一种腺苷脱氨酶检测方法与流程

本发明属于医学检验领域，具体涉及一种腺苷脱氨酶检测方法。

背景技术：

腺苷脱氨酶(ADA)是机体必需的核酸分解代谢酶，在临床实验诊断中具有重要价值。目前酶学检测多采用酶偶联原理的连续监测法，测定样本中酶的催化活性浓度，该方法具有简便快速无毒无放射性的优点，在临床中广泛应用。目前临床ADA检测方法虽均采用四步酶偶联的检测原理，但性能参差不齐，且不同厂家的试剂配方及检测过程均存在差异，不同系统间的检测结果差异较大，且没有统一的参考区间，不利于临床检测结果的一致化，给临床诊疗带来诸多困扰。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种腺苷脱氨酶的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种腺苷脱氢酶的检测试剂，由以下两部分组成：

试剂1

试剂2

腺苷 10-14mmol/L；

EHSPT 1.5-2.5mmol/L。

优选的，所述的腺苷脱氢酶检测试剂由以下两部分组成：

试剂1

试剂2

腺苷 11-13mmol/L；

EHSPT 1.8-2.2mmol/L。

优选的，所述的腺苷脱氢酶检测试剂由以下两部分组成：

试剂1

试剂2

腺苷 12.2mmol/L；

EHSPT 2.0mmol/L。

优选的，试剂1和试剂2均由Tris缓冲液或PBS配制得到。

优选的，试剂1和试剂2由Tris缓冲液配制得到，其中Tris缓冲液的浓度为65-95mmol/L，pH6-7。

优选的，试剂1和试剂2由Tris缓冲液配制得到，其中Tris缓冲液的浓度为70-90mmol/L，pH6.2-6.8。

优选的，试剂1和试剂2由Tris-HCl缓冲液配制得到，其中Tris-HCl缓冲液的浓度为80.0mmol/L，pH6.6。

Tris缓冲液包括Tris-HCl和Tris-base。Tris的缓冲体系比PBS缓冲体系效果更佳。最佳的是Tris-HCl缓冲液，其浓度为80.0mmol/L，pH6.6。

优选的，稳定剂选自NaN₃，其终浓度为0.1-0.3mmol/L。

优选的，稳定剂选自NaN₃，其终浓度为0.15-0.25mmol/L。

优选的，稳定剂选自NaN₃，其终浓度为0.2mmol/L。

优选的，辅助因子选自TritonX-100，其加入量为试剂1总体积的0.6-0.9％。

优选的，辅助因子选自TritonX-100，其加入量为试剂1总体积的0.7-0.8％。

优选的，辅助因子选自TritonX-100，其加入量为试剂1总体积的0.76％。

辅助因子TritonX-100，也是一种表面活性剂，它可以快速消除非特异性反应，加快反应进程，是整个反应的催化剂。其他的表面活性剂如吐温等无法达到本发明的效果。

优选的，试剂1中还添加巯基保护剂EDTA，其终浓度为0.15-0.25mmol/L。

优选的，试剂1中还添加巯基保护剂EDTA，其终浓度为0.2mmol/L。EDTA可保护被检测的ADA蛋白活性。

上述反应中，磷酸氢二钠可提供足够磷酸根，保证反应顺利进行。嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶是反应偶联的工具酶，借助这几个酶的中间反应，使目标酶反应生成的产物经系列反应最终生成利于检测的有色物质。4-氨基安替比林和EHSPT为反应原理中最后一步的呈色反应底物。

一种腺苷脱氨酶的检测试剂盒，包括上述任一项所述的试剂。

一种腺苷脱氨酶的检测方法，包括下列步骤：

1)将180ul试剂1和5ul待测血清样品混合，孵育至37℃；

2)加入90ul试剂2进行检测，其中所用试剂如上述任一项所述。

优选的，检测波长：550±1nm；延迟时间：120s；监测时间：180s。

优选的，检测参考区间基于中国人群建立，其范围为健康成年人0-31U/L。

本发明检测方法的检测参考区间基于中国人群建立，对中国人群有更好的适应性。

优选的，线性范围为0.3-286U/L。

本发明检测方法具有较宽的线性范围。

本发明的有益效果是：

本发明方法在四步酶偶联的检测原理上，对检测条件、检测过程进行研发，优化得到的ADA检测的最佳组合条件。

本发明腺苷脱氢酶的检测试剂配方，检测参数以及参考区间的确定，有利于临床检测结果的一致化，给临床诊疗带来便利。本发明方法灵敏度更高，优于常规市售产品。

本发明方法检测灵敏度大大提高，并且克服了非特异性反应，检测方法更稳定，快速准确简单，性能得到很大改良，除此外还在该方法基础上建立了基于中国人群的较大样本的参考区间，对于中国人群有更好的适应性。

附图说明

图1为样本反应全程吸光度扫描图；

图2为检测方法的线性范围；

图3为参考区间频率分布直方图；

图4为优化方法与迈克方法的相关性及相对偏倚。

具体实施方式

EHSPTN为N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline的简写，中文名乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺。

