一种复合菌群协同降解秸秆纤维素和发酵产氢的联合预处理方法与流程

本发明属于固体废弃物处理技术领域，特别涉及一种将废弃物秸秆先进行联合预处理，然后复合菌群协同降解纤维素和在厌氧发酵条件下，生物制氢的方法。

背景技术：

秸秆是一类分布广泛，储量巨大的木质纤维素原料，也是一种丰富而廉价的可再生资源。但目前因缺乏对其有效利用而造成了资源的巨大浪费，通常采用焚烧的处理方式也易造成严重的环境污染。利用以玉米秸秆为代表的木质纤维素原料生物转化制取清洁、高效、安全的新能源-氢气，已逐渐成为人们研究的热点，并已引起国内外的高度重视，具有十分深远的经济价值和战略意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提出一种通过氢氧化钠和酸化汽爆的联合预处理方法对秸秆进行联合预处理，然后复合菌群协同降解秸秆纤维素和在厌氧发酵条件下，生物制氢的方法。采用本发明的方法，可提高产氢率和秸秆降解率，实现大量秸秆的资源化和能源化的同时制取清洁、高效、安全的新能源-氢气。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种复合菌群协同降解秸秆纤维素和发酵产氢的联合预处理方法，包括如下步骤：

1)秸秆联合预处理：将秸秆粉碎成秸秆粉，先经NaOH溶液预处理，再经酸化汽爆预处理，得到联合预处理秸秆粉。

2)厌氧发酵生物产氢：将间歇发酵产氢试验装置除氧灭菌，再将联合预处理秸秆粉溶于水中，得到秸秆纤维素基质，置于振荡器上，复合菌群以5-10％的比例接种，密封容器，在37～40℃，震荡强度为90～130rpm条件下，进行培养和发酵产氢，发酵48h，收集产生的气体。

上述的方法，优选的，所述的秸秆粉粒径为30～60目。

上述的方法，优选的，所述的经NaOH溶液预处理是：按固液比1:10-15，取秸秆粉和NaOH溶液，室温浸泡20-25h后，水洗至中性；所述的NaOH溶液的质量百分浓度为0.5％-2.0％。更优选的，固液比为1:10，NaOH溶液的质量百分浓度为1.0％。

上述的方法，优选的，所述的经酸化汽爆预处理是：按固液比1:10-15，取经NaOH溶液预处理后的秸秆粉和硫酸水溶液置于容器中，混匀，所述的硫酸水溶液的体积百分浓度为1-1.5％；将容器密封，置于高压锅内进行汽爆，汽爆完成后，进行降温、降压，冷却至室温后，用水冲洗至中性，烘干，得到联合预处理秸秆粉。更优选的，固液比为1:10，硫酸水溶液的体积百分浓度为1％。更优选的，汽爆条件为：将容器密封，置于高压锅内，于120-125℃，压力0.15-0.20MPa下，汽爆2-3h；汽爆完成后，高压锅温度降至90-95℃时，降压，冷却至室温，水洗至中性，80℃下烘干，得到联合预处理秸秆粉。

上述的方法，优选的，所述的步骤2)中，将联合预处理秸秆粉溶于水中，得浓度为10-20g/L的秸秆纤维素基质，按接种量6％接种复合菌群。

上述的方法，所述的复合菌群是菌株X9和菌株B2按1:1的混合。所述的菌株X9的NCBI注册号为EU434651；所述的菌株B2的NCBI注册号为EU639425。

本发明具有以下有益效果：

将秸秆经氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理后，复合菌群协同降解联合预处理后的秸秆产氢能力较强，其产氢率和秸秆降解率都有明显提高，而没有经过预处理或只经过一项预处理的秸秆中纤维素的结晶度高，木质素与细胞多糖之间紧密的物理化学结合，限制了复合菌群纤维素降解酶与细胞壁多糖的接触，导致秸秆的降解和发酵产氢过程比较缓慢，并且产氢率和降解率都很低。

本发明的方法对产氢率和秸秆降解率有非常明显的提升作用。该方法为采用生物方法制备清洁、高效、安全的新能源-氢气提供了一种新的预处理方法，为进一步实现大量秸秆资源化、能源化提供了可能性。

