过氧麦角甾醇在抗流感病毒感染的药物中的应用及其制备的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，特别涉及过氧麦角甾醇在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用，还涉及从板蓝根中分离过氧麦角甾醇的方法。
背景技术：
：流感病毒(InfluenzaVirus)为包膜RNA病毒，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，分为A、B、C三型，也称为甲、乙、丙三型。流感病毒全基因长13.6kb，由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别编码10种结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非结构蛋白(NS1)。流感病毒表面的糖蛋白植物血凝素(HA)与宿主细胞表面唾液酸受体结合后介导流感颗粒的内吞而建立流感感染。禽流感病毒的糖蛋白植物血凝素(HA)与唾液酸(sialicAcid，SA)a2-3Ga1受体结合；人流感病毒与SAa2-6Ga1受体结合。禽流感与人流感对不同受体结合的差异性导致禽流感病毒难以传播到人群中。由流感病毒引起的急性上呼吸道传染性疾病，具有传染性强、传播速度迅速、易发生传染等特点。自20世纪以来，流感病毒在全球范围内造成几次大流行，例如：1918年“西班牙流感”；1957年“亚洲流感”；1968年“香港流感”，每次的大流感在全球的范围内造成巨大的损失。最近在我国东部沿海地区流行禽流感H7N9，经统计已658例感染和死亡病例221例，死亡率为33.5％。流行性感冒作为一种病毒性传染病不仅严重威胁着公众健康，而且给国家和社会带来了严重的经济负担。由于流感病毒的抗原变异能力极强且相当频繁，疫苗的研制和生产相对滞后，对于易感人群的保护率不高。当前美国食品和药物管理局(FDA)批准用于防治流感的药物有M2离子通道抑制剂：多金刚烷(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)和神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦(Oseltamivir)、扎那米韦(Zanamivir)，但分别已经存在引起流感病毒耐药株的出现的问题。因此，新的流感大流行随时都有可能爆发。在这种情况下，寻找具有预防和治疗作用的抗流感药物就显得尤为重要和紧迫。目前，较多研究表明，流感病毒的感染使得宿主免疫系统过度激活，导致过度炎症因子的表达致组织损伤是其主要的致病机制之一。例如：1918年的西班牙大流感与高致病禽流感H5N1导致的较高的发病率及病死率与早期募集至肺部炎症细胞导致随后发生的“炎症风暴”直接相关。感染09H1N1或者高致病禽流感病毒H5N1、H7N9病例产生严重病毒性肺炎。09H1N1感染病例中高表达炎症因子及趋化因子：IP-10、MCP-1和MIP-1。根据现有报道，流感导致“炎症因子风暴”产生而致机体免疫损伤，因此，控制宿主机体合适有效的清除病原免疫应答反应、防止过激免疫引起的免疫损伤这一环节，寻找到有效的调控宿主炎症的药物是十分必要的。流感感染导致肺损伤组织病理学及临床特征显示肺泡上皮细胞凋亡、坏死、肺泡间隔塌陷及严重的低氧血症，这与ARDS患者的特征相似。最近研究报道，在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的进展中肺内表达促凋亡配体FasL和TRAIL是诱导肺病理损伤的主要因素。凋亡因子TRAIL主要来源于募集至肺部的单核细胞和巨噬细胞群体。TRAIL过表达除了介导流感导致肺损伤外，也会有利于引起随后继发性细菌感染。在临床上现在应用的糖皮质激素具有抑制免疫应答、抗炎等的作用。其应用于ARDS患者的治疗，能降低炎症及临床的症状。此外，在慢性炎症COPD及哮喘中糖皮质激素长期应用也有较好的效果。糖皮质激素也应用于流感H1N1感染引起的急性炎症显示减少肺损伤及多器官功能衰竭。但，在2009H1N1流感流行应用糖皮质激素治疗却提高病人的病死率。因此，使用糖皮质激素进行对流感引起免疫炎症的治疗的疗效仍有待评价的。板蓝根分为南、北板蓝根，分别为爵床科和十字花科，性寒味苦，具有清热解毒、凉血利咽的功效，是临床十分常用传统的抗流感病毒中药。但板蓝根的有效抗流感成份及药理作用方式仍然不清楚。我们首次从南板蓝根中分离获得的甾类化合物：过氧麦角甾醇。到目前为止，并未发现关于过氧麦角甾醇在抑制甲型流感病毒介导的炎症反应方面的作用的报道。