼脂1.5％；所述YPD液体培养基的配方为：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％。
进一步，以质量体积百分比计，所述发酵培养基的配方为KH2PO4 5克/升、CaSO4·2H2O 1克/升、MgSO4 10克/升、K2SO4 10克/升、NH4H2PO440克/升、KOH 1.5克/升、甘油40克/升。
本发明还提供一种脱盐纯化液重组枯草杆菌纤溶酶纯度的检测方法，包括以下步骤：
上样前5％E加95％D液平衡柱，将20微升的脱盐后的重组枯草杆菌纤溶酶纯化夜上样，0-15分钟，D液由95％线性下降到5％线性，E液由5％线性上升到95％线性进行线性洗脱，16-21分钟，5％E加95％D液平衡柱，DAD检测器，280纳米检测，流速1毫升/分钟，色谱柱为C18柱。
进一步，所述D液为含0.1％TFA的纯水；所述E液为含0.1％TFA的乙腈。
本发明的有益效果为：本专利在枯草杆菌纤溶酶重组酵母发酵的基础上，在发酵培养液中建立了中试水平的枯草杆菌纤溶酶分离纯化方法，通过该方法可以大量获得高度纯化的纤溶酶，纯度可以达到95％，并且操作简单，易于产业化放大。大量获得高纯度的枯草杆菌纤溶酶为药物开发提供了必要前提，具有巨大的发展潜力和市场应用价值。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如表1所示，根据重组枯草杆菌纤溶酶蛋白特点，依据纯化效率和最终蛋白纯化纯度进行，苯基琼脂糖系列疏水填料的种类可以选择以下几种：Phenyl Sepharose 6FF(HS)、Octyl Sepharose FF、CM-Sepharose FF、Benzamidine 4FF(HS)，Phenyl Sepharose 6FF(HS)和Benzamidine 4FF(HS)两种填料的纯度都超过95％，考虑到成本因素，最后综合比较选择确定纯化填料为Phenyl Sepharose 6FF(HS)。本实施例以Phenyl Sepharose6FF(HS)为例来说明。
一种重组枯草杆菌纤溶酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)疏水层析：选用Phenyl Sepharose 6FF(HS)填充层析柱,流动相缓冲液为A液和B液，调节纯化设备(纯化设备为江苏汉邦NP7000制备泵，NU3000检测器)紫外吸收波长为280纳米,注射泵流速为20毫升/分钟，A液平衡柱总共流加三个柱的体积，共1500ml，将重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液上500毫升,继续流加A液，直至流穿峰流穿完全，280纳米紫外吸收达到基线。然后更换B液进行洗脱，直至重组枯草杆菌纤溶酶全部洗脱，得纯化液共650毫升，此为高纯度的重组枯草杆菌纤溶酶液；
其中，A液为pH值为6.50的20毫摩尔磷酸缓冲液中加1摩尔氯化钠；B液为pH值为6.50的20毫摩尔磷酸缓冲液。
疏水层析柱的大小为5厘米×20厘米。
Phenyl Sepharose(苯基琼脂糖)6FF(HS)的体积为500毫升。
2)脱盐层析：
流动相缓冲液为B液，调节纯化设备紫外吸收波长为280纳米,选用G25脱盐填料填充层析柱；注射泵流速为30毫升/分钟，流加1个柱体积为3升的缓冲液平衡柱,将疏水层析中所得的纯化液全部上样进行脱盐处理，收集流出的重组枯草杆菌纤溶酶蛋白峰，得到脱盐纯化液共1.2升。
其中，G25(葡聚糖G-25)脱盐填料的体积为3升。
一种重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：取菌种库保存的重组枯草杆菌纤溶酶的重组酵母菌，在YPD固体培养基中划线，28度培养48-72小时，挑取单菌落接种到200毫升的YPD液体培养基中，于摇床中28度培养18-24小时，待OD600达到6-10时，进行发酵罐接种发酵；