附图说明

图1为玉米秸秆经氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理前后电镜对比图；

图中，a为预处理前，b为预处理后。

图2为一种间歇发酵产氢试验装置示意图。

图中，1.血清瓶；2.空气浴振荡器；3.气阀；4.水槽；5.量筒；6.导管。

图3-1为氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理对秸秆发酵产氢能力的影响。

图3-2为不同浓度的H₂SO₄预处理对秸秆发酵产氢能力的影响。

图3-3为不同浓度的NaOH预处理对秸秆发酵产氢能力的影响。

图3-4为不同浓度的NH₃·H₂O预处理对秸秆发酵产氢能力的影响。

图4-1为复合菌群协同降解预处理玉米秸秆还原糖量的变化。

图4-2为复合菌群协同降解预处理玉米秸秆生物量的变化。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。由于各地玉米秸秆品种和成分不同，预处理参数也会产生相应变化，因此在不违背本发明的实质和权利要求范围的前提下，可对本发明中关键参数做适当调整。

实施例1复合菌群协同降解秸秆纤维素和发酵产氢的联合预处理方法

方法如下：

1)玉米秸秆粉碎

玉米秸秆取自沈阳市郊区。将玉米秸秆切成3～5cm的小段，然后利用微型植物粉碎机将这些小段粉碎成30～60目的粉末，得秸秆粉。

2)玉米秸秆联合预处理

按固液比1:10(g/ml)，取秸秆粉和质量百分浓度为1.0％的NaOH溶液，室温浸泡24h后，水洗至中性，于80℃下烘干。

按固液比1:10(g/ml)，取经NaOH溶液预处理后的秸秆粉和体积百分浓度为1％的硫酸水溶液，置于容器中，混匀。将容器密封，置于高压锅内，于121℃，压力0.15MPa下，汽爆2h；汽爆完成后，高压锅温度降至90℃时，降压，取出后冷却至室温，水洗至中性，80℃烘干，得到经氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理玉米秸秆粉(ESCS)。

3)厌氧发酵生物产氢

如图2所示，为一种间歇发酵产氢试验装置：血清瓶1作为反应器置于空气浴振荡器2上，水槽4内装水，量筒5的开口端插入水中，导管6一端与血清瓶1连通，另一端与量筒5连通。

将联合预处理玉米秸秆粉ESCS置于血清瓶1中，加水混匀，得浓度为15g/L的玉米秸秆纤维素基质，对血清瓶及秸秆粉高温高压灭菌，并用高纯氮(99.9％)吹脱10min以驱除血清瓶中的气相和液相中的氧，按6％接种量，加入复合菌群(菌株X9和菌株B2按1:1(v/v)的混合。所述的菌株X9的NCBI注册号为EU434651；所述的菌株B2的NCBI注册号为EU639425)，用橡胶塞密封容器，打开气阀3，于37℃，震荡强度为100rpm下，震荡培养48h，产生的气体经导管充入量筒中，收集产生的气体。

实施例2预处理方法的对比实验

方法步骤同实施例1，只是改变步骤2)中预处理方法。采用如图2所示的装置，不同的血清瓶1中所采用的预处理秸秆基质不同。具体为：

A：实施例1中，采用氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理的联合预处理玉米秸秆粉(ESCS)。

B：硫酸预处理：分别配制体积百分浓度为0.2％、0.5％、1.0％的H₂SO₄溶液，固液比为1:10，室温浸泡24h；处理后的玉米秸秆用水冲洗至中性，然后于80℃烘干，得单独硫酸预处理的预处理玉米秸秆粉。

C：氢氧化钠预处理：分别配制质量百分浓度为0.5％、1.0％、2.0％的NaOH溶液，固液比为1:10，室温浸泡24h；处理后的玉米秸秆用水冲洗至中性，然后于80℃烘干，得单独氢氧化钠预处理的预处理玉米秸秆粉。

D：氨水预处理：分别配制体积百分浓度为2.0％、5.0％、10.0％的氨水溶液，固液比为1:10，室温浸泡24h；处理后的玉米秸秆用水冲洗至中性，然后于80℃烘干，得单独氨水预处理的预处理玉米秸秆粉。

结果如下：

如图1所示，玉米秸秆经氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理前后电镜对比图。由图中可以看出植物细胞的细胞壁被破坏腐蚀，木质素与细胞多糖之间紧密的物理化学结合打开，木质素对纤维素、半纤维素的包裹有效解离，纤维素更多地暴露于物料表面，纤维素结晶度降低，比表面积增大，细胞内物质融出。

如图3-1所示，玉米秸秆经氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理条件下，与复合菌群协同作用，降解玉米秸秆产氢的能力较强，其产氢率和玉米秸秆降解率分别达到8.6mmol/g和72％。

