本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不依赖介质直接转化外源DNA进入里氏木霉休眠孢子的方法。
背景技术：
里氏木霉是一种真核微生物，属于丝状真菌。里氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对里氏木霉的遗传改造研究，其可作为表达外源蛋白的宿主。但是对里氏木霉转化外源DNA非常困难，制约了其发展。
基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建DNA分子，然后导入细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品（比如将某个具有重要经济价值的酶基因，导入到里氏木霉细胞内，做酶蛋白高表达，生产该酶）。这一领域中，很重要的一个环节，就是把外来的DNA，导入到细胞内部。针对不同物种和不同状态的细胞，需要不同的导入方法，才可以让外来的DNA跨过细胞壁和细胞膜，运送到细胞内部。
目前用于丝状真菌领域（包括里氏木霉）的主要DNA转化方法包括：
1．原生质体介导转化（protoplast-mediated transformation）：该方法使用各种酶水解真菌菌丝体的细胞壁，暴露出细胞膜，在一定的化学条件下，细胞膜可以吸收外源DNA。但是由于真菌细胞壁的结构和成分复杂，而且不同物种、甚至同一物种的不同亚种的细胞壁结构和成分都不一样，因此，无法统一原生质体制备的方法，而且，很多真菌，尤其是里氏木霉，原生质体制备非常困难，步骤极其繁琐，而且需要特殊的、昂贵的细胞壁水解酶。
2.根瘤农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性菌，能够侵染植物愈伤组织和丝状真菌，将能在细胞中稳定遗传的环状质粒Ti-DNA插入到宿主的基因组中。但是该方法步骤很繁琐，耗时长，而且农杆菌对宿主有选择性，并非所有真菌都适合用这种方法。此外，外源DNA插入宿主基因组的位置是随机的，无法预判。外源DNA只能插入宿主基因组，不能够游离地存活在宿主的细胞质中。
3．基因枪转化法（Biolistic Transformation）：该方法将DNA吸附在特种金属颗粒的表面，用火药爆炸或者高压气体加速，将吸附了DNA的金属颗粒直接送入完整的组织或者细胞。这种方法需要非常昂贵的特殊实验设备，而且所用的金属颗粒耗材常常需要使用黄金材料。此外，该方法转化效率并不高，而且宿主细胞在金属颗粒轰击下死亡率高，再生较困难，因此其使用范围受到限制。
4，电击转化（Electroporation）：这是一种用电脉冲短暂作用于接触了外源DNA的细胞，使外源DNA进入细胞，从而使细胞遗传特性发生改变的方法。与农杆菌法需要农杆菌作为介质、基因枪法需要金属颗粒作为介质不同，这种方法不需要介质来携带外源DNA。传统的电击法，包括指数衰减波电击和方波电击。指数衰减波电击的能量特别大，对细胞的损伤也很大，而微生物细胞由于结构简单，有细胞壁，细胞抗逆性强，生命力强，而且很多微生物细胞的外壳坚硬，能够耐受大能量电击，因此指数衰减波电击一般仅用于微生物细胞。而哺乳动物细胞（比如人类细胞系），相对微生物而言，比较脆弱，容易死亡，因此，方波电击常用于哺乳动物细胞。此外，方波电击还广泛应用于小动物（如小鼠）的活体电转化。
2013年面世的HDEN电转化技术（high-density distributed electrode network），是一种专门针对哺乳动物细胞的特性，而开发的电转化技术，其开发目的是为了提高向哺乳动物细胞内传送外源DNA和药物的效率。该技术包含3大部分内容，一是施加于细胞样品的电波形式，二是细胞样品在电击时的溶液环境，三是细胞样品的培养方法和电击前预处理方法。由于该技术是专门针对哺乳动物细胞开发的，因此，上述3大部分内容，都是针对哺乳动物细胞的特性而设计。