据已有的报道过氧麦角甾醇的药理作用包括具有抗肿瘤，抗炎等活性。本发明首次从南板蓝根中分离获得过氧麦角甾醇以及首次将南板蓝根中分离得的过氧麦角甾醇应用于流感感染疾病的治疗。技术实现要素：本发明提供过氧麦角甾醇在制备用于预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用，从而为现在临床上流感的预防和治疗提供一种有效的药物。进一步的，过氧麦角甾醇在制备能抑制甲型流感病毒介导的炎症反应的药物中应用。过氧麦角甾醇具有如下就结构式：进一步的，所述过氧麦角甾醇可以通过商业渠道购买获得，也可以通过从天然产物中提取分离制得。作为一种具体实施方式，过氧麦角甾醇可以从板蓝根中分离获得，优选的，所述板蓝根为南板蓝根。本发明还提供一种从板蓝根中分离过氧麦角甾醇的方法，包括如下步骤：S1：将板蓝根药材碎片用体积浓度为60～90％的乙醇水溶液加热回流提取，提取次数可以为一次或多次，将提取液浓缩成浸膏；S2：将浸膏用水溶解成混合液，用氯仿萃取混合液得水层和氯仿层，将氯仿层减压浓缩得氯仿层浸膏；萃取次数可以是1次或多次；S3：将氯仿层浸膏加入硅胶中，用乙酸乙酯-石油醚进行梯度洗脱收集含有过氧麦角甾醇的馏分并浓缩去除溶剂。还包括步骤S4，所述步骤S4为：将步骤S3中所得产物用水溶解，加入到反相C18柱中，用甲醇-水进行梯度洗脱，收集含有过氧麦角甾醇的馏分。作为一种具体实施方式，在步骤S3、S4进行洗脱时，均用TLC对洗脱液进行定性分析，根据TLC分析结果来收集所需馏分。作为一种具体实施方式，所述板蓝根为南板蓝根。作为一种优选方案，所述硅胶为正相硅胶。优选的，步骤S3中，乙酸乙酯-石油醚按照9∶1～5∶5的体积比进行梯度洗脱；更为优选的，乙酸乙酯-石油醚按照体积比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5五个梯度进行洗脱。优选的，步骤S4中，甲醇-水按照1∶9～6∶4的体积比进行梯度洗脱；更为优选的，甲醇-水按照体积比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4六个梯度进行洗脱。本发明还提供一种用于预防或治疗流感病毒感染的药物，该药物的活性成分包括过氧麦角甾醇。过氧麦角甾醇可作为唯一活性成分，也可和其他药用许可的物质组合。作为一种具体实施方式，该药物的剂型可以制成药学上可接受的任一种剂型，为制备所需的剂型，该药物可以加入药学上允许的辅料或载体。剂型例如为片剂、硬胶囊、软胶囊、注射液、颗粒剂、滴丸等剂型。所需的药学上可接受的载体或辅料，具体如药学上常用的稀释剂和吸收剂，例如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；药学上常用的湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；药学上常用的崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。关于药学上可接受的载体或辅料不再一一例举，本领域普通技术人员可根据所掌握的公知常识进行具体选择。作为一种具体实施方式，药物中的过氧麦角甾醇为从板蓝根中分离获得，优选的，所述板蓝根为南板蓝根。药物中的过氧麦角甾醇可以通过商业渠道购买获得，或者可按照上文所述的方法制得。本发明提供了小分子化合物过氧麦角甾醇在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用，从而为现在临床上流感的预防和治疗提供一种有效的药物。本申请发明人采用荧光实时定量PCR证实，过氧麦角甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1感染A549诱导对病原识别的模式识别受体RIG-I的过表达；过氧麦角甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1感染A549细胞诱导的炎症因子(IL-6，IP-10，IL-8，IFN-lambda，IFN-β，TNF-a)的过表达，呈剂量依赖关系；过氧麦角甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1感染A549细胞诱导凋亡因子TRAIL的异常表达。与现有药物比较，采用过氧麦角甾醇制备预防或治疗流感感染药物至少具有如下突出优势：1、过氧麦角甾醇能有效地抑制流感病毒诱导宿主细胞过表达病原识别的模式识别受体RIG-I；从而抑制模式识别受体下游信号转导介导的异常免疫炎症及介导细胞凋亡的作用。