本发明涉及一株乳酸乳球菌及其在活菌型绿豆汁发酵饮料中的应用。
技术背景
豆汁是北京久负盛名的传统风味小吃，它色泽灰绿、豆汁浓醇、味酸且微甜，并含有丰富的蛋白质、维生素C、粗纤维和糖，并有去暑、清热、健脾、开胃、去毒、除燥等功效，一直深受人们的喜爱。但是传统豆汁实际上是制作绿豆淀粉的副产物，它用浸泡后的绿豆加水研磨后，倒入大缸内发酵，取上层漂浮者加热灭菌并用小火保温，随吃随盛，由于加热处理，豆汁中益生菌含量很低，而且这样的制作方法不是使用人工接种纯种发酵，对环境条件和经验技术要求很高，使得传统豆汁里菌群不稳定，有致病菌污染的风险，存在食品安全隐患；并且由于淀粉沉淀时间和发酵耗时较长，使其生产周期漫长。
本发明提供一株乳酸乳球菌，该乳酸乳球菌能够在豆汁发酵的过程中起到关键作用。它能够在豆汁发酵过程中快速生长并且产酸，简化了发酵工艺，适合国内厂家现有的条件进行生产，缩短生产周期；通过纯菌发酵豆汁，不仅大大提高了豆汁的安全系数和营养价值，乳酸菌代谢产生的香味物质还会提升豆汁的风味。
技术实现要素：
：
本发明的目的就是针对自然发酵豆汁没有可利用的菌种，无法人工接种发酵；而普通的乳酸菌营养要求严格，在绿豆淀粉上清液基质中生长缓慢、产酸能力弱，制约了以绿豆淀粉上清液为主要基质的乳酸菌纯菌发酵饮品的开发这一问题，提供一株乳酸乳球菌，该乳酸乳球菌能够在绿豆淀粉上清液基质中快速生长、产酸。
本发明的另一目的在于，以筛选到的乳酸乳球菌作为发酵菌株，发酵生产绿豆汁发酵饮料，提供“绿豆汁发酵饮料”生产方法。该方法生产的绿豆汁发酵饮料产品更加安全，食用前不用加热灭菌，发酵条件容易控制，生产周期短，营养丰富，口感风味适宜，并保留了绿豆的天然清香味道，是一种营养价值丰富的功能性饮料。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一株乳酸菌，该乳酸菌为Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，已于2016年 7 月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12795 。
所述的乳酸乳球菌菌株的个体形态特征：大小为0.5µm～0.7µm，球状，菌体排列成链，革兰氏阳性，无芽孢。菌落形态特征：菌落大小在0.5mm～1mm，乳白色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑。生理生化特征为：耐氧菌，过氧化氢酶阴性，不能运动，硫化氢、硝酸盐还原、明胶实验阴性，代谢葡萄糖产酸不产气，能代谢果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、山梨醇、鼠李糖、松三糖、蜜二糖、纤维二糖产酸，不能利用棉籽糖、阿拉伯糖。
该菌株的16 S rDNA 序列全长共 1466 bp，经Genbank比对与Lactobacillus lactis subsp.Lavtis相似性达到99.8%；结合个体形态、群体形态特征及生理生化试验结果，将该菌鉴定为Lactobacillus lactis subsp.Lavtis ，并命名为Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003。
该菌株从老北京豆汁中分离获得，经测定其可以在绿豆淀粉上清液基质中快速生长且产酸能力强，能够在豆汁发酵过程中快速生长并产酸。
本发明提供利用Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003发酵生产豆汁发酵饮料的方法，以下原料按重量份数取：
绿豆汁发酵饮料的原料重量份数组成：绿豆淀粉上清液100份，蔗糖0.4份，葡萄糖4份，Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003种子发酵液5份。
具体为：接种环挑取一环斜面保藏的乳酸菌于5mL种子培养基中，30℃下发酵24h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中30℃下发酵24h，获得Lavtis Lactobacillus lactis subsp.LLY003种子发酵液。
种子培养基配方：酵母膏5g、葡萄糖20g、蔗糖2g、绿豆淀粉上清液1000mL。
绿豆淀粉上清液：将新鲜绿豆浸泡（秋冬季11-13h,春夏季5-7h），以豆水比1:15的比例打浆30s，过100目筛子。将淀粉乳混匀，加入5-10份绿豆酸浆，混匀后静置5min，取上清液100份，调pH至7.0。
取绿豆淀粉上淀粉清液100份，加热煮沸，加入蔗糖0.4份，葡萄糖4份，使其完全溶解，灌装后100℃灭菌30min，冷却至30℃，接入Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003种子发酵液5份，于30℃下发酵8h，发酵结束后，在4℃中冷藏，即得绿豆汁发酵饮料。