在本领域内众所周知，微生物细胞的特性和培养方法，与哺乳动物细胞相比，千差万别。哺乳动物细胞和微生物细胞的结构不同，哺乳动物细胞没有细胞壁，微生物细胞（比如绝大部分真菌、包括里氏木霉）有细胞壁。哺乳动物细胞的细胞膜和微生物的细胞膜也不一样。
因此，任何应用于哺乳动物细胞的技术，都很难直接应用于微生物细胞。现有文献报道了HDEN技术在HEK-293A，Hela，Neuro-2A，MCF-7，C2C12，3T3-L1，CHO，MDCK，HL-60，HUVEC，A375，U251等哺乳动物细胞中的应用。目前尚未有该技术在哺乳动物细胞以外的物种中应用的案例报道。因此，HDEN电转化技术能不能应用于哺乳动物细胞以外的物种，也是一个未知数。
丝状真菌（包括里氏木霉）是一类真核微生物，很多类型的真菌的基因组是多倍体。对生命个体做基因工程改造时，最困难的就是面对多倍体现象。因为对多倍体的改造，常常效率低下（比如基因打靶可能只命中一条染色体，而脱靶另外一条或几条同源染色体），而且多倍体在分裂繁殖时，同源染色体分离，也很难把改造位点遗传给所有子代。这在本领域内众所周知。
真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠状态且可以生存很长时间。孢子在适宜的外界条件下，能够苏醒并萌发，形成菌丝而进行分裂繁殖。最为重要的是，很多类型真菌的孢子，是天然的单倍体，直接对单倍体孢子进行基因工程改造，效率远远高于操作多倍体。
但是，由于孢子一般处于休眠状态，其细胞壁非常厚实，休眠孢子的细胞壁、细胞膜的状态，与萌发孢子、与菌丝体是不同的。且休眠孢子细胞内的生命活动也处于最不旺盛的状态，因此，本领域公知，休眠孢子的细胞通透性不如萌发孢子和菌丝，休眠孢子几乎不与外界交流物质，闭关锁国，一般处于睡眠状态。而萌发孢子或菌丝体，需要从外界吸收各种营养分子供给生命活动，因此细胞壁和细胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常难以将外源DNA分子直接导入到睡眠孢子的内部。
现有的几大成熟技术中：原生质体转化法，作为宿主细胞的原生质体的来源，一般是真菌的菌丝体（多倍体）。农杆菌介导转化法，在农杆菌介导下，把农杆菌和真菌孢子在固体培养基表面共培养数天，可以把外源DNA导入真菌细胞。但是这种做法并非是直接对孢子进行转化，因为在共培养过程中，真菌孢子会萌发，然后农杆菌侵袭萌发孢子，才能导入外源DNA。而且农杆菌法，需要农杆菌作为介导的介质，需要先做一个农杆菌转化，才能做后续的真菌转化，因此操作非常复杂和繁琐，且周期长。
传统的电击转化法（使用的是指数衰减波电击），宿主细胞采用的是萌发的真菌孢子。例如Ozeki等创立的针对真菌孢子的电击方法，必须要让孢子萌发后，才能电击转化（该方法披露了让孢子萌发的具体实验步骤和细节）。该方法是行业内首创的经典技术，目前为止无显著改进，一直被本领域人员沿用至今。本申请发明人也尝试过用该方法转化未萌发孢子，没有成功，目前，也没有任何成功的文献报道。Ozeki等创立的方法见文献1：OZEKI K, KYOYA F, HIZUME K, KANDA A, HAMACHI M, NUNOKAWA Y. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1994, 58(12): 2224-2227.