如图3-2所示，玉米秸秆经H₂SO₄(0.5％w/v)预处理条件下，与复合菌群协同作用，其产氢率和玉米秸秆降解率分别达到7.8mmol/g和65％。

如图3-3所示，玉米秸秆经NH₃·H₂O(5.0％w/v)预处理条件下，与复合菌群协同作用，其产氢率和玉米秸秆降解率分别达到3.8mmol/g和33％。

如图3-4所示，玉米秸秆经NaOH(1.0％w/v)预处理条件下，与复合菌群协同作用，其产氢率和玉米秸秆降解率分别达到2.8mmol/g和26％。

由图3-1至图3-4所示，对比四种预处理方法，结果表明，经氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理是最佳的玉米秸秆预处理方法。而没有经过联合预处理的玉米秸秆中纤维素的结晶度高，木质素与细胞多糖之间紧密的物理化学结合，限制了复合菌群纤维素降解酶与细胞壁多糖的接触，导致玉米秸秆的降解和发酵产氢过程比较缓慢，并且产氢率和降解率都很低，从结果中看出，不经过预处理的玉米秸秆的产氢率和降解率分别只有1.1mmol/g和8.8％。

如图4-1所示，无论采用哪种预处理方法，发酵产氢体系中还原糖基本没有积累的过程，都是从原有预处理后的还原糖水平随着发酵产氢时间的推移而迅速减少。在12h以后体系中基本检测不到还原糖；这表明在发酵产氢体系中伴随着降解玉米秸秆产生的还原糖，这部分还原糖马上被复合菌群菌株X₉和B₂利用进行菌体生长合成代谢和产能代谢，从而反映出整个过程中基本没有出现还原糖的积累。

如图4-2所示，经氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理和H₂SO₄(0.5％w/v)预处理条件下，40h时，细胞浓度分别达到0.61g/L和0.53g/L，之后逐步趋于稳定；经NaOH(1.0％w/v)和NH₃·H₂O(5.0％w/v)预处理条件下，其在40h时细胞浓度分别达到0.33g/L和0.34g/L，之后逐步趋于稳定。

表1为四种预处理玉米秸秆纤维素高效厌氧发酵生物产氢反应体系中，主要液相代谢末端产物的组成和pH值。

表1

如表1所示，四种预处理玉米秸秆纤维素高效厌氧发酵生物产氢反应体系中，主要液相代谢末端产物的组成和pH值。一般来说，随着细菌生物量的增长和代谢活性的提高会促进细菌对底物的降解利用率，从而使得发酵液体系中的液相末端产物的酸化率会相应的提高，pH值会相应的降低。两者之间存在一定的正相关性。

结合图3-1至图3-4、图4-1至图4-2和表1可知，复合菌群在利用氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理的玉米秸秆纤维素高效厌氧发酵生物产氢过程中，VFAs总量为2652mg/L，pH为4.3。这些指标都明显优于其他三种预处理方法，这也说明氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理是最佳的预处理方法，有利于提高复合菌群协同降解玉米秸秆纤维素的厌氧发酵生物产氢的能力。

复合菌群协同降解经过预处理的玉米秸秆纤维素发酵产氢的能力较未经预处理时要高，预处理方法对玉米秸秆经过的改性和提高发酵产氢的能力均有一定程度的影响，所以进行玉米秸秆预处理对提高复合菌群纤维素降解率和产氢能力都是十分必要的，其中复合菌群利用氢氧化钠和酸化汽爆联合预处理玉米秸秆的产氢能力最高，H₂SO₄预处理次之，NaOH和NH₃·H₂O预处理相对较低。

实施例3复合菌株的筛选

所采用菌种取自实验室连续流搅拌槽式厌氧发酵产氢反应器CSTR(ZL92114474.1)中的活性污泥。经过分离、纯化得到产氢细菌125株，对产氢能力较强的七株产氢细菌B2、B19、H7、X9、X12、C3和C17的产氢能力和发酵末端产物进行气相色谱分析。根据光学显微镜观察和末端产物气相色谱分析，将分离到的产氢细菌分为二类，第一类是乙醇型发酵产氢菌株B2、B19和H7等；第二类是丁酸型发酵产氢细菌X9、X12、C3和C17等。对以上七种产氢细菌进行复合菌群的筛选。

1)产氢细菌的分离和筛选(初筛)