本发明所用材料性能及使用后所产生的效果：
本发明提供的Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003可以在绿豆淀粉上清液基质中快速生长且产酸能力强，能够在豆汁发酵过程中快速生长并产酸。与传统发酵的豆汁相比具有的优点见表1。由表1可以看出用Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003发酵豆汁具有如下优点：
优点一：Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003纯种发酵绿豆汁仅需要8h即可完成发酵，与自然发酵所需的21h相比，显著地缩短了发酵时间。
优点二：Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003纯种发酵绿豆汁规避了自然发酵存在致病菌污染的风险，可以直接饮用，不需要发酵后煮沸灭菌，简化了产品的加工流程，提高了产品的食用安全性。
优点三：Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003纯种发酵豆汁中Lavtis Lactobacillus lactis subsp.LLY003数量为5.3×1011cfu/mL；自然发酵豆汁中乳酸菌数量在1.3×106 cfu/mL, LLY003纯种发酵豆汁中乳酸菌数量明显高于自然发酵豆汁中乳酸菌数量，提高了豆汁对人体的益生性能。
优点四：利用Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003纯种发酵豆汁产品质量稳定，避免了因自然发酵受环境条件及人为操作等因素的制约造成产品质量不稳定。同时，人工接种发酵易于工业化控制，使其更好地进行工业化生产。
具体实施方式
实施例1
豆汁发酵菌的分离、筛选与鉴定
1 培养基配方
1.1 分离培养基：酵母膏5g、K2HPO42g、葡萄糖20g、乳糖2g、醋酸钠5g、琼脂粉15g、绿豆淀粉上清液1000mL。调pH至6.8，121℃灭菌20min。
绿豆淀粉上清液：将新鲜绿豆浸泡（秋冬季11-13h,春夏季5-7h），以豆水比1:15的比例打浆30s，过100目筛子。将淀粉乳混匀，加入5-10份绿豆酸浆，混匀后静置5min，取上清液100份，调pH至7.0。
绿豆酸浆的制备：5kg甘薯和1kg绿豆（浸泡24小时）加18 kg水打浆，过滤后，放在阴凉处，不加盖，在常温下自然培养，直至浆液达到青白色，有少量水沫，并微酸为止(pH＜5)。
种子培养基配方：酵母膏5g、葡萄糖20g、蔗糖2g、绿豆淀粉上清液1000mL。
种子斜面培养基配方：酵母膏5g、葡萄糖20g、蔗糖2g、琼脂粉15g、绿豆淀粉上清液1000mL。
1.4 绿豆淀粉上清液培养基：葡萄糖20g、蔗糖2g、绿豆淀粉上清液1000mL。
2 样品：分别从三家北京豆汁店购买的豆汁（未经煮制的生豆汁），放入冰袋中，采集当天分离。
3 乳酸检测方法
高效液相色谱法检测发酵液中乳酸含量。色谱柱：Kro-masil C18 柱（5μm, 4.6×250 mm）；流动相：3%甲醇，97%的磷酸二氢钾，调整pH为2.98作为流动相，流速0.4mL/min，进样量10微升，检测波长210 nm，柱温25℃。
4 豆汁发酵菌的分离
4.1 样品的稀释
用无菌吸管吸取自然发酵豆汁25mL，移入盛有225mL无菌生理盐水带玻璃珠的三角瓶中，充分振摇20min，即为10-1的样品稀释液。用无菌生理盐水对10-1的样品稀释液进行梯度稀释至10-8。
4.2平板分离培养
取上述10-6、10-7、10-8稀释度的稀释液各1mL分别注入无菌培养皿中，每个稀释度做三个重复。以无菌操作按20-30g/L的量将灭菌的CaCO3加入熔化了的分离培养基中，冷却至40℃左右，边冷却边摇晃将瓶内CaCO3摇匀的同时，立刻倒入培养皿内摇匀，使样品稀释液和CaCO3均匀分布于培养基中。待培养基凝固后，倒置于30℃温箱中培养24h～48h。
4.3 平板接种培养
用接种环挑取菌落周围产生CaCO3溶解圈的菌落，划线接种于分离培养基平板中，30℃培养24h，反复纯化3代，得到单菌落接种于种子斜面培养基上，30℃培养24h。共计分离到132株有碳酸钙溶解圈的纯菌株。
5 菌株筛选
5.1 初筛
取上述132个斜面培养物各1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜观察个体形态，同时挑取1环培养物与载玻片上的3%H2O2混匀，观察产气泡情况。 筛选出革兰氏染色阳性过氧化氢酶阴性的菌株接种于种子斜面培养基。
5.2 复筛