目前，尚未有任何方法、任何报道，可以做到直接把外源DNA分子在无介质介导的情况下，导入休眠的（未萌发）真菌孢子内部。这也是本行业内一直没有攻克的技术难题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种不依赖介质直接转化外源DNA进入里氏木霉休眠孢子的方法，该方法绕过真菌孢子萌发这个步骤，采用HDEN电转化技术，直接用休眠的孢子，来导入外源DNA。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种不依赖介质直接转化外源DNA进入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步骤：
1）里氏木霉培养和孢子收集
在固体琼脂培养基表面接种里氏木霉，培养至培养基表面长满里氏木霉孢子，洗下培养基表面的里氏木霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；
2）里氏木霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3-4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为104—1011个/ml的里氏木霉孢子悬液；
所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0-9.5；
3）使用HDEN法电击里氏木霉孢子
在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的里氏木霉孢子悬液以及待转化质粒，混匀，得到孢子与质粒混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部，通电，使得孢子与质粒混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
所述里氏木霉悬液与待转化质粒的比例为：6-600000μl的里氏木霉孢子悬液：0.1-10000μg的待转化质粒；
所述电击参数如下：电压1—6000V，脉宽2-2000000ms，重复1-100次，每次间隔5-50000ms。
进一步，所述步骤1）的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基，优选为PDA培养基的效果最好，产孢子最快最多。
所述步骤1，）里氏木霉的培养条件为：温度16-40℃，湿度15-85%，培养3-15日。
优选的，所述步骤1），里氏木霉的培养条件为：温度24℃，湿度50-60%，培养7日。
进一步，所述步骤2），电击缓冲液由终浓度为1-10mmol/L的HEPES和终浓度为50-100mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为5.0-7.0；
优选的，所述步骤2），电击缓冲液由终浓度为1mmol/L的HEPES和终浓度为50mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为7.0。
所述步骤2）的里氏木霉孢子悬液在电击前，于显微镜下观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染并且孢子均未萌发，然后再进行电击。
进一步，所述步骤3），待转化质粒为重组质粒AnEp8-hygro， 所述重组质粒AnEp8-hygro由潮霉素B抗性基因和AnEp8质粒构建而成，所述电击采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪。
优选的，里氏木霉悬液与重组质粒AnEp8-hygro的比例为：60μl的里氏木霉孢子悬液：1μg的重组质粒 AnEp8-hygro。
进一步，所述步骤3），电压300-3000V，脉宽200-1000000ms，重复1-50次，每次间隔500-5000ms；优选为：电压600V，脉宽2000ms，重复3次，每次间隔500ms。
进一步，为了验证外源DNA已导入里氏木霉休眠孢子，所述步骤3），电击、再次冰浴后还包括如下步骤：将孢子和质粒混合物吸出，涂布在含有终浓度为400μg/ml的潮霉素B的YPD固体琼脂培养基平板上，于温度16-40℃，湿度15-85%下培养（优选为温度28℃，湿度50-60%下培养），直至形成单菌落，并进行菌落计数。
所述潮霉素B（hygromycin B，CAS编号：31282-04-9）用灭菌高纯水溶解，制备高浓度母液，使用前，按照浓度比例添加到培养基中。
在进行上述实验步骤的同时，需要制备对照组：将未电击的、相同的“孢子和质粒混合物”，涂布在另外一块含有400μg/ml的潮霉素B的YPD固体琼脂培养基平板上，相同条件下培养。当此对照组不形成单菌落时，可判断实验组的单菌落为阳性克隆。
当实验组形成单菌落后，提取实验组单菌落的DNA，使用PCR扩增DNA中可能含有的外源潮霉素B抗性基因，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳判断条带大小，当条带大小符合预期后，使用Sanger DNA测序法，确定其DNA序列是否与外源潮霉素B抗性基因吻合。如果吻合，则可以准确判断阳性克隆是成功的转化子。
本发明所述里氏木霉为里氏木霉CICC 13052，所述电击采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪，购买自苏州壹达生物公司。
本发明收集未萌发的孢子，以及后续的电转实验过程，若无特殊说明，实验操作均在不高于23摄氏度的恒温实验室中操作，离心步骤均为4℃冷冻离心，接触未萌发孢子的各种液体均事先在冰上预冷。未萌发孢子严禁接触到任何含有可促使其萌发的因素和物质（比如以YEPD等为代表的萌发培养基），以保证孢子的休眠状态。