2、在优选方案的，过氧麦角甾醇分离源于传统的治疗流感中药板蓝根，无明显毒副作用。附图说明图1过氧麦角甾醇抑制流感诱导A549细胞过表达模式识别受体RIG-I；图2过氧麦角甾醇抑制流感诱导A549细胞炎症基因的异常表达；图3过氧麦角甾醇抑制流感感染诱导A549细胞表达凋亡因子TRAIL。具体实施方式为了更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。以下实施例中的过氧麦角甾醇可以通过商业渠道获得，也可以通过如下实施例一的方法制得。实施例一制备南板蓝根过氧麦角甾醇化合物步骤S1：提取将3Kg南板蓝根药材切成碎片，用80％(体积)的乙醇水溶液加热回流分别提取三次，每次乙醇的体积为30L、24L、18L，得到乙醇提取液，合并乙醇提取液，加热减压回收乙醇得总提取物浸膏。步骤S2：萃取将所得浸膏与水混合，并加热搅拌，采用1L的氯仿萃取所得混合液3次得到水层和氯仿层，随后采用1L乙酸乙酯萃取所得水层3次，得乙酸乙酯层和水层。分别合并氯仿层和乙酸乙酯层，并用加热减压回收溶剂得氯仿层浸膏和乙酸乙酯层浸膏。步骤S3：正相硅胶处理将所得的氯仿层浸膏加入硅胶中，采用体积比9∶1～5∶5的乙酸乙酯-石油醚进行梯度洗脱，本实施例中共进行了五个洗脱梯度，依次为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，每个洗脱梯度的洗脱量为2L。通过TLC分析显示确定分为了13个馏分，并用加热减压回收溶剂得13个固体残留物。步骤S4：反相C18处理将5号馏分与6号馏分混合后(1.8g)用水溶解并加入反相C18柱中，采用甲醇-水按照体积比1∶9～6∶4进行梯度洗脱，本实施例共有六个洗脱梯度，依次为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，每个洗脱梯度的洗脱量为1L，通过TLC显示，确定对应于过氧麦角甾醇的馏分，该馏分进行浓缩、干燥，得白色粉末(1.0mg)。经检测，其纯度是95％。对所得的白色粉末进行检测，其结构解析如下：1H-NMR谱显示了质子δ3.97(1H，M，H-3)，δ1.00(3H，D，J＝6.6Hz，H-21)，δ0.91(D，J＝7.2Hz，3H，H-28)，δ0.89(S，3H，H-19)，δ0.83(D，J＝6.6Hz，3H，H-26)，δ0.82(D，J＝7.2Hz，3H，H-26)，和δ0.82(S，3H，H-18)，这表明该化合物应该是甾醇。在1H-NMR谱中同时存在的两个双键特征信号：δ5.14(1H，dd，J＝15.6，7.8Hz，H-22)，δ5.23(1H，dd，J＝15.6，7.8H，H-23)，δ6.51(1H，d，J＝9.0Hz，H-6)，δ6.25(1H，d，J＝9.0Hz，H-7)，在HMBC中与碳δ132.3(C-23)，δ135.2(C-22)，δ135.39(C-6)，δ130.68(C-7)相关。在HMBC中两个亚甲基质子信号在δ1.94(1H，m，H-4a)和2.11(1H，m，H-4b)与两个碳的信号δ82.2(C-5)和135.4(C-6)的显著相关性提示该化合物存在5α，8α-epidioxy系统。同时亚甲基信号δ0.89(s，3H，H-19)与碳位移为δ82.2(C-5)远距离相关。质子δ1.94(1H，m，H-4a)和2.11(1H，m，H-4b)有相关性而与碳δ79.4(C-8)无相关性。此外，在5α，8α-epidioxy系统中烯烃质子δ6.25(1H，D，J＝9.0Hz，H-7)与碳δ51.1(C-9)和51.7(C-14)相关，而另一个烯烃质子δ6.51(1H，d，J＝9.0Hz，H-6)与碳δ37.0(C-4)和36.9(C-10)相关。经检测及结构解析，确定所得产物的所有数据均与过氧麦角甾醇的一致，其结构如下：实施例二过氧麦角甾醇对流感病毒感染诱导宿主表达模式识别受体RIG-I的影响1.实验材料：1.1药物受试样品过氧麦角甾醇(实施例一制备)，经HPLC检测其纯度为95％。1.2细胞和毒株A549细胞购自ATCC，保存于本实验室；甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)，保存于本实验室1.3试剂逆转录反应试剂盒(购自Takara公司；货号：RR036A)；实时定量PCR反应试剂盒(购自Takara公司；货号：RR390A)2.实验方法包括如下步骤：1)将A549细胞以5X106的细胞密度种至6孔板，放置于温度37℃、5％CO2的培养箱中；2)过夜培养细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤2次。