将初筛获得的疑似乳酸菌菌株活化后接入种子培养基中，30℃培养，以发酵液的乳酸含量和感官评定为指标，筛选出一株在绿豆淀粉上清液培养基中经8h发酵，发酵液乳酸含量达18g/L的快速产酸的、发酵风味好的乳酸菌LLY003。
6 菌种鉴定
6.1乳酸菌LLY003的形态特征观察
将乳酸菌LLY003在种子斜面培养基中30℃下培养24h，然后进行革兰氏染色，其个体形态特征见表2。
乳酸乳球菌LLY003在种子斜面培养基平板上，30℃下培养24h，观察菌落大小、形态和颜色，结果见表3。
6.2 乳酸菌LLY003的生理生化特征
根据常规生理生化鉴定，结果见表4，参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步判断菌株LLY003为乳球菌属。
表4菌株生理生化特性
6.3 乳酸菌LLY003的16S rDNA序列分析结果
该菌株的16 S rDNA 序列全长共1466 bp，经Genbank比对相似性达到99.8%；
经初筛、复筛最终得到1株能够在绿豆淀粉上清液培养基中生长并快速产酸的菌株，通过菌体的群体形态观察、个体形态观察、生理生化试验结果及菌株的16 S rDNA 序列比对，确定该菌株为乳酸乳球菌，命名为Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No. 12795 。
实施例2
Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003在豆汁发酵饮料中的应用
1 实验材料
实验用的菌株为本发明分离筛选到的Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，培养基配方同实施例1，食品原料选择新鲜绿豆、葡萄糖、蔗糖、纯净水。
2 种子发酵液的制备
乳酸菌种子发酵液制备方法：用接种环挑取一环斜面保藏的乳酸菌于5mL种子培养基中，30℃下发酵24h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中30℃下发酵24h，获得Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003种子发酵液。
3 发酵生产豆汁发酵饮料的方法
绿豆淀粉上清液100份，蔗糖0.4份，葡萄糖4份，Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003种子发酵液5份。
将新鲜绿豆浸泡（秋冬季11-13h,春夏季5-7h），以豆水比1:15的比例打浆30s，过100目筛子。将淀粉乳混匀，加入5-10份绿豆酸浆（制备方法同实施例1），混匀后静置5min，取上清液100份，调pH至7.0，加热煮沸后，蔗糖0.4份，葡萄糖4份，使其完全溶解，灌装后100℃灭菌30min，冷却至30℃，接入乳酸菌LLY003的种子发酵液5份，于30℃下发酵8h，发酵结束后，在4℃中冷藏，即得绿豆汁发酵饮料。
4 产品的感官评定
本试验感官评定在食品实验室内完成，邀请7 位人员组成评定小组，先明确本试验的目的和意义以及感官评定的指标和注意事项。为了减少从测定到形成概念之间的许多因素，如嗜好与偏爱、经验等对检验结果的影响，采用随机双盲法进行检验。豆汁发酵饮料感官评分标准详见表5，豆汁发酵饮料和传统发酵豆汁感官评分对比见表6。
5、大肠菌群检测
参照GB 47893-2010《 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》，检测大肠菌群（MPN/100ml）为0，符合国家标准要求。
本发明提供从自然发酵豆汁中筛选出的一株Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，该菌营养要求简单，适宜在仅添加碳源的绿豆淀粉上清液中生长，能够在豆汁发酵的过程中起到关键作用。也能够在豆汁发酵过程中快速生长并且产酸，简化了发酵工艺，适合国内厂家现有的条件进行生产，缩短生产周期；通过纯菌发酵豆汁，不仅大大提高了豆汁的安全系数和营养价值，而且乳酸菌代谢产生的香味物质还会提升豆汁的风味，本发明产品保留了绿豆的自然清新香味，是一种营养价值丰富的功能饮料。
SEQUENCE LISTING
<110> 锦州医科大学
<120> 一株乳酸乳球菌
<130> 在绿豆汁发酵饮料中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1466
<212> DNA
<213> 一株乳酸乳球菌Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003
<400> 1
ggaagcgccc tccttgcggt taggcaacct acttcgggta ctcccaactc ccgtggtgtg 60
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