本发明里氏木霉培养过程，当里氏木霉表面长满孢子（可通过颜色和形态来判断）后，向培养基表面倒入无菌水，洗下培养基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸（或者砂芯漏斗、滤纸等）过滤，去除菌丝，保留孢子，如果没有过滤步骤，那么孢子悬液中会混杂有菌丝，后续步骤得到的转化子，无法判断究竟是由孢子转化DNA后形成的阳性克隆，还是菌丝转化DNA后形成的假阳性。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
本发明制备固体琼脂培养基的水应该是MillQ级别的分子生物学用高纯水或双蒸水，水的电阻率不低于18.2MΩ-cm。
使用HDEN法电击里氏木霉孢子时，在细胞培养板的孔中加入适当比例的里氏木霉孢子悬液以及待转化质粒，混合匀匀，将容器置于冰上进行冰浴。例如在96孔细胞培养板的孔中（NUNC公司的Nunclon Surface 96孔细胞培养板，货号Cat.No.167008），加入60μl的里氏木霉孢子悬液，及1μg重组质粒AnEp8-hygro。所述细胞培养板也可以是384孔板、24孔板、6孔板、或者其它更大、更小的容器，然后按照容器体积大小比例，放大或缩小孢子和质粒混合物体系。
本发明采用以上技术方案，用未萌发的孢子来作为导入外源分子的起始材料，非常简便，因为可以省去做孢子萌发这一复杂的步骤，更重要的是，萌发的孢子，可能已经产生了多倍体，而未萌发的孢子，可以保证是单倍体，很多基因工程的应用，要求宿主细胞必须是单倍体，才能达到预想的结果或者效率。同时，本发明应用HDEN电转化技术将外源DNA导入里氏木霉休眠孢子。HDEN电转化技术采用了高密度矩阵式电极，它能产生高度均匀且强度足够的电场，电场内每个细胞接受电击的条件几乎完全一致，操作时，只要把细胞放在通用容器中，比如细胞培养板，再把带有矩阵式电极的电击头插入容器中，通电即可。而传统的电转技术一般是使用专用电击杯，在两块平行放置的金属板之间放置细胞，并对金属板加电，形成电场电击。因此，二者的放电方式完全不同，前者的电极插入细胞悬液内部，在内部产生电场，而后者是在细胞悬液整体的外部产生电场；前者的电极头由许多金属针组成，在针与针之间产生电压，而后者只有两块金属板，一块正极，一块负极，在二者之间产生电压。HDEN技术还基本消除了传统电击技术的阴极效应，避免产生大量氢氧根离子，避免杀伤细胞，提高电击后的细胞存活率。而传统电击技术很难消除阴极效应。另外，传统的电击方法一般只电击1次，因为传统电击方法如果电击多次，那么细胞死亡率会大大增加，而本发明的HDEN法可以电击多次，可以叠加多次电击的效果，并且不会大幅度地增加细胞死亡率。
HDEN电转化技术是一种专门针对哺乳动物细胞的特性而开发的电转化技术，其开发目的是为了提高向哺乳动物细胞内传送外源DNA和药物的效率。而在本领域内众所周知，微生物细胞的特性和培养方法，与哺乳动物细胞相比，千差万别。哺乳动物细胞和微生物细胞的结构不同，哺乳动物细胞没有细胞壁，微生物细胞（比如绝大部分真菌、包括里氏木霉）有细胞壁。哺乳动物细胞的细胞膜和微生物的细胞膜也不一样。即便是同一种生物，它的不同组织、不同器官或不同的细胞类型，各自的细胞膜、细胞壁的结构、状态、化学成分，也都不一样。哪怕是同一种生物的同样的组织、同样的器官、同样的细胞类型，在不同的生长发育阶段，或者在不同的外界环境中，各自的细胞膜、细胞壁的结构、状态、化学成分，也都不一样。而细胞壁和细胞膜，是阻挡外源分子进入细胞的屏障，屏障不同（结构不同，化学成分不同），决定了突破屏障的方法也是不同的。此外，不同的外源分子，因为具有不同的结构、分子量、体积和化学成分，面对相同的屏障时，不同外源分子突破屏障的方法也是不一样的。如果面对不同的屏障，那么不同外源分子突破不同屏障的方法和机制，更是千差万别了。
因此，任何应用于哺乳动物细胞的技术，都很难直接应用于微生物细胞。目前尚未有HDEN技术在哺乳动物细胞以外的物种中应用的案例报道。本发明针对里氏木霉细胞的特性，采用HDEN技术将外源DNA导入里氏木霉休眠孢子，该方法确定了细胞样品的培养方法和电击前预处理方法，细胞样品在电击时的溶液环境，以及施加于细胞样品的电波形式。采用本发明方法非常简便快速，直接使用野生孢子作为原材料，无需对孢子进行感受态制备处理，无需用各种繁琐的方法（如酶水解法）去除孢子的细胞壁，只要把野生孢子洗干净，再重悬于电击缓冲液即可，步骤最简便。传统方法中的原生质体法，需要特殊的细胞壁水解酶，需要复杂的制备和再生原生质体的步骤；传统的电击法，需要先把孢子萌发处理，待其萌发后才可以电击转化，而且转化率低;传统的农杆菌法，需要先做农杆菌转化，才能做后续的里氏木霉转化；传统的基因枪法，需要昂贵的耗材，且转化率低。
本发明方法转化率高，每个转化反应体系，至少可以达到不少于6000个阳性转化子的效果，例如实施例1用的AnEp8-hygro质粒体积是12.4 kb，用1μg 质粒（约124.26 fmol 个质粒分子），电击6×106个里氏木霉未萌发的休眠孢子，能产生不少于8000个阳性转化子。
众所周知，质粒的体积和转化率成反比，体积越大的质粒，越不容易穿过细胞壁和细胞膜，本发明所用的12.4kb的质粒属于超大型质粒，现有文献报道的里氏木霉转化（原生质体转化，电转化）用的质粒体积大部分都在8kb以下。
目前本领域有多种关于转化率高低的描述方法，包括：多少μg质粒能产生多少个阳性转化子；多少个质粒（摩尔数，DNA分子个数）能产生多少个阳性转化子；多少个宿主细胞能产生多少个阳性转化子，等等。本专利披露了宿主细胞个数，质粒的质量，质粒的分子个数，质粒的分子量等等各种指标，无论如何评价、用什么方式评价一个转化体系的转化率高低，都可以使用本专利披露的这些指标进行计算和换算。
附图说明
图1为实施例1使用PCR扩增验证样品中是否含有潮霉素抗性基因的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。
实验过程的所有操作均要遵循微生物实验的无菌操作原则，器皿、耗材、试剂均要灭菌处理。
实施例1
一种不依赖介质直接转化外源DNA进入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步骤：