然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1∶1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒；3)进行实验组设置，包括：正常组，病毒组，药物干预组和阳性药物奥司他韦对照组。用无血清的DMEM/DF12(1∶1)培养基稀释流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)并加至细胞中进行吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。其中药物干预组采用药物治疗模式，药物干预组加入不同浓度过氧麦角甾醇(PR8+过氧麦角甾醇(150μg/ml)、PR8+过氧麦角甾醇(300μg/ml))；病毒组不加药物进行干预；阳性药物奥司他韦药物对照组，加入300μg/ml的奥司他韦。4)继续培养24小时后，弃去6孔板中细胞培养上清后，冷PBS洗涤2遍，加入1mlTrizol(Lifetechnologies公司)并在室温下孵育5min；(可选：或转至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接进行提取)；5)后续按照如下步骤进行：①加入200ul氯仿，震荡15sec，于室温中孵育2-3min；置于4℃离心机中进行离心：13000rpmx15min；②离心毕，将上清转移至新的1.5EP管，加入500ul异丙醇；室温下孵育10min；置于4℃离心机中进行离心：12000rpmx10min；③离心毕，加入1ml75％乙醇洗涤一次，置于4℃离心机中进行离心：7500rpmx10min；④弃去上清，室温放置5-10min，加入无RNase水溶解RNA，立刻进行逆转录成cDNA。⑤分光光度计中测定总RNA的浓度(ng/μl)并计算总RNA的体积：拟加入逆转录反应体系中总RNA的量为1000ng，则计算所需总RNA的体积V＝1000/RNA浓度；⑥mRNA逆转录成cDNA，配置逆转录反应体系如下(试剂盒：TakaraRR036A)：试剂体积5xPrimeScriptRTMasterMix4ul总RNAVDH2O16-V体系总体积20ul⑦进行逆转录反应，反应条件如下：37℃15min85℃5Sec4℃∞收取样品进行后续定量PCR实验或保存于-20℃。⑧实时定量PCR反应试剂盒(货号：TakaraRR390A)配置反应体系如下：进行RealtimePCR反应条件(ABI7500)引物序列及探针序列如下：实验结果：实验结果参见图1，由图可知，过氧麦角甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1感染A549诱导对病原识别的模式识别受体RIG-I的过表达。实施例三过氧麦角甾醇对流感病毒感染诱导宿主表达炎症基因的影响1.实验材料：1.1药物受试样品过氧麦角甾醇(实施例一制备)。1.2细胞和毒株A549细胞购自ATCC，保存于本实验室；甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)，保存于本实验室。1.3试剂逆转录反应试剂盒(购自Takara公司；货号：RR036A)；实时定量PCR反应试剂盒(购自Takara公司；货号：RR390A)2.实验方法，包括如下步骤：1)将A549细胞以5X106的细胞密度种至6孔板，放置于温度37℃，5％CO2的培养箱中；2)过夜培养细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤2次。然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1∶1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒；3)进行实验组设置，包括：正常组，病毒组，药物干预组和阳性药物奥司他韦对照组。用无血清的DMEM/DF12(1∶1)培养基稀释流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)加至细胞中进行吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。其中药物干预组采用药物治疗模式，药物干预组加入不同浓度过氧麦角甾醇(PR8+过氧麦角甾醇(150μg/ml)、PR8+过氧麦角甾醇(300μg/ml))；病毒组不加药物进行干预。阳性药物奥司他韦药物对照组，加入300μg/ml的奥司他韦。