本发明的检测原理，如下：

其中，ADA：腺苷脱氢酶；PNP：嘌呤核苷磷酸化酶；XOD：为黄嘌呤氧化酶；POD：过氧化物酶。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

1、试剂组成及浓度

试剂1：Tris-HCl(80.0mmol/L，pH6.6)，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄，10.3mmol/L)，4-氨基安替比林(4-AA，1.8mmol/L)，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，37℃2760U/L)，黄嘌呤氧化酶(XOD，37℃600U/L)，过氧化物酶(POD，37℃590U/L)，抗坏血酸酶(37℃2306U/L)，NaN₃(0.2mmol/L)，TritonX-100(试剂1总体积的0.76％)，EDTA(0.2mmol/L)；

试剂2(开始试剂)：Tris-HCl(80.0mmol/L，pH6.6)，腺苷(12.2mmol/L)，EHSPT(2.0mmol/L)。

2、检测条件

检测温度：37±0.1℃；检测波长：550±1nm；波宽：10mm±0.01mm，光径≤2nm，检测点≥6；孵育时间：300s；延迟时间：120s；监测时间：180s。

3、检测样本：血清。

4、一种腺苷脱氨酶的检测方法，包括下列步骤：

1)180ul试剂1和5ul血清样本加入反应杯，混匀孵育至37℃；

部分仪器可以搅拌加温同时进行；如果分步进行，即先混匀，后孵育至37℃，温度达到37℃，约需300s。

2)加入90ul试剂2，延迟120s，监测另外180s的线性；其中，可利用生化分析仪自动检测或利用紫外分光光度计进行手工检测。样本反应全程吸光度扫描图见图1。

图1说明在样本和反应液孵育阶段，曲线平直(前300秒)说明无非特异性(干扰)反应，加入开始试剂后，反应呈线性。

3)计算ADA活性：ADA(U/L)＝F*ΔA/Δt₅₅₀；

换算因子F＝1708[在550nm的ε(次黄苷)＝32.2mmol/cm]。

实施例2腺苷脱氨酶检测的性能参数

按照实施例1的方法确定本技术的性能参数。

结果如下：

批内精密度：≤1％，期间精密度：≤2％；

线性范围：0.3-286U/L；

灵敏度：检测标准物质活性超出给定靶值约30％。

抗干扰能力：甘油三酯≤3.39mmol/L(约20倍正常成人水平)，血红蛋白≤3.75g/L(肉眼可见的溶血为300mg/dl)，胆红素＜85.5umol/L，维生素C≤40mg/L(正常人血清维生素C的含量为ng/dl级别)，甘草次酸和脱氧胆酸≤20mg/L，黄芩素≤37.5mg/L时对方法无干扰。

检测方法的线性范围图见附图2。图2曲线的线性系数显著，相关系数R²＝0.9998表明X取值范围合适，在0-286U/L范围内呈线性。

本发明检测方法具有较宽的线性范围0.3-286U/L，优于市面上的市售产品。

实施例3重复性试验

下面对本发明建立的方法进行重复性检测，并分别计算出批内精密度和期间精密度。

选取了无肉眼可见脂血、溶血、黄疸和传染性指标阴性的血清样本(高低两浓度)。批内精密度：一个批次内每样本连续检测10次，计算均值，标准差和变异系数(CV)，期间精密度为：每样本每天检测3次，连续检测12天，计算均值，标准差和变异系数(CV)。

结果为批内精密度：≤1％，期间精密度：≤2％。

说明方法的批内和期间重复性均较好。

实施例4腺苷脱氨酶检测结果的参考区间

选择18-79周岁(男、女)的健康志愿者，按照实施例1的方法进行检测。其中总志愿者n＝1662名，纳入实验个体n＝742名，实验室检测排除个体n＝92名，纳入统计个体n＝650名，其中男n＝296名，女n＝354名。采用非参数统计方法，计算频率分布95％可信区间和90％参考限的置信区间，样本分布中位数为16.4U/L，均值为17.3U/L，均值的标准差为5.2U/L，标准误为0.2U/L，最小值4.2U/L，最大值43.5U/L，95％(单侧检验，α＝0.05)参考区间为0-31U/L，90％参考上限的置信区间为30.5-31.1U/L。样本检测结果频率分布见图3。

图3为参考区间频率分布直方图；检测结果频率分布基本呈正态，说明样本量足够且数据有效，可进行后续计算。

本发明检测方法的检测参考区间基于中国人群建立，对中国人群有更好的适应性，其范围为健康成年人0-31U/L。

对比例1

将本发明与四川迈克腺苷脱氨酶(ADA)测定试剂盒进行比对实验。结果见图4。

图4A表明本方法和迈克方法呈线性正相关。图4B表明迈克方法相对本方法均为负偏移，说明本方法检测条件比迈克方法的条件优越，提高检测灵敏度。本发明方法ADA检测活性比迈克试剂盒方法结果提高30-60％左右。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。