1）里氏木霉培养和孢子收集
在15cm培养皿中，制备固体琼脂培养基（PDA培养基），在固体琼脂培养基表面接种里氏木霉CICC 13052，温度24℃，湿度50-60%，培养7日，让培养基表面长满里氏木霉孢子。
向培养基表面倒入无菌水，洗下（震荡，或者用光滑的无菌玻璃涂布棒轻轻刮蹭）培养基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸（或者砂芯漏斗、滤纸等）过滤，去除菌丝，保留孢子，滤过的液体装入离心管，离心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液体。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
2）里氏木霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子沉淀（加入电击缓冲液的体积应能填充满离心管），再离心，收集孢子沉淀，去除上清液体。重复上述步骤两次后，再次将孢子重悬于电击缓冲液中，显微镜观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染，以及确认孢子均未萌发。最后一次将孢子重悬于电击缓冲液时，应控制好电击缓冲液的体积，保持里氏木霉孢子悬液中孢子浓度为108个/ml。
所述电击缓冲液由终浓度为1mmol/L的HEPES和终浓度为50mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为7.0。
3）使用HDEN法电击里氏木霉孢子
在96孔细胞培养板的孔中加入60μl的里氏木霉孢子悬液，及1μg重组质粒AnEp8-hygro，混匀，得到孢子与质粒混合物，将容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部，通电，使得孢子与质粒混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
本实施例电击参数如下：电压600V，脉宽2000ms，重复3次，每次间隔500ms。
4）验证实验
将上述吸出的孢子和质粒混合物，涂布在含有终浓度为400μg/ml的潮霉素B的YPD固体琼脂培养基平板上，于温度28℃，湿度50-60%下培养，直至形成单菌落，并进行菌落计数，计算转化率。
在进行上述实验步骤的同时，需要制备对照组：将未电击的、相同的“孢子和质粒混合物”，涂布在另外一块含有400μg/ml的潮霉素B的YPD固体琼脂培养基平板上，相同条件下培养。对照组不形成单菌落时，因此判断实验组的单菌落为阳性克隆。
当实验组形成单菌落后，提取实验组单菌落的DNA，使用PCR扩增DNA中可能含有的外源潮霉素B抗性基因，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳判断条带大小，电泳结果如图1所示，电泳泳动方向为从下向上，Marker为takara 250bp DNA ladder marker，泳道1是阴性对照，泳道2在1kb左右可见清晰的条带，该条带与潮霉素B抗性基因条带一致，说明转化成功，即泳道2是被扩增的潮霉素B抗性基因条带。然后使用Sanger DNA测序法，结果显示其DNA序列与外源潮霉素B抗性基因吻合，因此可以准确判断本实施例的阳性克隆是成功的转化子。
本实施例AnEp8-hygro质粒体积是12.4 kb，用1μg 质粒（约124.26 fmol 个质粒分子），电击6×106个里氏木霉未萌发的休眠孢子，产生了不少于8000个阳性转化子。
本实施例的重组质粒AnEp8-hygro由潮霉素B抗性基因和AnEp8质粒构建而成，重组质粒AnEp8-hygro的构建方法如下：
潮霉素B抗性基因如SEQ ID NO.1所示。
所编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
使用下述引物，PCR扩增上述潮霉素B抗性基因：
F：CATTAGCTAGCATGAAAAAGCCTGAACTCACCG
R：TCTGGCGCGCCCTATTCCTTTGCCCTCGG
PCR体系（50μL）：模板3μL，引物F（10μM）2μL，引物R（10μM）2μL，2X Taq PCR mix 25μL ，ddH2O补至50μL。
PCR程序：94℃10min，（94℃30s，61.8℃30s，72℃90s）X 35个循环，72℃10min
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测无误后，使用Thermo GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit回收PCR产物。
AnEp8质粒由美国FGSC菌种中心赠送，AnEp8质粒的公开见文献2： STORMS R, ZHENG Y, LI H, SILLAOTS S, MARTINEZ-PEREZ A, TSANG A. Plasmid vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger [J]. Plasmid, 2005, 53(3): 191-204.
使用文献2中的AnEp8质粒。AnEp8质粒序列如SEQ ID NO.3所示。AnEp8质粒使用上海生工质粒提取试剂盒提取，将AnEp8质粒和纯化后的潮霉素B抗性基因PCR产物都用Fermentas公司Fastdigest系列限制性内切酶Nhe 1和Asc 1内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后（使用Thermo GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit回收），用T4 DNA连接酶（Fermentas公司产品），将潮霉素B基因和AnEp8质粒连接，上述酶切和连接操作均严格按照厂家说明书进行。之后再转化大肠杆菌，构建重组质粒Anep8-hygro。重组质粒Anep8-hygro用Sanger测序法测序验证、以及双酶切验证无误后，大量培养大肠杆菌，用Qiagen公司的质粒提取试剂盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit）提取重组质粒（按照厂家说明书操作）。