4)继续培养24小时后，弃去6孔板中细胞培养上清后，冷PBS洗涤2遍，加入1mlTrizol(Lifetechnologies公司)并在室温下孵育5min；(可选：或转至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接进行提取)；后续进行的细胞总RNA提取、mRNA逆转录成eDNA、及实时定量PCR反应均参照实施例二的相应步骤进行，不再赘述；其中，本实施例在实时定量PCR反应中引物序列及探针序列如下：3.实验结果结果如图2显示，流感A/PR8/3/4(H1N1)感染A549细胞进行药物过氧麦角甾醇干预后，明显抑制流感诱导的炎症因子IL-6、IL-8、IP-10、IFN-beta、IFN-lambdal、TNF-a的基因水平的表达。实施例四.过氧麦角甾醇对流感病毒感染诱导宿主凋亡基因TRAIL的表达影响1.实验材料：1.1药物受试样品过氧麦角甾醇(实施例一制备)1.2细胞和毒株A549细胞购自ATCC，保存于本实验室；甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)，保存于本实验室。1.3试剂逆转录反应试剂盒(购自Takara公司；货号：RR036A)；实时定量PCR反应试剂盒(购自Takara公司；货号：RR390A)2.实验方法按照如下步骤：1)将A549细胞以5X106的细胞密度种至6孔板，放置于温度37℃，5％CO2的培养箱中；2)过夜培养细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤2次。然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1∶1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒；3)进行实验组设置，包括：正常组，病毒组，药物干预组和阳性药物奥司他韦对照组。用无血清的DMEM/DF12(1∶1)培养基稀释流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)加至细胞中进行吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。其中药物干预组采用药物治疗模式，药物组干预组加入不同浓度过氧麦角甾醇(PR8+过氧麦角甾醇(150μg/ml)、PR8+过氧麦角甾醇(300μg/ml))；病毒组不加药物进行干预。阳性药物奥司他韦药物对照组，加入300μg/ml的奥司他韦。4)继续培养24小时后，弃去6孔板中细胞培养上清后，冷PBS洗涤2遍，加入1mlTrizol(Lifetechnologies公司)并在室温下孵育5min；(可选：或转至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接进行提取)；后续的细胞总RNA提取、mRNA逆转录成cDNA、及实时定量PCR反应均参照实施例二的相应步骤进行，不再赘述；其中，本实施例在实时定量PCR反应中所用的凋亡因子TRAIL引物序列及探针序列如下：3.实验结果结果如图3所示，南板蓝根过氧麦角甾醇干预后明显抑制流感病毒诱导的凋亡因子TRAIL的基因表达水平，并呈剂量依赖关系。以上实验结果表面，过氧麦角甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1感染A549诱导对病原识别的模式识别受体RIG-I的过表达；过氧麦角甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1感染A549细胞诱导的炎症因子(IL-6，IP-10，IL-8，IFN-lambda，IFN-β，TNF-a)的过表达，呈剂量依赖关系；过氧麦角甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1感染A549细胞诱导凋亡因子TRAIL的异常表达。过氧麦角甾醇可应用于制备预防或治疗流感病毒感染的药物，从而为现在临床上流感的预防和治疗提供一种有效的药物。与现有药物比较，采用过氧麦角甾醇制备预防或治疗流感感染药物至少具有如下突出优势：过氧麦角甾醇能有效地抑制流感病毒诱导宿主细胞过表达病原识别的模式识别受体RIG-I；从而抑制模式识别受体下游信号转导介导的异常免疫炎症及介导细胞凋亡的作用。文中未特别说明，均为本领域普通技术人员根据其掌握的公知常识或常规技术手段所能理解或知晓的，对此不再一一赘述。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。当前第1页1 2 3