一种抗H3N2亚型犬流感病毒核蛋白单克隆抗体杂交瘤2D10及单克隆抗体的制作方法

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗H3N2亚型犬流感病毒核蛋白单克隆抗体杂交瘤2D10及单克隆抗体。

背景技术：

甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒最容易发生变异，甲型流感病毒包括多个亚型。目前已发现多种亚型流感病毒可感染犬，包括H1、H3、H5和H9亚型。其中H3N8和H3N2亚型流感病毒可在犬群中流行，主要引起呼吸道症状。犬流感出现不仅威胁犬的健康，也给公共卫生带来了威胁。最近研究发现，H3N2亚型犬流感病毒的HA基因有可能通过重配引入到人流感病毒中，而新的HA基因的引入有可能导致人际间流感大流行。

甲型犬流感病毒为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，编码10个基因的，其中第5片段RNA编码的是核衣壳蛋白(NP)。NP是一种单体磷酸化的多肽，包含498个氨基酸，分子量约为60KD，其中富含精氨酸、甘氨酸及丝氨酸，是构成核衣壳的主要成分，具有型特异性，其抗原性差异是流感病毒分型的依据之一。NP也是一种多功能蛋白质，在流感病毒的转录和复制中及确定病毒的宿主特异性等方面发挥作用。NP在病毒进化过程中变异频率低，在各个不同亚型中结构高度保守，且具有很强的免疫原性，能引起免疫应答产生抗体。因此，NP可作为甲型流感病毒临床诊断和治疗靶标，制备针对各亚型NP蛋白保守性抗原位点的单克隆抗体具有十分重要的意义，可为该蛋白的结构功能的研究及各种亚型体外诊断试剂的研制提供科学依据，并为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗H3N2亚型犬流感病毒核蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种分泌抗H3N2亚型犬流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，记为H3N2-CIV-NP-2D10，于2016年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2016155。

一种抗H3N2亚型犬流感病毒核蛋白的单克隆抗体，由上述所述的杂交瘤细胞株产生。

优选的，所述单克隆抗体为IgG2b亚类。

优选的，所述单克隆抗体的轻链为κ链。

一种检测H3N2亚型犬流感病毒的试剂盒，含有上述所述的单克隆抗体。

一种检测H3N2亚型犬流感病毒抗体的试剂盒，含有上述所述的单克隆抗体。

上述所述的抗H3N2亚型犬流感病毒核蛋白的单克隆抗体在鉴定甲型犬流感病毒NP蛋白中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明得到的杂交瘤细胞株分泌产量高，其分泌得到的抗H3N2亚型犬流感NP单克隆抗体可与包被在酶标板上的重组NP蛋白结合，并在Western-blot检测中识别H3N2亚型犬流感NP蛋白。

2、本发明得到的单克隆抗体在免疫荧光检测中能识别天然的NP蛋白。

3、本发明针对H3N2亚型犬流感病毒NP制备的单克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度，且能在ELISA和Western-blot检测中结合变性NP蛋白，并在免疫荧光检测中结合具有高级结构的天然NP蛋白，可为NP蛋白的结构功能的研究及各种亚型体外诊断试剂的研制提供科学依据，并为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

附图说明

图1为本发明杂交瘤细胞株H3N2-CIV-NP-2D10的单克隆抗体对H3N2亚型犬流感病毒免疫印迹的结果；

图2为本发明杂交瘤细胞株H3N2-CIV-NP-2D10单克隆抗体对H3N2亚型犬流感病毒免疫荧光染色的结果。

具体实施方式

下面结合具体实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

H3N2-CIV-NP-2D10杂交瘤细胞株的建立和抗H3N2亚型犬流感病毒NP单克隆抗体的制备及鉴定

一、小鼠免疫

将H3N2亚型犬流感病毒灭活后与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，以每只50μg/500μl的量分多点注射到BALB/C小鼠背部皮下(南方医科大学实验动物中心，6-8周龄雌性，3只)进行首次免疫；2周后将佐剂换成弗氏不完全佐剂进行二次常规免疫，免疫方法和剂量与首次免疫相同；常规免疫三次后采集少量尾静脉血，间接ELISA检测血清效价。结果见表1。