实施例2
一种不依赖介质直接转化外源DNA进入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步骤：
1）里氏木霉培养和孢子收集
在15cm培养皿中，制备固体琼脂培养基（YPD培养基），在固体琼脂培养基表面接种里氏木霉CICC 13052，在温度16℃，湿度15-50%下，培养15日，让培养基表面长满里氏木霉孢子。
向培养基表面倒入无菌水，洗下（震荡，或者用光滑的无菌玻璃涂布棒轻轻刮蹭）培养基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸（或者砂芯漏斗、滤纸等）过滤，去除菌丝，保留孢子，滤过的液体装入离心管，离心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液体。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
2）里氏木霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子沉淀（加入电击缓冲液的体积应能填充满离心管），再离心，收集孢子沉淀，去除上清液体。重复上述步骤两次后，再次将孢子重悬于电击缓冲液中，显微镜观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染，以及确认孢子均未萌发。最后一次将孢子重悬于电击缓冲液时，应控制好电击缓冲液的体积，保持里氏木霉孢子悬液中孢子浓度为1011个/ml。
所述电击缓冲液由终浓度为0.01mmol/L的HEPES和终浓度为0.5mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0。
3）使用HDEN法电击里氏木霉孢子
在96孔细胞培养板的孔中加入6μl的里氏木霉孢子悬液，及0.1μg重组质粒AnEp8-hygro，混匀，得到孢子与质粒混合物，将容器置于冰上冰浴15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部，通电，使得孢子与质粒混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴15min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
本实施例电击参数如下：电压1V，脉宽2000000ms，重复100次，每次间隔5ms。
4）验证实验
将上述吸出的孢子和质粒混合物，涂布在含有终浓度为400μg/ml的潮霉素B的YPD固体琼脂培养基平板上，于温度16℃，湿度15-50%下培养，直至形成单菌落，并进行菌落计数，计算转化率。
同样的，在进行上述实验步骤的同时，需要制备对照组（同实施例1）。
当实验组形成单菌落后，提取实验组单菌落的DNA，按照实施例1的方法验证本实施例的阳性克隆是成功的转化子。
本实施例AnEp8-hygro质粒体积是12.4 kb，用0.1μg 质粒（约 12.426 fmol 个质粒分子），电击6×108个里氏木霉未萌发的休眠孢子，产生了不少于6000个阳性转化子。
本实施例的重组质粒AnEp8-hygro的构建方法同实施例1 。
实施例3
一种不依赖介质直接转化外源DNA进入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步骤：
1）里氏木霉培养和孢子收集
在15cm培养皿中，制备固体琼脂培养基（PDA培养基），在固体琼脂培养基表面接种里氏木霉CICC 13052，在温度40℃，湿度60-85%下，培养3日，让培养基表面长满里氏木霉孢子。
向培养基表面倒入无菌水，洗下（震荡，或者用光滑的无菌玻璃涂布棒轻轻刮蹭）培养基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸（或者砂芯漏斗、滤纸等）过滤，去除菌丝，保留孢子，滤过的液体装入离心管，离心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液体。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
2）里氏木霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子沉淀（加入电击缓冲液的体积应能填充满离心管），再离心，收集孢子沉淀，去除上清液体。重复上述步骤两次后，再次将孢子重悬于电击缓冲液中，显微镜观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染，以及确认孢子均未萌发。最后一次将孢子重悬于电击缓冲液时，应控制好电击缓冲液的体积，保持里氏木霉孢子悬液中孢子浓度为104个/ml。
所述电击缓冲液由终浓度为100mmol/L的HEPES和终浓度为5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为7.0。
3）使用HDEN法电击里氏木霉孢子
在96孔细胞培养板的孔中加入600000μl的里氏木霉孢子悬液，及10000μg重组质粒AnEp8-hygro，混匀，得到孢子与质粒混合物，将容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部，通电，使得孢子与质粒混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
本实施例电击参数如下：电压6000V，脉宽2ms，重复1次，间隔50000ms。
4）验证实验