方法同实施例1，只是将步骤3)中的复合菌群替换为如表2所示的单一的菌株，接种量为6％，结果如表2。表2为细菌发酵末端主要产物组成和产氢量。

表2

如表2所示，产氢细菌B2、B19和H7表现出相似的发酵末端产物，主要为乙醇和乙酸，其乙醇和乙酸的含量占总末端产物含量的90％以上，高比例的乙醇和乙酸的含量体现了发酵产氢菌种显著的乙醇型发酵特征。同时三株菌的产氢量也均达到5000～6000ml/L，表现出良好的发酵产氢能力。可以初步判定B2、B19和H7都是典型的乙醇型发酵产氢细菌；产氢细菌X9、X12、C3和C17四株菌具有相似的发酵末端产物，主要为丁酸和乙酸，其丁酸和乙酸的含量占总末端产物含量的90％以上，三株菌的产氢量达到2000～3500ml/L，末端发酵产物中含量较高的丁酸和乙酸含量说明X9、X12和H17都是典型的丁酸型发酵产氢细菌。

2)降解纤维素产氢细菌的分离和筛选(复筛)

以微晶纤维素(MCC)和羧甲基纤维素钠(CMC)为复筛培养基，经过分离、筛选和纯化成功地分离获得了三株具有同时降解纤维素和发酵产氢的产氢细菌纯种X9、X12和C17。结果如表3，表3为细菌发酵末端主要产物组成和产氢量。

表3

如表3所示，对筛选得到的三株降解纤维素产氢细菌X9、X12和C17利用MCC发酵产氢的能力和发酵末端产物气相色谱分析可以看出，三株细菌利用纤维素发酵产氢的产氢量可以达到1000～1700ml/L，具有较高的降解纤维素发酵产氢能力。同时产氢细菌X9、X12和C17三株菌的发酵末端产物都主要为丁酸和乙酸，其总末端产物含量在3500～5000mg/L。其中由于菌株X9具有较高的纤维素降解产氢能力，表现出良好的生长和产氢特性，因此选择菌株X9。

3)复合菌群复配优化

采用结构相对简单和单一的微晶纤维素(即MCC，12g/L)和羧甲基纤维素钠(即CMC，5g/L)作为发酵产氢底物，将几类纯菌株相互混合进行复配，选择性状和代谢稳定的复合菌群再继续继代培养。培养过程中如降解纤维素产氢能力下降，则淘汰或继续复配。将经半年以上连续继代培养，选择仍保持较高降解纤维素产氢能力的复合菌群作为进一步试验的供试菌种(种子)。结果如表4，表4为加入的几种菌群以及它们的产氢率和降解率。由表4可见以菌株X9和B2为组合的复合菌群，其产氢率和降解率最佳。

表4

4)优化实验

本试验以MCC(12g/L，100ml)为发酵产氢底物，以产氢率为衡量指标，考察复合菌群X9+B2不同的接种量和接种比例对其生长情况和发酵产氢的能力的影响(见表5)。从而确定复合菌群最佳的接种量和接种比例。表5为复配组合优化试验。

表5

当复合菌群的接种量为8ml(8％)和接种比例为1：1的时候，产氢率达到9.8mmol/g；当复合菌群的接种量为6ml(6％)和接种比例也为1：1的时候，其产氢率可达到9.6mmol/g，这时接种比例没有变化，但接种量减少了25％，但此时的产氢率却仅降低了2％；当接种量低于6％时，菌株生长增殖缓慢，培养时间长，产酶活力和产氢能力不高；而接种量超过6％时，再加大接种量对酶活基本没有什么影响，也没有明显提高产氢能力。所以并不是接种量越大，产酶能力越强，产氢率越高，不能简单的通过增加接种量来提高酶活、生物量和产氢率。另外，考虑到工业化应用成本等问题，当菌株X9和B2的接种量为6ml(6％)和接种比例也为1：1时，已经达到较为理想的产氢效果。

另外，在不同的复配方案中，随着复合菌群中菌株X9接种量的增加其产氢能力提高较为显著，说明菌株X9是“主导菌株”；而菌株B2随着在复合菌群中接种量的增加其产氢能力的提高不是很明显，说明菌株B2是“辅助菌株”。同时，复合菌群主要利用纤维素酶解糖化和利用酶解糖化液发酵产氢两个生物代谢有效的协同作用达到高效降解纤维素发酵产氢的目的，在这个意义上说，复合菌群中的菌株X9和B2又是相对的“同等重要”。

由以上分析，复合菌群的接种量为6ml(6％)和接种比例为1：1是较合适的复配组合方式，此时复合菌群可以获得较高产氢能力。