表1：H3N2小鼠三次免疫后效价测定

由表1可知：以H3N2亚型犬流感病毒为包被抗原进行检测，3#小鼠效价明显达到四万以上，以重组NP蛋白为包被抗原进行检测，3#小鼠效价达到两万，达到融合要求。融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射加强免疫。

二、杂交瘤制备

①制备饲养层细胞：选用BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞。融合前1天，将2只BALB/C小鼠拉颈处死，浸泡在75％酒精内5分钟；无菌操作条件下，用剪刀剪开小鼠皮肤，暴露腹膜，用注射器注入5ml预冷的RPMI-1640培养基，反复冲洗，吸出冲洗液，1000rpm，离心5分钟；弃上清，用含有20％胎牛血清的HAT RPMI-1640培养基重悬，加到5块96孔板内，100μl/孔，37℃，5％CO2培养。

②制备SP2/0骨髓瘤细胞：将经8-氮鸟嘌呤(8-AG)处理过的SP2/0骨髓瘤细胞培养至对数生长期，取8皿制成细胞悬液，离心，沉淀部分用RPMI-1640培养基洗3次，计数。

③制备免疫脾细胞：加强免疫3天后拉颈处死小鼠，无菌取脾脏，用RPMI-1640培养基洗一次后将脾脏研碎，过200目不锈钢筛网，制成细胞悬液。离心，沉淀部分用RPMI-1640培养基洗3次，计数。

④细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞以4：1比例混合，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状后，加入1ml聚乙二醇(PEG，分子量为1500，Roche)进行融合，用RPMI-1640培养基终止反应。离心取沉淀部分，用含有20％FBS的HAT培养基悬浮后加入已铺有饲养层细胞的5块96孔板中，100μl/孔。将培养板置于37℃，含5％CO2饱和湿度的培养箱内培养。

⑤杂交瘤细胞的筛选与细胞株的建立：采用间接ELISA法筛选细胞培养上清。用0.05M pH9.6碳酸盐包被液稀释H3N2亚型犬流感病毒和重组H3N2亚型犬流感NP蛋白，使其终浓度为2μg/ml和4μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯板，100μl/孔，37℃2小时。用含有5％脱脂奶粉的0.01M pH7.2PBS封闭，200μl/孔，37℃2小时。用洗液(PBS含0.05％v/v的Tween-20)洗板三次，拍干，用于检测。融合10天后，取细胞上清200μl于上述酶标板中，37℃1.5小时，洗液洗板三次后加入1:10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物科技有限公司)，100μl/孔，37℃1小时，同上洗板后，加入TMB显色液(广州优迪生物科技有限公司自制)100μl/孔，室温避光10分钟，加入2MH2SO2终止液，50μl/孔，终止反应，测450nm吸收值。骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断阳性细胞孔。选择效价较高的阳性细胞孔进行亚克隆，并用有限稀释法连续稀释亚克隆至少两次以上，直至单克隆细胞阳性率为100％为止，获得一株能稳定分泌抗H3N2亚型犬流感核蛋白抗体的单克隆细胞株，记为H3N2-CIV-NP-2D10，简称为2D10。细胞株扩大培养后，用含10％DMSO冻存液进行冻存保种。将本实施例获得的杂交瘤细胞株H3N2-CIV-NP-2D10送交中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校，保藏号为CCTCC NO：C2016155，保藏日期为2016年8月12日。

三、单克隆抗体的制备和纯化

选择10-12周龄雌性BLAB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡油500μl/只。7-10天后，取处于对数生长期的单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，每只注射5×10⁵-1×10⁶个细胞。饲养观察7-10天后，用无菌注射针头收集腹水，5000rpm离心20min，去除细胞成分和其他沉淀物，收集上清。取5ml腹水上清，用PBS稀释至30ml后用0.22μm微孔滤膜过滤。将滤液上样至已用PBS平衡好的Protein G亲和层析柱(GE Healthcare)，流速为1ml/min，上样完成后用PBS平衡，再用0.1M pH3.0的甘氨酸洗脱液洗脱，流速为4ml/min，收集抗体，并用1MpH9.0的Tris-HCl中和液中和抗体。以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