将上述吸出的孢子和质粒混合物，涂布在含有终浓度为400μg/ml的潮霉素B的YPD固体琼脂培养基平板上，于温度40℃，湿度60-85%下培养，直至形成单菌落，并进行菌落计数，计算转化率。
同样的，在进行上述实验步骤的同时，需要制备对照组（同实施例1）。
当实验组形成单菌落后，提取实验组单菌落的DNA，按照实施例1的方法验证本实施例的阳性克隆是成功的转化子。
本实施例AnEp8-hygro质粒体积是12.4 kb，用10000μg 质粒（约1242600 fmol 个质粒分子），电击6×106个里氏木霉未萌发的休眠孢子，产生不少于 7000个阳性转化子。
本实施例的重组质粒AnEp8-hygro的构建方法同实施例1 。
实施例4
本实施例电击参数为：电压30V，脉宽1000000ms，电击50次，间隔5000ms，其它同实施例1，产生了不少于6500个阳性转化子。
实施例5
本实施例电击参数为：电压3000V，脉宽100ms，电击5次，间隔25000ms，其它同实施例1，产生了不少于7200个阳性转化子。
本发明提供的将外源DNA导入里氏木霉休眠孢子的方式，可以在里氏木霉孢子休眠状态下导入任一质粒，不仅限于重组质粒AnEp8-hygro。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 不依赖介质直接转化外源DNA进入里氏木霉休眠孢子的方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
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<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile
1 5 10 15
Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu
20 25 30
Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr
50 55 60
Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln
85 90 95
Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu
100 105 110
Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser
115 120 125
Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr
130 135 140
Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr
145 150 155 160
His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln
165 170 175
Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg
180 185 190
His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn
195 200 205
Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp
210 215 220
Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala
225 230 235 240
Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu
245 250 255
Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp
260 265 270
Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp
275 280 285
Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val
290 295 300
Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg
325 330 335
Pro Arg Ala Lys Glu
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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gctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 120
ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 180
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cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga 300
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cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc 540
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gtatcaatct cccttgcacg atgttggttg tcactcaccg acactccgtc accaagatca 780
ctattaaaac aagagtgagt tcaaggttgc gatcaagata gcgattgcgc agcaacggca 840
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