2)接种：将活化好的200毫升种子液以10％接种量接种到7升发酵罐的发酵培养基中，初始发酵培养基的体积为2升；
3)批量生长阶段：设定发酵温度为28度，28％的氢氧化铵自动调整pH维持在5.0,保证发酵过程中溶氧DO大于20％，直至甘油完全消耗，DO接近100％，重组酵母细胞的产量为90-150克/升的湿重；
4)甘油的流加阶段：设定初始补加速率为每升初始发酵液中每小时流加甘油量为10-15毫升，保证发酵过程中过程中DO大于20％，甘油的补充要在4小时或者以上，末期重组酵母细胞的湿重达到180～220克/升；
5)甲醇诱导阶段：停止流加甘油补充液后直至发酵液中的甘油消耗完全，DO升至100％保持40分钟左右，诱导温度降低到26度，设定甲醇补加速率为每升初始发酵液中每小时流加甘油量为3.6毫升,2-4小时后，DO读数稳定，补给速率加倍到7.3毫升/小时/升；2个小时后，甲醇的补给速率增加到10.9毫升/小时/升直至发酵结束；保证发酵过程中DO大于20％；整个甲醇的补给阶段持续70小时，每升初始发酵体积需要500-750毫升的甲醇补给；
6)收罐：发酵液于4℃下，8000转/分钟离心10分钟，收集上清液，即得重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液，所得的重组枯草杆菌纤溶酶的发酵液的蛋白含量可达到6.0-8.5克/升。
以质量体积百分比计，YPD(酵母粉蛋白胨葡萄糖培养基)固体培养基的配方为：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、琼脂1.5％；YPD液体培养基的配方为：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％。
以质量体积百分比计，发酵培养基的配方为KH2PO4 5克/升、CaSO4·2H2O 1克/升、MgSO4 10克/升、K2SO4 10克/升、NH4H2PO4 40克/升、KOH 1.5克/升、甘油40克/升。
一种脱盐纯化液重组枯草杆菌纤溶酶纯度的检测方法，包括以下步骤：
上样前5％E加95％D液平衡柱，将20微升的脱盐后的重组枯草杆菌纤溶酶纯化夜上样，0-15分钟，D液由95％线性下降到5％线性，E液由5％线性上升到95％线性进行线性洗脱，16-21分钟，5％E加95％D液平衡柱，DAD检测器，280纳米检测，流速1毫升/分钟，色谱柱为C18柱。
D液为含0.1％TFA(三氟乙酸)的纯水；E液为含0.1％TFA的乙腈。
脱盐纯化液蛋白含量检测：检测得蛋白含量达到3.6mg/ml。所述蛋白含量检测方法参考中国药典2015版。
脱盐纯化液体外纤溶酶活性检测：检测得重组枯草杆菌体外纤溶酶活性达到46838IU/ml。所述体外纤溶酶活性检测方法以尿激酶为标准品，具体方法参考中国药典2015版链激酶活性测定方法。
脱盐纯化液酵母宿主菌体蛋白含量检测：检测得纯化液中宿主蛋白含量为21μg/ml,小于总蛋白含量的0.5％。所述酵母宿主菌体蛋白含量检测方法参考中国药典2015版。
综上，经过重组酵母发酵得到的发酵液，经过一步疏水层析即可得到95％纯度的重组枯草杆菌纤溶酶，活性达到46838IU/ml，为该领域活性领先水平。并且经过脱盐处理后，其纯度、宿主菌体蛋白含量完全达到了药典所规定的生物制品注射药剂的要求。因此，应用本专利所阐述的重组枯草杆菌纤溶酶纯化方法所得到的纯化蛋白完全可以应用于枯草杆菌纤溶酶口服药物和注射药物的开发，应用于目前形势严峻的心脑血管疾病的预防和治疗领域。具有巨大的市场发展前景和应用价值，可创造巨额市场利润。
表1：不同填料选择下，重组酵母发酵液中枯草杆菌纤溶酶纯化效率和纯度
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。