四、单克隆抗体浓度测定

采用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)测定纯化好的单克隆抗体，其浓度为1.5mg/ml。

五、单克隆亚型鉴定

取杂交瘤细胞H3N2-CIV-NP-2D10的细胞上清40μl加到小鼠单抗亚型快速分型胶体金试纸条上(广州优迪生物科技有限公司自制)，经鉴定，2D10分泌的抗体亚型为IgG2b，轻链为κ链。

六、单克隆抗体效价检测

分别以H3N2犬流感病毒和重组NP蛋白为包被抗原进行间接ELISA法检测，结果见表2。

表2：纯化抗体效价检测

由表2可知：本发明制备的抗体效价均可达到为1：320000。

七、亲和力检测

以ELISA方法检测本发明制备的抗体的亲和力，相对亲和常数为1.58×10⁸。

八、特异性检测

采用ELISA方法检测本发明制备的抗体对H5N1、H3N8、H7N9三种亚型的流感病毒的反应性。结果表明本发明制备的抗体与H5N1、H3N8、H7N9亚型流感病毒不发生交叉反应。

九、Western-blot鉴定

取经过变性处理的H3N2犬流感病毒和重组NP蛋白20ul，加入到12％SDS-PAGE点样孔内，常规电泳分离后用BIO-RED转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上；用TBST稀释的5％脱脂奶粉封闭1h，用TBST洗膜3次，每次间隔10min，加入本发明中制备的抗体1:1000稀释，37℃孵育1h，洗膜3次后加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，反应1h，洗膜3次，取ECL荧光底物(Pierce公司，货号：37071)A液和B液1各mL，混匀后，将PVDF膜浸泡其中，室温孵育3-5分钟后，用滤纸将PVDF膜表面液体擦干，并将其置于暗室，取医用X光底片覆盖，曝光1分钟后，依次显影、定影。杂交瘤细胞H3N2-CIV-NP-2D10制备的抗H3N2亚型犬流感NP蛋白出现单一的特异性条带，结果如图1所示。图1为本发明杂交瘤细胞株H3N2-CIV-NP-2D10的单克隆抗体对H3N2亚型犬流感病毒免疫印迹的结果，其结合条带的分子量约为60KDa。其中，泳道1：重组NP蛋白，泳道2：H3N2犬流感病毒，泳道M：蛋白Marker。

十、免疫荧光检测

将处于对数生长期的MDCK细胞铺在含玻片的6孔板内，每孔2×10⁵个细胞，培养过夜。用200μlH3N2犬流感病毒感染48h后，PBS洗涤玻片3次，每次5min。4％多聚甲醛固定细胞后，PBS洗涤3次，每次5min，1:1000加入本发明制备的抗体，阴性对照加抗体稀释液，4℃过夜。PBS洗涤玻片3次后加入FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗(中杉金桥)1：100稀释，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，DAPI室温染色5min，PBS洗片后，倒置荧光显微镜镜下观察并拍照。经过本发明制备的抗体染色的MDCK细胞质中均观察到绿色荧光，证明本发明制备的抗体可识别天然的NP蛋白，如图2所示。图2为本发明杂交瘤细胞株H3N2-CIV-NP-2D10的单克隆抗体对H3N2亚型犬流感病毒免疫荧光染色的结果。H3N2亚型犬流感病毒感染MDCK细胞，接种48小时后用4％多聚甲醛固定，先后孵育H3N2-CIV-NP-2D10单克隆抗体和绿色荧光标记的羊抗小鼠二抗，DAPI染色，荧光显微镜镜下观察结果。其中图2A是DAPI染色的MDCK细胞核，图2B是被H3N2-CIV-NP-2D10抗体染色的MDCK细胞质，图2C是图2A和图2B的重合图。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。